用于治疗硬皮病的抗ccl2抗体的制作方法

用于治疗硬皮病的抗ccl2抗体的制作方法
【专利摘要】本发明尤其提供特征在于高亲和力、效力、组织选择性和/或表位特异性的经改良抗CCL2抗体，和其尤其用于治疗硬皮病和相关纤维化和/或发炎性疾病、病症和病况的用途。在一些实施例中，本发明提供基于亲和力为10-12M或更大的抗CCL2抗体治疗硬皮病和相关纤维化和/或发炎性疾病、病症和病况的方法和组合物。
【专利说明】用于治疗硬皮病的抗CCL2抗体
[0001] 相关申请案的夺叉引用
[0002] 本申请案依据35USC§ 119(e)要求2012年5月22日提交的美国临时专利申请 案第61/650, 149号的权益，所述申请案特此以全文引用的方式并入本文中。
[0003] 序列表
[0004] 本说明书提及2013年5月22日以电子形式作为命名为"2006685-0330_ Sequences_ST25"的ASCII,txt文档提交的序列表。所述.txt文档是在2013年5月14日 生成的且大小是2KB。

【技术领域】
[0005] 无

【背景技术】
[0006] 全身性硬化症（硬皮病）是临床上异质性结缔组织病症，引起皮肤的硬化和绷紧。 其是特征在于免疫活化、血管损伤和纤维化的自身免疫型疾病。涉及肺、心、肾和胃肠道的 基于主要器官的并发症可促进死亡率和发病率。发病机制是未知的。
[0007] 与硬皮病最常有关的特征是纤维化（胶原蛋白在皮肤和器官中积聚）。胶原蛋 白的积聚促成病症的症状，包括脱发、皮肤硬化和绷紧、皮肤变色、关节疼痛、手指和关节僵 硬、消化道问题和呼吸并发症（干咳、呼吸短促、喘息）。硬皮病可归类成两个主要子组：局 限性皮肤硬皮病和弥漫性皮肤硬皮病。在局限性皮肤硬皮病中，纤维化主要限制于手、臂和 面部。弥漫性皮肤硬皮病是一种快速进行性病症，其影响大面积的皮肤并损害一或多个内 脏。患有局限性皮肤硬皮病的患者与患有弥漫性皮肤硬皮病的患者相比具有相对更好的长 期预后。广泛的全身性硬皮病可损伤心、肾、肺或胃肠道，这可引起死亡。肺纤维化是患有 硬皮病的患者死亡的最常见原因。
[0008] 因此，硬皮病是极度致衰弱的疾病，有着潜在的致命后果。在美国约有50, 000名 患者。女性患者与男性患者的比率是约4:1。当前治疗方法仅基于对在整个疾病过程产生 的并发症的对症治疗和管理（例如皮质类固醇、NSAID和免疫抑制药物（如甲氨蝶呤和环 磷氮介））。没有疗法展示出会逆转或停止疾病进展。因此，对于硬皮病的有效疗法存在高 度未满足的医学需求。


【发明内容】

[0009] 本发明具体是基于经改良抗体或结合蛋白提供用于有效治疗硬皮病的经改良方 法和组合物，所述经改良抗体或结合蛋白可以高亲和力、效力和/或表位多样性特异性地 结合于C-C趋化因子配体-2 ("CCL2")，从而实现稳固的生物分布和/或组织特异性。已知 CCL2是硬皮病的经验证目标。数项研宄已展示，硬皮病成纤维细胞呈现出CCL2mRNA和蛋白 的组成型表达增加。在硬皮病皮肤切片中，CCL2的表达在成纤维细胞、角质细胞和单核细胞 中被检测到，而其在正常皮肤中是不可检测的（加林多（Galindo)等人，关节炎与风湿病 (ArthritisRheum. )2001 年6月；44(6) :1382-6 ;迪斯特勒（Distler)等人，关节炎与风湿 病 2001 年 11 月；44 (11) :2665-78 ;利奥伊德（Lioyd)等人，实验医学（ExpMed. ) 1997 年 4 月 7 日；185 (7) :1371-80 ;山本（Yamamoto)等人，皮肤病科学杂志（JDermatolSci. )2001 年 6 月；26 (2) :133-9;登顿（Denton)等人；免疫学趋势（TrendsImmunol. )2005 年 11 月； 26(11):596-602. 2005年9月15日电子出版）。然而，在本发明之前，尚未发展出基于抗 CCL2抗体的针对硬皮病的有效疗法。本发明人观察到，血浆中的高水平CCL2螯合静脉内注 射的抗CCL2抗体，引起对患病组织中CCL2的低效靶向。为了解决这一问题，本发明人想到 使用具有高亲和力的抗CCL2抗体，以足以胜过高水平血清CCL2的量投与，引起对所需患病 组织中CCL2的有效靶向。具体来说，本发明人想到"同类之最的"抗CCL2单克隆抗体，其 特征在于高结合亲和力、组织选择性、表位特异性和/或长半衰期。所述本发明抗体一旦被 体内投与就会引起所需生物分布和生物可用性，使得其结合并阻断目标组织中的CCL2信 号传导，除了硬皮病的其它症状或特征以外还减少浸润、炎症和纤维化。
[0010] 因此，在一个方面中，本发明提供治疗硬皮病的方法，其包含向罹患或易患硬皮病 的个体投与有效量的抗CCL2抗体或其片段，使得目标组织中硬皮病的至少一种症状或特 征的强度、严重度或频率降低或具有延迟的发作。
[0011] 在一些实施例中，硬皮病的至少一种症状或特征是选自内皮细胞损伤、基底膜层 增生、血管周围单核细胞浸润、纤维化、内脏器官架构紊乱、血管稀疏、缺氧和其组合。
[0012] 在一些实施例中，目标组织是选自由以下组成的群组：皮肤、血管、肺、心、肾、胃肠 道（包括肝）、肌肉骨胳系统以及其组合。在一些实施例中，目标组织是肺。在一些实施例 中，目标组织是心。
[0013] 在一些实施例中，个体罹患或易患局限性皮肤硬皮病。在一些实施例中，个体罹患 或易患弥漫性皮肤硬皮病。
[0014] 在一些实施例中，抗CCL2抗体或其片段是肠胃外投与的。在一些实施例中，肠胃 外投与是选自静脉内、皮内、吸入、经皮（表面）、皮下和/或经粘膜投与。在一些实施例中， 肠胃外投与是静脉内投与。
[0015] 在一些实施例中，抗CCL2抗体或其片段是口服投与的。
[0016] 在一些实施例中，抗CCL2抗体或其片段是两月一次、每月一次、三周一次、两周一 次、每周一次、每天一次或以可变的时间间隔投与的。
[0017] 在另一方面中，本发明提供如本文中所述的抗CCL2抗体或其片段的用途，其用于 制造供治疗硬皮病用的药物，其中治疗包含向罹患或易患硬皮病的个体投与有效量的抗 CCL2抗体或其片段，使得目标组织中硬皮病的至少一种症状或特征的强度、严重度或频率 降低或具有延迟的发作。
[0018] 在一些实施例中，本发明提供抗CCL2抗体或其片段的用途，其用于制造如本文中 所述的供治疗硬皮病用的药物，其中抗CCL2抗体或其片段的特征在于结合亲和力强于和/ 或大于KT12M(例如大于 0? 5XKT12M、1(T13M、0. 5XKT13M、1(T14M、0. 5XKT14M或I(T15M)。
[0019] 在一些实施例中，根据本发明的抗CCL2抗体或其片段是选自由以下组成的群组： 完整IgG、F(ab'）2、F(ab) 2、Fab'、Fab、scFvs、双功能抗体、三功能抗体和四功能抗体。
[0020] 在一些实施例中，抗CCL2抗体或其片段是单克隆抗体，任选地，抗CCL2抗体或其 片段是人类化单克隆抗体，任选地，抗CCL2抗体或其片段是人类抗体。
[0021] 在另一方面中，本发明提供治疗硬皮病的方法，其包含向罹患或易患硬皮病的个 体投与抗CCL2抗体或其片段，所述抗CCL2抗体或其片段的结合亲和力强于和/或大于 KT12M(例如大于 0? 5XKT12M、1(T13M、0. 5XKT13M、1(T14M、0. 5XKT14M或I(T15M)。
[0022] 在一些实施例中，抗CCL2抗体或其片段以治疗有效剂量和一定的投与时间间隔 投与，使得抗CCL2抗体或其片段分布到一或多种选自由以下组成的群组的目标组织：皮 肤、血管、肺、心、肾、胃肠道（包括肝）、肌肉骨胳系统以及其组合。在一些实施例中，抗CCL2 抗体或其片段以治疗有效剂量和一定的投与时间间隔投与，使得抗CCL2抗体或其片段分 布到肺和/或心。
[0023] 在一些实施例中，投与时间间隔是选自两月一次、每月一次、三周一次、两周一次、 每周一次、每天一次或可变的时间间隔。
[0024] 在另一方面中，本发明提供治疗硬皮病的方法，其包含以治疗有效剂量和一定的 投与时间间隔向罹患或易患硬皮病的个体投与抗CCL2抗体或其片段，使得抗CCL2抗体或 其片段分布到肺和/或心。在一些实施例中，抗CCL2抗体或其片段进一步分布到皮肤、肾 和/或肝。
[0025] 在另一方面中，本发明提供如以上各种实施例中公开的方法，其中抗CCL2抗体或 其片段是选自由以下组成的群组：完整IgG、F(ab'）2、F(ab)2、Fab'、Fab、scFvs、双功能抗 体、三功能抗体和四功能抗体。
[0026] 在一些实施例中，抗CCL2抗体或其片段是单克隆抗体。在一些实施例中，抗CCL2 抗体或其片段是人类化单克隆抗体。在一些实施例中，抗CCL2抗体或其片段是人类抗体。
[0027] 本发明尤其提供具有高亲和力的抗CCL2抗体。在一些实施例中，本发明提供抗 CCL2抗体或其片段，其结合亲和力强于和/或大于KT12M(例如大于0. 5X1(T12M、10_13M、 0? 5X1(T13M、1(T14M、0. 5XKT14M或I(T15M)。
[0028] 在一些实施例中，根据本发明的抗CCL2抗体或其片段是选自由以下组成的群组： 完整IgG、F(ab'）2、F(ab) 2、Fab'、Fab、scFvs、双功能抗体、三功能抗体和四功能抗体。
[0029] 在一些实施例中，抗CCL2抗体或其片段是单克隆抗体。
[0030] 在一些实施例中，抗CCL2抗体或其片段是人类化单克隆抗体。
[0031] 在一些实施例中，抗CCL2抗体或其片段是人类抗体。
[0032] 在另一方面中，本发明提供如本文中所述用于治疗硬皮病的方法的抗CCL2抗 体或其片段，所述方法包含向受试者投与抗CCL2抗体或其片段的步骤，其中抗CCL2抗 体或其片段的特征在于结合亲和力强于和/或大于KT12M(例如大于0. 5XKT12M、1(T13M、 0? 5X1(T13M、1(T14M、0. 5XKT14M或I(T15M)。
[0033] 在一些实施例中，根据本发明的抗CCL2抗体或其片段是选自由以下组成的群组： 完整IgG、F(ab'）2、F(ab) 2、Fab'、Fab、scFvs、双功能抗体、三功能抗体和四功能抗体。
[0034] 在一些实施例中，抗CCL2抗体或其片段是单克隆抗体，任选地，抗CCL2抗体或其 片段是人类化单克隆抗体，任选地，抗CCL2抗体或其片段是人类抗体。
[0035] 在另一方面中，本发明提供含有本文中所述的抗CCL2抗体的各种组合物和试剂 盒。
[0036] 本发明的其它特征、目标和优点将在随后的【具体实施方式】、图式和权利要求书显 而易知。然而，应理解，【具体实施方式】、图式和权利要求书在指示本发明的实施例时仅以说 明方式给出且无限制性。在本发明的范围内的各种变化和修改对于所属领域的技术人员将 变得显而易见。

【专利附图】

【附图说明】
[0037] 图式是仅出于说明的目的而非限制。
[0038] 图1示出了描绘经修改的罗德南皮肤分数的示例性图式。指示了身体上评估皮肤 纤维化的位置。
[0039] 图2描绘了绘制在平衡之后CCL2的血清和组织浓度的示例性图式。
[0040] 图3示出了描绘血浆和患病组织中CCL2靶向的示例性图式。
[0041] 定义
[0042] 为了使本发明更易于理解，首先对某些术语进行定义。以下术语和其它术语的其 它定义阐述在整个说明书中。
[0043] 亲和力：如本领域中已知，"亲和力"是具体配体结合于（例如非共价缔合于）其 搭配物的紧密性和/或其从其搭配物解离的速率或频率的量度。如本领域中已知，多种技 术中的任一者均可用于测定亲和力。在许多实施例中，亲和力代表特异性结合的量度。 [0044] 亲和力成熟的（或亲和力成熟的抗体）：如本文中所用，其是指在其一或多个CDR 中具有一或多个变化的抗体，所述一或多个变化引起抗体与不具有那些变化的亲本抗体相 比对抗原的亲和力提高。在一些实施例中，亲和力成熟的抗体对目标抗原将具有纳摩尔 或甚至皮摩尔的亲和力。亲和力成熟的抗体可通过所属领域中已知的多种程序中的任一 者产生。马克斯（Marks)等人生物技术（BioTechnology) 10:779-783(1992)描述通SVh 和'域改组产生的亲和力成熟。CDR和/或框架残基的随机诱变由以下各者描述：巴巴 斯（Barbas)等人美国国家科学院院刊（ProcNat.Acad.Sci,USA)91:3809-3813(1994); 希尔（Schier)等人基因（Gene) 169:147-155 (1995);耶尔顿（Yelton)等人免疫 学杂志（J.Immunol. ) 155:1994-2004(1995);杰克逊（Jackson)等人，免疫学杂 志154 (7) : 3310-9 (1995);以及霍金斯（Hawkins)等人，分子生物学杂志（J.Mol. Biol.)226:889-896(1992)。
[0045] 抗体：如本文中所用，术语"抗体"是指由一或多个实质上由免疫球蛋白基因或免 疫球蛋白基因片段编码的多肽组成的多肽。所识别的免疫球蛋白基因包括K、X、a、y、 S、e和y恒定区基因以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链通常归类为K或X。重链 通常归类为y、y、a、S或e，其又分别定义免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。 典型免疫球蛋白（抗体）结构单元已知包含四聚体。每一四聚体由两对相同的多肽链组成， 每一对具有一个"轻"链（约25kD)和一个"重"链（约50-70kD)。每一链的N端界定具有约 100到110个或更多个主要负责抗原识别的氨基酸的可变区。术语"可变轻链"（VJ和"可 变重链"(VH)分别是指这些轻链和重链。抗体对具体抗原可具有特异性。抗体或其抗原可为 分析物或结合搭配物。抗体作为完整免疫球蛋白或作为通过使用各种肽酶消化而产生的多 个明确表征的片段存在。因此，举例来说，胃蛋白酶在铰链区中的二硫键下方消化抗体以产 生F(ab) ' 2 (-种自身为由双硫键连接到轻链的Fab的二聚体）。可在温和条件下 还原F(ab)'2以破坏铰链区中的双硫键联进而将（Fab'）2二聚体转化成Fab'单体。Fab'单 体基本上是具有部分铰链区的Fab(参见基础免疫学（FundamentalImmunology)，W.E.保 罗（W.E.Paul)编，纽约的瑞文出版社（RavenPress，N.Y. )(1993)，关于其它抗体片段的 较详细描述）。虽然各种抗体片段根据完整抗体的消化定义，但所属领域的技术人员将理 解所述Fab'片段可以化学方式或使用重组DNA方法从头合成。因此，如本文中所用的术语 "抗体"还包括通过修饰全抗体产生的抗体片段或通过使用重组DNA方法从头合成的抗体 片段。在一些实施例中，抗体是单链抗体，如单链Fv(scFv)抗体，其中可变重链和可变轻链 (直接或通过肽连接子）连接在一起以形成连续多肽。单链Fv( "scFv"）多肽是共价连接 的VH: 杂二聚体，其可从包括直接连接或由肽编码连接子连接的V#PVJl码序列的核 酸表达。（参见例如休斯顿（Huston)等人（1988)美国国家科学院院刊，85:5879-5883,其 全部内容以引用的方式并入本文中。）多种结构存在用于将来自抗体V区的天然聚集但化 学上间隔开的轻链和重链多肽链转化成scFv分子，所述scFv分子将折叠成实质上类似于 抗原结合位点结构的三维结构。参见例如美国专利第5, 091，513号和第5, 132, 405号和第 4, 956, 778 号。
[0046] 大约：如本文中所用，术语"大约"或"约"在应用于所关注的一或多个值时是指与 所述参考值类似的值。在某些实施例中，除非另行说明或另外从上下文显而易见，否则术 语"大约"或"约"是指落入所述参考值的任一方向（大于或小于）25%、20%、19%、18%、 17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或 更低内的一系列值（除了其中所述数目将超过100%的可能值）。
[0047] 结合剂：如本文中所用，术语"结合剂"包括结合抗原或目标蛋白或肽的任何天然 存在、合成或基因工程改造的药剂，如蛋白质。"结合剂"也称为"结合蛋白"。结合剂可来 源于天然存在的抗体或以合成方式经工程改造。结合蛋白或结合剂可类似于抗体通过结合 于特定抗原以形成复合物并引发生物反应（例如激动或拮抗具体生物活性）来起作用。结 合剂或结合蛋白可包括经分离片段、由抗体的重链和轻链的可变区组成的"Fv"片段、其中 轻链和重链可变区由肽连接子连接的重组单链多肽分子（"scFv蛋白"）和由模拟高变区 的氨基酸残基组成的最小识别单位。如本文中所用的术语结合剂还可包括通过修饰全抗 体产生的抗体片段或通过使用重组DNA方法从头合成的抗体片段。在一些实施例中，抗体 是单链抗体，如单链Fv(scFv)抗体，其中可变重链和可变轻链（直接或通过肽连接子）连 接在一起以形成连续多肽。单链Fv( "scFv"）多肽是共价连接的VH: =Vlj杂二聚体，其可从 包括直接连接或由肽编码连接子连接的VjPVJl码序列的核酸表达。（参见例如休斯顿 (Huston)等人（1988)美国国家科学院院刊，85:5879-5883,其全部内容以引用的方式并入 本文中。）多种结构存在用于将来自抗体V区的天然聚集但化学上间隔开的轻链和重链多 肽链转化成scFv分子，所述scFv分子将折叠成实质上类似于抗原结合位点结构的三维结 构。参见例如美国专利第5, 091，513号和第5, 132, 405号和第4, 956, 778号。在一些实施 例中，如本文中所用的术语结合剂还可包括抗体。参见抗体的定义。
[0048] CDR:如本文中所用，其是指抗体可变区内的互补决定区。在重链和轻链的每一可 变区中有三个⑶R，对于每一可变区，其被指定为⑶R1、⑶R2和⑶R3。"⑶R的组"或"⑶R 组"是指在能够结合抗原的单一可变区中存在的三个或六个CDR群组或能够结合抗原的同 源重链和轻链可变区的CDR。CDR的界限已取决于系统以不同方式定义，在所述系统中数种 是所属领域中已知的（例如卡巴特（Kabat)、科西亚（Chothia)等）。
[0049] 化合物和药剂：术语"化合物"和"药剂"在本文中可互换使用。其是指任何天然 存在或非天然存在（即合成或重组）的分子，如生物大分子（例如核酸、多肽或蛋白质）、有 机或无机分子、或由生物物质（如细菌、植物、真菌或动物（尤其是哺乳动物，包括人类）细 胞或组织）制成的提取物。化合物可为单一分子或至少两种分子的混合物或复合物。
[0050] 对照：如本文中所用，术语"对照"具有其作为结果与之相比的标准的本领域理解 的含义。通常，对照用于通过隔离变量以便得出关于所述变量的结论来加强实验的完整性。 在一些实施例中，对照是与测试反应或分析同时执行以提供比较物的反应或分析。在一个 实验中，施用"测试"（即，所测试的变量）。在第二实验中，"对照"，不施用所测试的变量。 在一些实施例中，对照是历史对照（即先前执行的测试或分析，或先前已知的量或结果）。 在一些实施例中，对照是或包含印刷或以其它方式保存的记录。对照可为阳性对照或阴性 对照。
[0051] 给药方案："给药方案"（或"治疗方案"）在所述术语在本文中使用时是通常间隔 开时间段向受试者个别投与的一组单位剂量（通常是一个以上）。在一些实施例中，给定治 疗剂具有推荐的给药方案，其可能涉及一或多个剂量。在一些实施例中，给药方案包含多个 剂量，其中的每一者彼此间隔开相同长度的时间段；在一些实施例中，给药方案包含多个剂 量以及间隔开个别剂量的至少两个不同时间段。
[0052] 诊断：如本文中所用，术语"诊断"是指旨在判定个体是否罹患疾病（disease或 ailment)的过程。在本发明的情形下，"硬皮病的诊断"是指旨在以下各项中的一者或多者 的过程：判定个体是否罹患硬皮病，鉴别硬皮病亚型（即弥漫性或局限性皮肤硬皮病）以及 确定疾病的严重度。
[0053] 有效量：如本文中所用，术语"有效量"是指足以满足预期目的的化合物或药剂的 量。在本发明的情形下，目的可为例如：调节硬皮病的病因或症状；和/或延缓或预防硬皮 病的发作；和/或减缓或终止硬皮病症状的进展、加重或恶化；和/或缓解与硬皮病有关的 一或多个症状；和/或为硬皮病症状带来改善，和/或治愈硬皮病。
[0054] 框架或框架区：如本文中所用，其是指减去CDR的可变区的序列。因为CDR序列 可通过不同系统测定，所以同样地框架序列经历相对应地不同解读。六个CDR将重链和轻 链上的框架区划分成各链上的四个子区（FR1、FR2、FR3和FR4)，其中CDRl位于FRl与FR2 之间，⑶R2位于FR2与FR3之间，并且⑶R3位于FR3与FR4之间。在不将具体子区指定为 FRl、FR2、FR3或FR4的情况下，如通过其它提及的框架区代表单个天然存在免疫球蛋白链 的可变区内的组合的FR。如本文中所用，FR代表四个子区中的一者，FRl例如代表最接近 于可变区的氨基末端并且相对于CDRl的5'的第一框架区，并且FRs代表构成框架区的子 区中的两者或更多者。
[0055] 人类抗体：如本文中所用，其打算包括具有从人类免疫球蛋白序列生成（或装配） 的可变区和恒定区的抗体。在一些实施例中，抗体（或抗体组分）可视为"人类"，尽管其 氨基酸序列例如在一或多个CDR并且尤其是CDR3中包括不由人类生殖系免疫球蛋白序列 (例如包括序列变异体，例如可能（原先）已通过体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突 变引入的序列变异体）编码的残基或元件。
[0056] 人类化：如本领域中已知，术语"人类化"常用于指氨基酸序列包括来自在非人类 物种（例如小鼠）中产生的参考抗体的VjPVl区序列而且在那些序列中包括打算使其更 "人类样"（即，与人类生殖系可变序列更类似）的相对于参考抗体的修饰的抗体（或抗体组 分）。在一些实施例中，"人类化"抗体（或抗体组分）是免疫特异性地结合到所关注抗原 的抗体，并且其具有具备实质上如人类抗体的氨基酸序列般的氨基酸序列的框架（FR)区 以及具备实质上如非人类抗体的氨基酸序列般的氨基酸序列的互补决定区（CDR)。人类化 抗体包含实质上所有的至少一个并且通常是两个可变域（Fab、Fab' 4(&13'）2、？&13(：、？0，其 中所有或实质上所有的CDR区对应于非人类免疫球蛋白（即供体免疫球蛋白）的CDR区， 并且所有或实质上所有框架区是人类免疫球蛋白共同序列的框架区。在一些实施例中，人 类化抗体还包含免疫球蛋白恒定区（Fe)的至少一部分，通常是人类免疫球蛋白恒定区的 至少一部分。在一些实施例中，人类化抗体含有轻链以及至少重链可变域两者。抗体还可 包括重链恒定区的CH1、铰链、CH2、CH3以及任选地CH4区。在一些实施例中，人类化抗体仅含 有人类化'区。在一些实施例中，人类化抗体仅含有人类化VHg。在一些某些实施例中， 人类化抗体含有人类化％和Vl区。
[0057] 提高、增大或减小：如本文中所用，术语"提高"、"增大"或"减小"或语法上的等效 说法指示相对于基线测量值的值，所述基线测量值如在相同个体中在开始本文中所述的治 疗之前的测量值或在一个对照个体（或多个对照个体）中在不存在本文中所述的治疗的情 况下的测量值。"对照个体"是与所治疗的个体罹患相同类型和大致相同严重度的硬皮病的 个体，其与所治疗的个体年龄大致相同（从而确保所治疗的个体与对照个体的疾病阶段是 可比的）。
[0058] 试剂盒：如本文中所用，术语"试剂盒"是指用于传递物质的任何传递系统。所述 传递系统可包括允许从一个地点到另一个地点储存、运输或传递各种诊断性或治疗性试剂 (例如在适当容器中的寡核苷酸、酶等）和/或支持物质（例如缓冲液，用于执行分析的书 面说明书等）的系统。举例来说，试剂盒包括一或多个含有相关反应试剂和/或支持物质 的外壳（例如盒子）。术语"分部式试剂盒"是指包含两个或更多个分开的容器的传递系 统，所述容器各自含有全部试剂盒组分的亚部分。可一起或分开地将所述容器传递给预期 的接受者。举例来说，第一个容器可含有用于分析的酶，而第二个容器含有寡核苷酸。术 语"分部式试剂盒"打算涵盖含有在联邦食品、药品和化妆品法案（FederalFood，Drug，and CosmeticAct)的条款520(e)的管制之下的分析物特异性试剂（AnalyteSpecific Reagents，ASR's)的试剂盒，但并不局限于此。事实上，在术语"分部式试剂盒"中包括任何 包含两个或更多个分开的容器的传递系统，所述容器各自含有全部试剂盒组分的亚部分。 相反地，"组合式试剂盒"是指在单个容器中（例如在容纳每一所需组分的单个盒子中）含 有所有组分的传递系统。术语"试剂盒"包括分部式和组合式试剂盒两者。
[0059] 正常：如本文中所用，术语"正常"在用于修饰术语"个体"或"受试者"时是指并 未患有具体疾病或病况并且也不是所述疾病或病况的携带者的个体或个体群组。术语"正 常"在本文中也用于形容从正常或野生型个体或受试者中分离的生物样本或样品，例如"正 常生物样品"。
[0060] 核酸：如本文中所用的术语"核酸"是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸以及其片段 或部分，并且是指可为单链或双链的基因组或合成起点的DNA或RNA，并且代表正义或反义 链。
[0061] 核酸分子：术语"核酸分子"和"多核苷酸"在本文中可互换使用。其是指呈单链 或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另行说明，否则其涵盖可以 与天然存在的核苷酸类似的方式起作用的已知的天然核苷酸类似物。所述术语涵盖具有合 成主链的核酸样结构以及扩增产物。
[0062] 蛋白质：一般来说，"蛋白质"是多肽（即，由肽键彼此连接的至少两个氨基酸的 串）。蛋白质可包括除氨基酸之外的部分（例如可为糖蛋白）和/或可以其它方式加工或 修饰。所属领域的技术人员将理解"蛋白质"可为如由细胞产生的完整多肽链（具有或不 具有信号序列），或可为其功能性部分。一般技术者将进一步理解蛋白质有时可包括例如由 一或多个二硫键连接或通过其它方式缔合的一个以上多肽链。
[0063] 样品：如本文中所用，术语"样品"涵盖从生物来源获得的任何样品。术语"生物样 品"和"样品"可互换使用。生物样品可（借助于非限制性实例）包括皮肤组织、肝组织、肾 组织、肺组织、脑脊髓液、（CSF)、血液、羊水、血清、尿液、粪便、表皮样品、皮肤样品、颊部抹 拭、精子、羊膜液、经培养细胞、骨髓样品和/或绒毛膜绒毛。任何生物样品的细胞培养物也 可用作生物样品。生物样品还可为例如从任何器官或组织获得的样品（包括活检或尸检样 本），可包含细胞（不论是原代细胞还是经培养细胞）、由任何细胞、组织或器官调节的培养 基、组织培养物。在一些实施例中，适于本发明的生物样品是已经加工从而释放或以其它方 式使核酸可供用于如本文中所述的检测的样品。也可使用固定或冷冻组织。
[0064] 受试者：如本文中所用，术语"受试者"是指人类或任何非人类动物（例如小鼠、大 鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物）。人类包括出生前和出生后形式。在许多实施 例中，受试者是人类。受试者可为患者，其是指呈现给医疗服务提供者以便诊断或治疗疾病 的人类。术语"受试者"在本文中与"个体"或"患者"可互换使用。受试者可罹患或易患疾 病或病症但可能呈现或可能不呈现所述疾病或病症的症状。
[0065] 罹患："罹患"疾病、病症和/或病况（例如硬皮病）的个体已诊断有所述疾病、病 症和/或病况或展示所述疾病、病症和/或病况的一或多种症状。
[0066] 易患："易患"疾病、病症和/或病况的个体尚未诊断有所述疾病、病症和/或病况 和/或可能不展现所述疾病、病症和/或病况的症状。在一些实施例中，易患疾病、病症和/ 或病况（例如硬皮病）的个体的特征可在于以下中的一或多者：（1)与所述疾病、病症和/ 或病况发展有关的基因突变；（2)与所述疾病、病症和/或病况发展有关的基因多态性；（3) 增加和/或减少与所述疾病、病症和/或病况有关的蛋白的表达和/或活性；(4)与所述疾 病、病症和/或病况发展有关的习惯和/或生活方式；（5)所述疾病、病症和/或病况的家 族病史；(6)对某些细菌或病毒的反应；（7)暴露于某些化学物质。在一些实施例中，易患疾 病、病症和/或病况的个体将发展所述疾病、病症和/或病况。在一些实施例中，易患疾病、 病症和/或病况的个体将不发展所述疾病、病症和/或病况。
[0067] 治疗：如本文中所用，术语"治疗（treatment)"（还有"治疗（treat)"或"治疗 (treating)"）是指治疗性蛋白的任何投与（例如抗CCL2单克隆抗体或其抗原结合片段的 投与）部分或完全地将具体疾病、病症和/或病况（例如硬皮病、纤维化或炎症）的一或多 种症状或特征缓解、改善、减轻、抑制、延缓发作、降低严重度和/或降低发病率。所述治疗 可为对并未展现相关疾病、病症和/或病况的征象的受试者的治疗和/或对仅展现疾病、病 症和/或病况的早期征象的受试者的治疗。可替代地或另外，所述治疗可为对展现相关疾 病、病症和/或病况的一或多种确立征象的受试者的治疗。

【具体实施方式】
[0068] 本发明尤其提供特征在于高亲和力、效力、组织选择性和/或表位特异性的经改 良抗CCL2抗体，和其尤其用于治疗硬皮病和相关纤维化和/或发炎性疾病、病症和病况的 用途。在一些实施例中，本发明提供基于亲和力为KT12M或更大的抗CCL2抗体治疗硬皮病 和相关纤维化和/或发炎性疾病、病症和病况的方法和组合物。
[0069] 本发明在某种程度上基于由本发明人观察到的独到见解，S卩，高亲和力抗CCL2 抗体尤其在以高剂量投与时允许不管血浆中的高水平CCL2而有效抑制受影响组织中的 CCL2。本发明的实施例包括亲和力为KT12M或更大的抗CCL2抗体。所述高亲和力的抗体 是尤其有利的。由于硬皮病患者血浆中CCL2的循环水平较高，故所投与的任何抗CCL2抗 体的较大部分很可能被循环CCL2所螯合。在不希望受理论束缚的情况下，高亲和力抗CCL2 抗体除了中和循环CCL2之外还可有效中和受影响组织中的CCL2,这部分归因于其有效地 竞争离开受体CCR2 (其对CCL2的结合亲和力为60pM)的能力。因此，高亲和力抗CCL2抗 体（例如结合亲和力强于60pM的抗CCL2抗体）可有效螯合患病组织中的CCL2,防止CCL2 与其受体CCR2之间的结合。因此，患病组织中可能需要较少量的高亲和力抗CCL2抗体来 实现所需治疗作用。
[0070] 本发明的各种方面详细地描述于以下章节中。章节的使用不意欲限制本发明。每 一章节可应用于本发明的任何方面。在本申请案中，除非另外说明，否则"或"的使用意指 "和/或"。
[0071] 硬皮病
[0072] 硬皮病或全身性硬化症通常被视为慢性全身性自身免疫疾病，其特征尤其在于纤 维化或硬化、血管变化和自身抗体。在不希望受理论束缚的情况下，据认为硬皮病是由强化 扩增环中截留的活动过度的自身免疫反应引起的。举例来说，硬皮病的组织学特征在于单 核细胞的炎性浸润，其又活化周围成纤维细胞中的胶原蛋白合成并与胶原蛋白合成增加有 关。具体来说，活化的巨噬细胞产生TGF-0和TOGF，其活化受影响区域中的成纤维细胞以 产生较高量的胶原蛋白。
[0073] T细胞似乎也通过活化巨噬细胞和炎性前纤维发生细胞因子的直接释放而在疾病 过程中起一定作用。除了胶原蛋白之外，活化的成纤维细胞似乎分泌会将其它炎性细胞募 集到受影响区域的因子，所述炎性细胞释放细胞因子，所述细胞因子进一步募集细胞因子 释放炎性细胞，由此引起未经调节的炎症和组织纤维化。
[0074] 通常，单核细胞/巨噬细胞和T细胞在硬皮病患者的循环和组织中的数目和活化 均增加。组织积聚既是微血管损伤的原因也是其作用，微血管损伤是硬皮病发病机制中的 早期事件之一。微血管损伤的特征在于内皮细胞损伤、基底膜层增生、外周血液单核细胞在 血管壁中的偶发性滞留以及初始血管周围单核细胞浸润。随着发炎级联反应恶化，纤维化、 内脏器官架构紊乱、血管稀疏以及因此产生的缺氧占主导地位。所有这些因素和单核细胞 的持续募集促成纤维化的维持。
[0075] 在一些实施例中，硬皮病也被视为结缔组织疾病，其特征通常在于胞外基质蛋白 在皮肤和内脏中的过度积聚、血管损伤以及免疫异常。
[0076] 所述疾病的许多临床表现被认为涉及血管重构的误调节。硬皮病的最早症状之一 是微血管损伤。这种微血管损伤被认为引起内皮细胞活化增加。认为活化的内皮细胞会表 达粘附分子，引起毛细管渗透性改变，允许炎性细胞通过内皮迀移并滞留在血管壁中。免疫 活化被认为促进内皮活化维持，这引起内皮细胞的分解。认为这一过程会促进在硬皮病患 者中通常观察到的血管弹性损失和变窄。此外，认为微血管损伤促成单核细胞在真皮中的 血管周围浸润，这被认为会促进成纤维细胞活化和许多硬皮病的相关标志性症状。随着纤 维化增加，渗透性降低。因此，抗体渗透患病组织变得更困难。因此，抗CCL2抗体的亲和力 对于保持抗体局部化来说变得尤其重要。
[0077] 所述疾病的许多临床表现被大体上认为涉及成纤维细胞的误调节。成纤维细胞的 主要功能是通过连续分泌胞外基质前体来维持结缔组织的结构完整性。成纤维细胞为许多 组织提供结构框架（基质），在创伤愈合中起到重要作用并且是动物中最常见的结缔组织 细胞。成纤维细胞在形态上是异质的，取决于其位置和活性具有多样的外观。
[0078] 硬皮病有两种主要形式：局限性全身性硬化症/硬皮病和弥漫性全身性硬化症/ 硬皮病。在局限性皮肤硬皮病中，皮肤的纤维化大体上限制于接近肘部的区域。局限性皮 肤硬皮病患者通常经历血管损害。皮肤和器官纤维化在局限性硬皮病患者中通常进展缓 慢。弥漫性硬皮病患者通常经历与在局限性硬皮病中相比进展更快速的皮肤和器官的纤维 化和/或广泛的炎症和/或与在局限性硬皮病中可见相比更严重的内部器官涉及。
[0079] 通常认为间质肺疾病（其引起肺纤维化）是硬皮病相关死亡的主要原因（卢德维 卡-布拉德莱A. (Ludwicka-Bradley，A.)等人硬皮病间质肺疾病中的凝血和自身免疫性 (Coagulationandautoimmunityinsclerodermainterstitiallungdisease)?关节炎 与风湿病论文集（SeminArthritisRheum) ,41 (2) ,212-22, 2011)。引起硬皮病相关死亡的 其它并发症包括（但不限于）癌症、心力衰竭、肺高血压、肾衰竭和吸收障碍或其任何组合。
[0080] 硬皮病最常通过检查皮肤症状来诊断。诊断的测试包括（但不限于）目视和/或 手动检查皮肤、血压测试、胸X射线、肺CT、超声心动图、尿分析、皮肤活检和血液测试（包括 抗核抗体测试、抗拓扑异构酶抗体测试、抗着丝粒抗体测试、抗U3抗体测试、抗RNA抗体测 试、其它类型的抗体测试、红细胞沉降速率以及类风湿因子）。
[0081] 抗CCL2 抗体
[0082] 本发明提供基于投与抗CCL2抗体（具体来说是高亲和力抗CCL2抗体）来治疗硬 皮病和相关纤维化和/或发炎性疾病、病症和病况的方法和组合物。
[0083] CCL2
[0084] CCL2是由多种细胞类型产生的趋化因子。其也称为单核趋化蛋白-I(MCP-I)。 已知CCL2是免疫系统许多细胞类型的强力引诱剂，包括（但不限于）单核细胞、CD4和 ⑶8记忆T淋巴细胞和NK细胞（卡鲁利M. (Carulli，M.)等人CCL2血清水平可在全身性 硬化症中用于风险分层或监测治疗反应吗？（CanCCL2serumlevelsbeusedinrisk stratificationortomonitortreatmentresponseinsystemicsclerosis?)风湿 病年鉴（AnnRheumDis)，67, 105-109, 2008，山本T. (Yamamoto,T.)硬皮病-病理生理学 (Scleroderma-Pathophysiology) ?欧洲皮肤病学杂志（EurJDermatol) ,19 (I) ,14-24)。 CCL2已展示出促进白细胞跨内皮单层迀移，表明在促进单核细胞的血管周围浸润中的作用 (同上）。CCL2也已展示出在体外大鼠成纤维细胞中促进成纤维细胞活化并上调I型胶原 蛋白mRNA表达。在硬皮病患者以及硬皮病动物模型中已展示出CCL2水平升高（同上）。 确切地说，在硬皮病皮肤中已展示CCL2表达水平增加，并且在硬皮病成纤维细胞中已展示 CCL2RNA和蛋白质增加（同上）。
[0085] 人类CCL2是含有76个氨基酸残基的8. 6kDa蛋白，其氨基酸序列展示在表1中。 其由多种细胞类型（尤其包括单核细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞、某些上皮细胞）表达 并且结合其受体CCR2。CCL2属于CC趋化因子家族，其含有邻近的两个半胱氨酸残基（邻 近半胱氨酸残基在表1中带下划线）。
[0086] 表 1
[0087]

【权利要求】
1. 一种治疗硬皮病的方法，其包含 向罹患或易患硬皮病的个体投与有效量的抗CCL2抗体或其片段，使得目标组织中硬 皮病的至少一种症状或特征的强度、严重度或频率降低或具有延迟的发作。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述硬皮病的至少一种症状或特征是选自内皮细 胞损伤、基底膜层增生、血管周围单核细胞浸润、纤维化、内脏器官架构紊乱、血管稀疏、缺 氧以及其组合。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述目标组织是选自由以下组成的群组：皮 肤、血管、肺、心、肾、胃肠道（包括肝）、肌肉骨胳系统以及其组合。
4. 根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述目标组织是肺。
5. 根据权利要求1到3中任一权利要求所述的方法，其中所述目标组织是心。
6. 根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述个体罹患或易患局限性皮 肤硬皮病。
7. 根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述个体罹患或易患弥漫性皮 肤硬皮病。
8. 根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述抗CCL2抗体或其片段是 肠胃外投与的。
9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述肠胃外投与是选自静脉内、皮内、吸入、经皮 (表面）、皮下和/或经粘膜投与。
10. 根据权利要求9所述的方法，其中所述肠胃外投与是静脉内投与。
11. 根据权利要求1到7中任一权利要求所述的方法，其中所述抗CCL2抗体或其片段 是口服投与的。
12. 根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述抗CCL2抗体或其片段 是两月一次、每月一次、三周一次、两周一次、每周一次、每天一次或以可变的时间间隔投与 的。
13. -种治疗硬皮病的方法，其包含 向罹患或易患硬皮病的个体投与结合亲和力大于1(T12M的抗CCL2抗体或其片段。
14. 根据权利要求13所述的方法，其中所述抗CCL2抗体或其片段以治疗有效剂量和一 定的投与时间间隔投与，使得所述抗CCL2抗体或其片段分布到一或多种选自由以下组成 的群组的目标组织：皮肤、血管、肺、心、肾、胃肠道（包括肝）、肌肉骨胳系统以及其组合。
15. 根据权利要求13所述的方法，其中所述抗CCL2抗体或其片段以治疗有效剂量和一 定的投与时间间隔投与，使得所述抗CCL2抗体或其片段分布到肺和/或心。
16. 根据权利要求15所述的方法，其中所述投与时间间隔是选自两月一次、每月一次、 三周一次、两周一次、每周一次、每天一次或可变的时间间隔。
17. -种治疗硬皮病的方法，其包含 以治疗有效剂量和一定的投与时间间隔向罹患或易患硬皮病的个体投与抗CCL2抗体 或其片段，使得所述抗CCL2抗体或其片段分布到肺和/或心。
18. 根据权利要求17所述的方法，其中所述抗CCL2抗体或其片段进一步分布到皮肤、 肾和/或肝。
19. 根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述抗CCL2抗体或其片段是 选自由以下组成的群组：完整IgG、F(ab'）2、F(ab)2、Fab'、Fab、scFvs、双功能抗体、三功能 抗体和四功能抗体。
20. 根据权利要求19所述的方法，其中所述抗CCL2抗体或其片段是单克隆抗体。
21. 根据权利要求20所述的方法，其中所述抗CCL2抗体或其片段是人类化单克隆抗 体。
22. 根据权利要求20所述的方法，其中所述抗CCL2抗体或其片段是人类抗体。
23. -种抗CCL2抗体或其片段，其具有大于10 _12M的结合亲和力。
24. 根据权利要求23所述的抗CCL2抗体，其中所述抗CCL2抗体或其片段具有大于 1(T13M的结合亲和力。
25. 根据权利要求23或24所述的抗CCL2抗体，其中所述抗CCL2抗体或其片段是选自 由以下组成的群组：完整IgG、F(ab'）2、F(ab)2、Fab'、Fab、scFvs、双功能抗体、三功能抗体 和四功能抗体。
26. 根据权利要求23到25中任一权利要求所述的抗CCL2抗体，其中所述抗CCL2抗体 或其片段是单克隆抗体。
27. 根据权利要求26所述的抗CCL2抗体，其中所述抗CCL2抗体或其片段是人类化单 克隆抗体。
28. 根据权利要求26所述的抗CCL2抗体，其中所述抗CCL2抗体或其片段是人类抗体。
29. -种试剂盒，其包含根据权利要求23到28中任一权利要求所述的抗CCL2抗体或 其片段。
【文档编号】A61K39/395GK104487091SQ201380038785
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2013年5月22日 优先权日:2012年5月22日
【发明者】P·G·V·马丁尼, M·纳塔拉詹, P·A·J·哈斯利特, A·B·西摩 申请人:夏尔人类遗传性治疗公司