专利名称：用于治疗神经疾病的模型系统和治疗方案的制作方法
用于治疗神经疾病的模型系统和治疗方案相关申请的交叉引用本申请为正式申请，要求美国临时申请号61/185，989 (2009年6月10日递交)的权利。
背景技术：
关于兴奋性神经毒性的早期工作表明，可以使用阻断谷氨酸受体的药物来治疗中风和神经创伤(Albers，Archives in Neurology 49:418-420(1992) ；Albers Ann Neurol 25:398-403(1989))。尽管早期在体外和在动物模型中的测试看上去很有希望， 但不幸的是，迄今，所有谷氨酸拮抗物的中风临床试验都没显示出益处，甚至表现出毒性副作用(Davis 等，Lancet349 32(1997) ；Morris 等，J Neurosurg 91 :737_743 (1999)； Davis 等，Stroke31 347-354(2000) ；Ikonomidou 等，Proc Natl Acad Sci U S A 97 12885-12890(2000) ；Lees 等，Lancet 355 1949-1954 (2000))。可能的解释是施用抑制 CNS 中兴奋性神经传递的化学剂后的负面影响超过了它们作为神经保护剂的效用(Ikonomidou 和Turski，Lancet Neurology383_386 (2002)。谷氨酸能信号传递为CNS行使功能所需， 因此，阻断必需的兴奋性神经传递具有负面后果(Ikonomidou，Biochem. Pharmacol. 62 401-405(2001))。因此，需要更为完善的治疗神经元死亡的方法，以规避阻断谷氨酸受体的负面后果。本发明的发明人之一报道了突触后密度蛋白95 (PSD-95)将NMDARs偶联到介导兴奋性神经毒性和缺血性脑损伤的途径上(Aarts等，Science298，846-850 (2002))。这种偶联通过向神经元转导多肽而被破坏，所述多肽结合到PSD-95/NMDAR相互作用复合体一侧的模块结构域上。这种处理减弱了下游NMDAR信号传导而不阻断NMDAR活性，保护了培养的皮层神经元不受到兴奋性毒性的损伤，减少了遭受短暂性局灶性脑缺血大鼠的脑梗死体积。发明概述本发明提供了治疗或预防由兴奋性神经毒性介导的疾病的方法，包括对患有该病或具有罹患该病风险的受试者施用抑制PSD-95与NMDAR2B结合和/或PSD-95 与nNOS结合的药剂(pharmacological agent)，其中当该化学剂为具有氨基酸序列 YGRKKRRQRRRKLSSIESDV(SEQ IDNO 6)的肽时，剂量为2_3mg/kg，如果该化学剂不是具有氨基酸序列YGRKKRRQRRRKLSSIESDV的肽时，剂量递送与2_3mg/kg具有氨基酸序列 YGRKKRRQRRRKLSSIESDV的肽等价有效浓度的该化学剂。在一些方法中，该化学剂为具有氨基酸序列YGRKKRRQRRRKLSSIESDV的肽，剂量为2. 6mg/kg。在一些方法中，每疾病发作期，施用一次剂量。在一些方法中，施用剂量，不共施用抗炎药。本发明也提供了治疗或预防由兴奋性神经毒性介导的疾病的方法，包括对患有该病或具有罹患该病风险的受试者施用抑制PSD-95与NMDAR2B结合和/或PSD-95与 nNOS结合的药剂，其中药剂被连接到内化肽(internalization ρ印tide)，药剂通过静脉输注5-15分钟的时间来施用。在一些方法中，连接到内化肽的药剂为具有氨基酸序列 YGRKKRRQRRRKLSSIESDV (SEQ ID NO 6)的肽，施用时间为5分钟。在一些方法中，药剂的剂量大于lmg/kg。在一些方法中，药剂的剂量为2-3mg/kg。在一些方法中，药剂的剂量为 2. 6mg/kg。在一些方法中，剂量不超过50mg/kg，前提是如果剂量大于3mg/kg，则该剂量与抗炎药共施用。在一些方法中，施用剂量，不共施用抗炎药。在一些方法中，受试者患有中风。在一些方法中，受试者正在经历手术，可选地，治疗动脉瘤的血管内手术。本发明还提供了抑制神经手术或血管内手术(无论其是否发生在CNS中)中的缺血性损伤的方法，包括对经历神经手术的患者施用有效给药方案的抑制PSD-95与NMDAR 2B结合的化学剂。在一些方法中，神经手术为诊断性脑血管造影术。在一些方法中，神经手术为治疗动脉瘤的血管内手术。在一些方法中，在血管内手术之前施用化学剂。在一些方法中，在完成血管内手术后1小时内施用化学剂。在一些方法中，血管内手术包括向动脉瘤中置入线圈(coil)。在一些方法中，血管内手术包括将支架(stent)置入有动脉瘤的血管中。在一些方法中，血管内手术包括置入微导管(microcatheter)。本发明提供了对药剂进行临床试验的方法，包括对经历脑动脉瘤血管内手术的患者群体施用药剂，并将这些患者中手术损伤效应的频率与经历血管内手术而没有施用药剂的对照患者进行比较，以确定药剂是否降低了损伤效应。在一些方法中，通过脑梗死的数量和/或大小来评估损伤效应。一些方法还包括在中风的动物模型中测试药剂。一些方法还包括在患有中风的人类患者中测试药剂。一些方法还包括标记药剂用于治疗中风。在一些方法中，药剂抑制PSD95与NMDAR 2B和/或PSD-95与nNOS的结合。本发明还提供了测试药剂的方法。这些方法包括(a)将微粒(particles)置入到灵长类动物的脑血管中；(b)给灵长类动物施用药剂；以及(c)将此灵长类动物的损伤效应与没有用化合物处理的对照灵长类动物进行比较。在一些方法中，通过梗死的数量和/ 或大小来评估损伤效应。在一些方法中，通过MRI或CAT扫描来确定梗死。在一些方法中， 通过与对照灵长类动物比较灵长类动物的行为症状来评估损伤效应。一些方法还包括在恢复期后对同样的灵长类动物重复步骤(a)-(c)，条件是在重复步骤(a)-(c)中测试的药剂可以与在之前进行步骤(a)-(c)时的相同或可以不同。一些方法还包括重复步骤(a)-(c)， 但是其中对照灵长类动物接受药剂且将之前接受了药剂的动物作为对照动物。在一些方法中，药剂抑制PSD-95与NMDAR 2B和/或PSD-95与nNOS的结合。一些方法还包括对人中风受试者施用药剂。一些方法还包括对经历动脉瘤血管内手术的人受试者施用药剂。在一些方法中，在将微粒置入到脑血管中之后施用药剂。在一些方法中，在将微粒置入到脑血管中之前施用药剂。在一些方法中，微粒为100微米的聚苯乙烯球体。在一些方法，对灵长类动物施用20个球体。在一些方法中，灵长类动物为猕猴。本发明还提供了冻干的组合物，所述组合物包含具有氨基酸序列 YGRKKRRQRRRKLSSIESDV (SEQ ID NO 6)的肽，其从在GMP条件下制备的于生理盐水中的肽溶液冻干而来。本发明还提供了储存药物组合物的方法，所述方法包括将包含具有氨基酸序列 YGRKKRRQRRRKLSSIESDV (SEQ ID NO 6)的肽的药物组合物，于生理盐水中，以10_30mg/ml 的浓度，在GMP条件下于低于0°C储存至少2年的时间。可选地，浓度为18-20mg/ml。一些方法还包括对患者施用药物组合物。附图简述
图1显示，在对照动物中注射球体后24小时，梗死的弥散加权MRI扫描，与接受了血管内手术以置入线圈来修复动脉瘤的人进行比较。上部显示在44岁的女性中于动脉瘤线圈置入后48小时的扩散缺陷。下部显示在雄性食蟹猴(Cynomolgus macaque)中注射 20x IOOum聚苯乙烯微球后24小时的扩散缺陷。图2比较经治疗的动物和对照动物中MRI可见梗死的数量和体积。图3显示有关皮层中梗死的与图2类似的数据。图4显示按50mg/kg以及输注时间3分钟或60分钟施用Tat_NR2B9c后的血压变化。图5显示，对于7. 6mg/kg Tat_NR2B9c的5分钟输注而非1小时输注(最右栏)， 与盐水安慰剂相比，治疗后24小时所测定的梗死的大小显著降低。定义“嵌合肽”是指天然不彼此连接的两个肽组分作为融合蛋白或通过化学键互相连接而成的肽。“融合”蛋白或多肽是指复合的多肽，即单一的连续氨基酸序列，其由通常不以单一多肽序列的形式融合在一起的两个(或更多个)不同的、异源的多肽组成。术语“PDZ结构域”是指约90个氨基酸的模块蛋白质结构域，其特征在于与脑突触蛋白PSD-95、果蝇的分隔连接蛋白Discs-Large(DLG)、和上皮紧密连接蛋白ZOl (ZOl)具有显著的序列同一性(例如，至少60% )。PDZ结构域也被称作Discs-Large同源重复序列 (“DHRs”)和GLGF重复序列。通常，PDZ结构域表现出维持核心共有序列(Doyle, D. Α.， 1996，Cell 85 1067-76)。示例性的包含PDZ结构域的蛋白质和PDZ结构域序列公开于美国申请号10/714，537，在此就其全部内容通过参考引用并入本文。术语“PL蛋白”或“PDZ配体蛋白”是指与PDZ-结构域形成分子复合物的天然蛋白质，或是指其羧基端，当与全长蛋白质分开来表达时(例如，作为3-25个残基的肽片段， 例如3，4，5，8，9，10，12，14或16个残基)，形成这样的分子复合物的蛋白质。可以对分子复合物进行体内观察，或者使用描述于例如美国申请号10/714，537中的“A分析法”或“G分析法”进行体外观察。术语“NMDA受体”或“NMDAR”是指已知与NMDA相互作用的膜相关蛋白(包括以下所描述的各种亚基形式)。该受体可以是人的或非人的(例如，小鼠、大鼠、兔、猴)。“PL基序”是指PL蛋白的C末端氨基酸序列(例如C末端3，4，5，6，7，8，9，10， 12，14，16，20或25个连续的残基)(“C末端PL序列)或已知结合PDZ结构域的内部序列 (“内部PL序列”)。"PL肽”是包含特异地与PDZ结构域结合的PL基序、或由PL基序组成、或基于PL 基序的肽。术语“分离的”或“纯化的”意思是指，目标物(例如，肽)已经从存在于样品中的污染物中纯化出来，所述样品例如从天然来源获得的包含目标物的样品。如果目标物被分离或纯化，则其是于样品中存在的主要大分子(例如，多肽)(即，基于摩尔计，其在组合物中比任何一种其它物更加丰富)，以及优选地，目标物占存在的所有大分子物的至少约50% (基于摩尔计算)。通常，分离的、纯化的或基本上纯的组合物占存在于组合物中的所有大分子物的80%以上至90%。最优选地，目标物被纯化至基本同质(即，以常规检测方法在组合物中不能检测到污染物)，其中组合物基本上由单一一种大分子组成。术语分离的或纯化的不必排除旨在与分离物联合起作用的其它组分的存在。例如，内化肽可以被描述为分离的，尽管其与活性肽连接。“肽模拟物”是指合成的化学化合物，所述化合物具有与天然氨基酸组成的肽基本相同的结构和/或功能特征。肽模拟物可以完全包含氨基酸的合成的非天然类似物，或可以为部分天然肽氨基酸和部分非天然氨基酸类似物的嵌合分子。肽模拟物也可以包含任何数量的天然氨基酸保守性替换，只要这样的替换不实质性改变模拟物的结构和/或抑制或结合活性。多肽模拟组合物可以包含任何组合的非天然结构组分，所述非天然结构组分典型来自3类结构基团a)非天然酰胺键(“肽键“)连接的残基连接基团；b)代替天然存在的氨基酸残基的非天然残基；或c)诱导二级结构模拟(即诱导或稳定二级结构)的残基， 所述二级结构例如，β转角、Y转角、β折叠、α螺旋构象等。在包含活性肽和内化肽的嵌合肽的肽模拟物中，活性部分或内化部分或两者均可以为肽模拟物。术语“特异性结合”是指两个分子例如配体和受体间的结合，其特征在于即使在许多其它不同分子存在的条件下，一个分子(配体)也具有与另一个特定的分子(受体)结合的能力，即在非均质的分子混合物中，一种分子表现出和另一种分子的优先结合。配体和受体的特异性结合也可以通过在存在过量未标记配体时可检测标记的配体与受体的结合减少(即结合竞争试验)，而证明。兴奋性神经毒性是神经元由于兴奋性神经递质谷氨酸的受体(例如NMDA受体 (例如，NMDAR 2Β))的过度激活而被损伤或杀死的病理学过程。术语“受试者”或“患者”包括人和兽医动物，例如哺乳动物。术语“剂/化学剂”(agent)包括任何化合物，包括具有或不具有药物活性的化合物、天然化合物、合成的化合物、小分子、肽和肽模拟物。术语“药剂”是指具有药理学活性的化学剂。药剂包括为已知药物的化合物、药理学活性已经被鉴定但正在动物模型或临床试验中进行进一步治疗性评估的化合物。嵌合剂包括与内化肽连接的药剂。如果一种化学剂在筛选系统中表现出活性，表明该活性剂在疾病的预防或治疗中有用或可能有用，则该化学剂可以被描述为具有药理学活性。筛选系统可以是体外的、细胞的、动物或人。化学剂可以被描述为具有药理学活性，尽管可能需要进一步的测试来确立其在疾病治疗中实际的预防或治疗效用。Tat肽是指包含GRKKRRQRRR(SEQ ID NO :1)或由其组成的肽，其中在该序列中不超过5个残基被缺失、替换或插入，保留了其促进所连接的肽或其它化学剂吸收到细胞中的能力。优选地，任何氨基酸改变为保守替换。优选地，任何替换、缺失或内部插入合计起来使肽保留净的阳离子电荷，优选地与以上序列的电荷相似。Tat肽的氨基酸可以用生物素或类似的分子衍生化以减轻炎症反应。将连接到内化肽的药剂与抗炎药进行共施用的意思是，这两种化学剂的用药时间足够接近，从而抗炎药可以抑制由内化肽诱导的炎症反应。统计上显著是指ρ值小于0. 05，优选地小于0. 01，以及最优选地小于0. 001。疾病的发作期是指存在疾病的病征和/或症状的时期，该时期穿插在没有病征和 /或症状、或病征和/或症状表现较轻的更长时期之中。发明详述I.概要
本发明提供了动物模型和临床试验，用于评估化学剂在治疗或预防中风和其它神经疾病中的潜在用途。本发明也提供了该化学剂临床应用的优选剂量、输注方案和药物组合物。11·用于治疗疾病的化学剂尽管在以下所描述的动物模型或临床试验中可以对任何化学剂(包括在以前的中风临床试验中失败了的化学剂)进行功效筛选，但优选类型的化学剂抑制PSD-95和一种或多种NMDARs之间的相互作用。这样的化学剂可以用于减轻至少部分由NMDAR兴奋性神经毒性介导的中风和其它神经病学状况的损伤效应。这样的化学剂包括肽，所述肽具有包含或基于NMDA受体的PL基序或PSD95的PDZ结构域的氨基酸序列。这样的肽也可以抑制 PSD-95和nNOS以及其它谷氨酸受体(例如，钾盐镁矾(kainite)受体或AMPA受体)，例如 KV1-4和GluR6，之间的相互作用。优选的肽抑制突触后密度蛋白95(PSD-95)的PDZ结构域1和2(人氨基酸序列由Stathakism提供，Genomics 44(1) :71_82 (1997))与一或多种 NMDA受体2亚基的C末端PL序列之间的相互作用，所述NMDA受体2亚基包括神经元N-甲基-D-天冬氨酸受体的 NR2B 亚基(Mandich 等，Genomics 22，216-8 (1994))。NMDAR2B 的 GenBank 识别号为 4099612、其具有 C 末端 20 个氨基酸 FNGSSNGHVYEKLSSIESDV (SEQ IDNO 11)和PL基序ESDV(SEQ ID N0:12)。优选的肽抑制人PSD-95和人NMDAR受体。然而，对于这些蛋白质的物种变体，也能够显示出抑制作用。可以使用的NMDA和谷氨酸受体的列表显示如下表1 具有PL序列的NMDA受体
名称 “IGI或Acc# |C末端20mer序列|C末端4mer |PL |内部PL ,
I序列备ID
NMDARl 307302 HPTDITGPLNLSDPSVST STVV』X AA216^
VV (SEP ID NO: 13) (SEQ ID
____NO:27)
NMDARW 292282 HPTDITGPLNLSDPSVST STVV_X AA216^
VV rSE(3IDNOil3) (SEP ID ι_lNO:27)
权利要求
1.治疗或预防由兴奋性神经毒性介导的疾病的方法，所述方法包括给患病或具有患病风险的受试者施用抑制PSD-95与NMDAR 2B的结合和/或PSD-95与nNOS的结合的药剂，其中当药剂为具有氨基酸序列YGRKKRRQRRRKLSSIESDV(SEQ ID NO 6)的肽时，剂量为2_;3mg/ kg,如果药剂不是具有氨基酸序列YGRKKRRQRRRKLSSIESDV的肽，则剂量递送与2_;3mg/kg 具有氨基酸序列YGRKKRRQRRRKLSSIESDV的肽等效的有效浓度的该药剂。
2.权利要求1的方法，其中药剂为具有氨基酸序列YGRKKRRQRRRKLSSIESDV(SEQID NO:6)的肽，剂量为2.6mg/kg。
3.权利要求1的方法，其中每疾病发作期，该剂量施用一次。
4.权利要求1的方法，其中施用该剂量，不共施用抗炎药。
5.治疗或预防由兴奋性神经毒性介导的疾病的方法，所述方法包括给患病或具有患病风险的受试者施用抑制PSD-95与NMDAR 2B的结合和/或PSD-95与nNOS的结合的药剂， 其中药剂与内化肽连接，且通过静脉内输注5-15分钟来施用该药剂。
6.权利要求5的方法，其中与内化肽连接的药剂为具有氨基酸序列 YGRKKRRQRRRKLSSIESDV (SEQ ID NO :6)的肽，且输注时间为 5 分钟。
7.权利要求6的方法，其中药剂的剂量为lmg/kg以上。
8.权利要求6的方法，其中药剂的剂量为2-;3mg/kg。
9.权利要求6的方法，其中药剂的剂量为2.6mg/kg。
10.权利要求6的方法，其中剂量不超过50mg/kg，条件是如果剂量大于:3mg/kg，则与抗炎药共施用该剂量。
11.权利要求5的方法，其中施用该剂量，不共施用抗炎药。
12.权利要求5的方法，其中受试者患有中风。
13.权利要求5的方法，其中受试者正经历手术。
14.权利要求13的方法，其中受试者正经历血管内手术以治疗动脉瘤。
15.抑制缺血性损伤的方法，所述缺陷性损伤来自对连接脑和心脏或向肢体、肾脏、视网膜或脊髓供血的血管进行的血管内手术或神经手术，所述方法包括对经历血管的血管内手术或神经手术的受试者按有效方案施用抑制PSD-95与NMDAR 2B的结合的化学剂。
16.权利要求15的方法，其中缺血性损伤来自神经手术，所述神经手术为诊断性脑血管造影术。
17.权利要求15的方法，其中缺血性损伤来自神经手术，所述神经手术为治疗动脉瘤的血管内手术。
18.权利要求15的方法，其中化学剂在血管内手术之前施用。
19.权利要求15的方法，其中化学剂在血管内手术完成的1小时内施用。
20.权利要求15的方法，其中血管内手术包括将线圈置入动脉瘤中。
21.权利要求15的方法，其中血管内手术包括将支架置入有动脉瘤的血管中。
22.权利要求15的方法，其中血管内手术包括插入微导管。
23.对药剂进行临床试验的方法，所述方法包括给在脑血管上或在连接脑和心脏或向肢体、视网膜、肾脏或脊髓供血的血管上接受血管内手术的受试者的群体施用药剂；并将这些受试者中手术的损伤效应的频率与接受血管内手术而没有施用药剂的对照受试者进行比较，以确定药剂是否降低了损伤效应。
24.权利要求23的方法，其中受试者正经历脑动脉瘤的血管内手术。
25.权利要求23的方法，其中通过脑梗死的数量和/或大小来评估损伤效应。
26.权利要求23的方法，其中通过视网膜、肾脏、脊髓或肢体中梗死的数量和/或大小来评估损伤效应。
27.权利要求23的方法，所述方法还包括在中风的动物模型中测试药剂。
28.权利要求23的方法，所述方法还包括在患有中风的人受试者中测试药剂。
29.权利要求23的方法，所述方法还包括对用于治疗中风的药剂进行标记。
30.权利要求23的方法，其中药剂抑制PSD95与NMDAR2B的结合和/或PSD-95与 nNOS的结合。
31.测试药剂的方法，包括a.将微粒置入灵长类动物的脑血管中；b.给灵长类动物施用药剂；c.将步骤(a)中灵长类动物的损伤效应与没有以化合物治疗的对照灵长类动物进行比较。
32.权利要求31的方法，其中通过梗死的数量和/或大小来评估损伤效应。
33.权利要求31的方法，其中通过MRI或CAT扫描来确定梗死。
34.权利要求31的方法，其中通过与对照灵长类动物比较该灵长类动物的行为症状来评估损伤效应。
35.权利要求31的方法，所述方法还包括在恢复期后对相同灵长类动物重复步骤 (a)-(c)，条件是在重复步骤(a)-(c)中测试的药剂可以与在之前实施步骤(a)-(c)时的相同或不同。
36.权利要求31的方法，所述方法还包括重复步骤(a)-(c)，但对照灵长类动物接受药齐U，以前接受药剂的动物为对照动物。
37.权利要求31的方法，其中药剂抑制PSD-95与NMDAR2B的结合和/或PSD-95与 nNOS的结合。
38.权利要求31的方法，所述方法还包括对人中风受试者施用药剂。
39.权利要求31的方法，所述方法还包括对经历动脉瘤的血管内手术的人受试者施用药剂。
40.权利要求31的方法，其中在向脑血管中置入微粒之后施用药剂。
41.权利要求31的方法，其中在向脑血管中置入微粒之前施用药剂。
42.权利要求31的方法，其中微粒为100微米的聚苯乙烯球体。
43.权利要求42的方法，其中对灵长类动物施用20个球体。
44.权利要求31的方法，其中灵长类动物为猕猴。
45.冻干的组合物，所述组合物包含具有氨基酸序列YGRKKRRQRRRKLSSIESDV(SEQID NO 6)的肽，其从在GMP条件下制备的肽于生理盐水中的溶液冻干而来。
46.储存药物组合物的方法，所述方法包括将包含具有氨基酸序列 YGRKKRRQRRRKLSSIESDV(SEQ ID NO 6)的肽的药物组合物，以于生理盐水中10_30mg/ml的浓度，在GMP条件下于低于0°C储存至少2年的时间。
47.权利要求46的方法，其中浓度为18-20mg/ml。
48.权利要求46或47的方法，所述方法还包括对受试者施用药物组合物。
全文摘要
本发明提供用于评估化学剂在治疗和预防中风以及其它神经疾病，特别是至少部分地由兴奋性神经毒性介导的疾病，中的潜在用途的动物模型和临床试验。本发明也提供此化学剂临床应用的优选剂量、输注方案和药物组合物。
文档编号A61K38/16GK102458441SQ201080035246
公开日2012年5月16日 申请日期2010年6月10日 优先权日2009年6月10日
发明者J·D·加曼, M·蒂米安斯基 申请人:诺诺公司