专利名称：：酪蛋白来源的蛋白酶抑制肽的制作方法
技术领域：
：本发明涉及抑制蛋白酶活性的化合物、肽、肽模拟物和药物组合物，以及这些化合物、肽、肽模拟物和药物组合物治疗或预防疾病状态的用途。特别是，所述疾病状态是牙周病。本申请要求澳大利亚临时申请第20099(^841号的优先权，该申请在此通过援引整体并入。
背景技术：
：牙周病是牙齿支持组织的细菌相关的炎性疾病，并且是主要的公众健康问题。几乎所有的人群在某种程度上都患有牙周病。据1989年美国牙齿健康调查(DentalHealthsurvey)的报道，85%的研究人群患有牙周病。牙周病的主要形式是牙龈炎，其与牙菌斑在龈缘的非特异性聚集有关。牙周病更具破坏性的形式(牙周炎)与特定革兰氏阴性细菌的龈下感染有关。与这种疾病有关的主要细菌病原体称为“红色复合体”，其由福赛斯坦纳菌(Tannerellaforsythia)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)以及齿柜密螺旋体(Tr印onemadenticola)构成。牙龈卟啉单胞菌是慢性牙周炎的主要发病原因。牙龈卟啉单胞菌的主要毒力因子被认为是其细胞外半胱氨酸蛋白酶，统称为牙龈菌蛋白酶。最常见的是RgpA和RgpB(Arg-牙龈菌蛋白酶)以及Kgp(Lys-牙龈菌蛋白酶)。Arg-牙龈菌蛋白酶在Arg残基的羧基侧切割，而Lys-牙龈菌蛋白酶在Lys残基的羧基侧切割。据了解这些细胞结合的半胱氨酸蛋白酶对蛋白降解从而提供用于生长以及存活或毒力的其它固有和外在功能的肽至关重要。这些存活和毒力功能中有一些功能可以是对宿主组织的细菌粘附、血细胞凝集以及细菌细胞表面蛋白和分泌蛋白的加工。RgpA和Kgp的催化结构域可以作为复合体与一系列非共价结合的序列相关血凝素/粘附素结构域结合于细胞表面，而RgpB已被证实不是作为蛋白酶粘附素复合体的一部分存在，并且仅由催化结构域构成。存在几种抑制牙龈菌蛋白酶的天然来源的和合成的分子。通过筛选生物活性产物，已经发现了牙龈菌蛋白酶的天然抑制剂，而基于蛋白酶活性位点和蛋白酶抑制剂的结构，已经合成了几种合成抑制剂。例如，已经从蔓越莓汁[特别是多酚和高分子量不可透析组分(NDM)]、绿茶儿茶酚和大蒜中分离了Arg-和Lys-牙龈菌蛋白酶抑制剂。这些抑制剂都具有一种或多种问题，如它们是合成的、生成成本昂贵、具有无法接受的味道或未获得许可用于人类。存在对更好的或可选的与各种疾病特别是牙周病发病机理有关的细菌酶的抑制剂的需要。在说明书中对任何现有技术的参考，不是且不应认为，是以任何形式承认或表示该现有技术在澳大利亚形成公知常识的一部分或任何其他权限，或合理地期望本领域技术人员将该现有技术确定、理解以及认为相关。发明概述根据本发明，提供了用于抑制、降低或防止细菌酶活性的化合物、肽或肽模拟物，所述化合物、肽或肽模拟物包含酪蛋白的氨基酸序列或其片段。在一实施方案中，酶可以是胞外蛋白酶。在具体实施方案中，胞外蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶，如牙龈菌蛋白酶。在某些实施方案中，蛋白酶是RgpA、RgpB或Kgp。在某些实施方案中，所述化合物、肽或肽模拟物包含选自以下的氨基酸序列LeuProGlnGluValLeuAsnGluAsnLeuLeuArgPhe(SEQIDNO1)；TyrGlnGluProValLeuGlyProValArgGlyProPheProlielieVal(SEQIDNO2)；ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:3)；TyrGlnGluProValLeuGlyProValArgGlyProPhe(SEQIDNO:4)；ThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:5)。在其他实施方案中，所述化合物、肽或肽模拟物包含还选自以下的氨基酸序列LeuProGlnGlyValLeuAsnGluAsnLeuLeuArgPhe(SEQIDNO:6)；LeuSerProGluValLeuAsnGluAsnLeuLeuArgPhe(SEQIDNO:7)；LeuSerSerGluValLeuAsnGluAsnLeuLeuArgPhe(SEQIDNO:8)；TyrGlnGluProValLeuGlyProValArgGlyProPheProlieLeuVal(SEQIDNO9)；ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProThrlieGlu(SEQIDNO:10)；ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProlieThrGlu(SEQIDNO:11)；ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThr(0-连接的GalNAc)ProThrThrGlu(SEQIDNO:12)；ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThr(0-连接的GalNAc)krThrProThrThrGlu(SEQIDNO:13)；ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProThrThr(0-连接的GalNAc)Glu(SEQIDNO:14)；ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThr(0_连接的GalNAc)lieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:15)；ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSer(P)GlyGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:16)；ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThrIleAsnThrlieValSerGlyGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:17)；ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerValGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:18)；ProProLysLysAspGlnAspLysThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:19)；4ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerAlaGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:20)；ProProLysLysAspGlnAspLysThrGluValProAlalieAsnThrlieAlaSerAlaGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:21)；ThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProThrlieGlu(SEQIDNO:22)；ThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProlieThrGlu(SEQIDNO:23)；ThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThHO-连接的GalNAc)ProThrThrGluSEQIDNO:24)；ThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThr(0-连接的GalNAc)SerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:25)；ThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProThrThr(0-连接的GalNAc)Glu(SEQIDNO:26)；ThrGlulieProThr(0_连接的GalNAc)lieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:27)；ThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSer(P)GlyGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:28)；ThrGlulieProThrlieAsnThrlieValSerGlyGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:29)；ThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerValGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:30)；ThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerAlaGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:31)以及ThrGluValProAlalieAsnThrlieAlaSerAlaGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:32)。在其他实施方案中，所述化合物、肽或肽模拟物包含SEQIDNOs1-32中的保守取代。这些取代在下文进一步描述。在某些实施方案中，本发明的肽或肽模拟物的长度为至少13个氨基酸。在其他实施方案中，肽或肽模拟物的长度为70个氨基酸或更少。在某些实施方案中，肽或肽模拟物的长度为15-61个氨基酸。在其他实施方案中，肽或肽模拟物的长度为20-30个氨基酸。在其他实施方案中，化合物、肽或肽模拟物是非磷酸化或非糖基化的。在另一形式中，化合物、肽或肽模拟物是翻译后修饰的。例如，化合物、肽或肽模拟物可以仅磷酸化或仅糖基化，或既磷酸化又糖基化。可以以此方式修饰一个或多个残基。在具体实施方案中，化合物、肽或肽模拟物由选自SEQIDNOs:1_32(包括端点)中任一个的氨基酸序列组成或基本上由选自SEQIDNOs:1-32(包括端点)中任一个的氨基酸序列组成。在这些实施方案中，包括SEQIDNOs1-32以及其他氨基酸残基的化合物、肽或肽模拟物“基本上由SEQIDNOs:1-32组成”，只要其表现出抑制、降低或防止细菌酶的活性，这可以根据下文所述的测定确定。同样，化合物、肽或肽模拟物“基本上由SEQIDNO:1-32之一”组成，其中其比相应的SEQID(序列标识)短，只要其表现出抑制、降低或防止细菌酶的活性，这可以根据下文所述的测定确定。因此这些实施方案不包括全长酪蛋白序列。在其他实施方案中，本发明的化合物、肽或肽模拟物包含与选自SEQIDNOs:1_32的氨基酸序列60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%相同的氨基酸序列。在其他实施方案中，化合物、肽或肽模拟物基本上由这类氨基酸序列组成。在一些实施方案中，本发明的化合物、肽或肽模拟物包含与选自SEQIDNOs1-5的氨基酸序列60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，提供了用于抑制、降低或防止细菌酶活性的化合物、肽或肽模拟物，所述化合物、肽或肽模拟物包含能形成螺旋结构并且非竞争性抑制、降低或防止细菌酶活性的氨基酸序列。在其他实施方案中，当酶与底物相互作用时，所述化合物、肽、肽模拟物例如通过与所述酶、底物或酶和底物两者结合抑制、降低或防止所述酶由所述底物产生产物。在另一实施方案中，本发明提供了用于抑制、降低或防止有需要的患者口腔中牙龈卟啉单胞菌酶活性的治疗肽，所述治疗肽选自SEQIDNO=USEQIDNO:2和SEQIDNO:3，或以上的糖基化和磷酸化变体和缺失和取代突变体。在一些实施方案中，SEQIDNO1的变体和突变体选自SEQIDNO6,SEQIDNO:7和SEQIDNO:8。在一些实施方案中，SEQIDNO2的变体和突变体选自SEQIDNO:4和SEQIDNO:9。在一些实施方案中，SEQIDNO3的变体和突变体选自SEQIDNO5和SEQIDNOs:10_32。在某些实施方案中，提供了抑制细菌酶的组合物，其包含本发明的化合物、肽或肽模拟物以及药学上可接受的载体。在一些实施方案中，组合物还包含二价阳离子。在一实施方案中，提供了治疗或预防一种或多种疾病状态的方法，其包括给予有需要的个体有效量的本发明的化合物、肽或肽模拟物。在一实施方案中，将所述化合物、肽或肽模拟物或组合物直接给予个体的牙龈。在一实施方案中，所述化合物、肽或肽模拟物可以是可应用于口的组合物的一部分，所述组合物如包括牙膏(toothpaste)、牙粉、液态洁牙剂在内的洁牙剂、漱口水、锭剂、口香糖、牙膏(dentalpaste)、牙龈按摩膏、漱口片、乳制品和其他食品。适合治疗或预防的疾病状态或疾病的实例包括牙周病和龋齿。根据本发明，由牙龈菌蛋白酶的酶活性引起的或与其有关的任何疾病或疾病状态，都可以适合治疗或预防。需要治疗或有发展成牙周病或龋齿风险的个体是动物。在一些实施方案中，个体是人、犬、猫、马、绵羊或牛。在另一实施方案中，提供了治疗或缓解个体的牙周病症状的方法，其包括给予所述个体本发明的化合物、肽、肽模拟物或组合物。根据一些实施方案，提供了抑制细菌酶的方法，其包括使酶与包含化合物、肽或肽模拟物的组合物接触，所述化合物、肽或肽模拟物包含选自SEQIDNos:1-5中任一个的氨基酸序列和其中的保守取代或基本上由其组成或由其组成，如选自SEQIDNos1-32的氨基酸序列和与SEQIDNos1-32至少60%相同的氨基酸序列。在具体实施方案中，化合物、肽或肽模拟物的氨基酸序列不包含全长酪蛋白序列。根据这些实施方案中的任何一个，细菌酶可以是牙龈菌蛋白酶，如来自牙龈卟啉单胞菌的牙龈菌蛋白酶。根据这些实施方案中的任何一个，接触步骤可以包括给予有需要的个体(如人)所述组合物，如需要治疗或有发展成龋齿风险的个体。根据这些实施方案中的任何一个，所述方法可以有效治疗或缓解牙周病或龋齿的症状。在另一实施方案中，本发明的方法还包括给予选自抗炎剂、与牙龈卟啉单胞菌或牙龈卟啉单胞菌所表达的蛋白结合的抗体、抗生素和抗生物膜剂的试剂。抗生素可以选自阿莫西林、强力霉素和甲硝哒唑。抗炎剂包括非类固醇抗炎药(NSAID)。NSAID的实例包括除了抑制环氧合酶的化合物。NSAID的具体实例包括阿司匹林、布洛芬和萘普生。抗生物膜剂的实例是延胡索酸还原酶的抑制剂如奥克太生(oxantel)。在另一实施方案中，本发明提供了有效量的本发明的化合物、肽、肽模拟物或组合物在制备用于治疗或预防牙周病和/或本文确定为适合治疗的其他疾病状态的药物中的用途。本方面还提供了用于治疗或预防牙周病(和/或上文确定为适合治疗的其他疾病状态)的药物组合物，其包含有效量的本发明的化合物、肽或肽模拟物以及药学上可接受的载体。组合物还可以包含选自抗炎剂、与牙龈卟啉单胞菌或来自牙龈卟啉单胞菌的蛋白结合的抗体、抗生素和抗生物膜剂的试剂。抗生素可以选自阿莫西林、强力霉素和甲硝哒唑。根据一些实施方案，提供了包含化合物、肽或肽模拟物的药物组合物，所述化合物、肽或肽模拟物包含有效抑制个体中细菌酶的量的酪蛋白的氨基酸序列或酪蛋白氨基酸序列的抑制细菌酶的片段，基本上由其组成或由其组成，如选自SEQIDNos:1-5中任一个和其中的保守取代或SEQIDNos1-32和与SEQIDNos1-32至少60%相同的序列的氨基酸序列。在具体实施方案中，所述化合物、肽或肽模拟物的氨基酸序列不包含全长酪蛋白序列。根据这些实施方案中的任何一个，组合物还包含诸如锌的二价阳离子和/或选自抗炎剂、抗生素、抗生物膜剂和与牙龈卟啉单胞菌或牙龈卟啉单胞菌所表达的蛋白结合的抗体的试剂。根据这些实施方案中的任何一个，可以将所述组合物配制成向牙龈局部给药和/或可以将其以单位剂量的形式提供。在另一实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防牙周病(和/或上文确定为适合治疗的其他疾病状态)的组合物，其包含作为活性成分的本发明的化合物、肽或肽模拟物。所述组合物还可以包含二价阳离子。在另一实施方案中，本发明提供了包含作为主要成分的有效量的本发明的化合物、肽或肽模拟物的药物组合物。所述组合物可以用于例如治疗或预防牙周病和/或上文确定为适合治疗的其他疾病状态。在一些实施方案中，所述组合物还包含二价阳离子。在另一实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防牙周病和/或上文确定为适合治疗的其他疾病状态的本发明的化合物、肽或肽模拟物。在另一实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防牙周病的组合物，其包含本发明的化合物、肽或肽模拟物。在一些实施方案中，所述组合物还包含二价阳离子。在另一方面，本发明提供了组件试剂盒(kitofparts)，其包含(a)本发明的化合物、肽、肽模拟物或组合物和(b)药学上可接受的载体。在某些实施方案中，二价阳离子选自ai2+、Ca2+、CU2+、Ni2+、C02+、i^2+、Sn2+和Mn2+。另夕卜，二价阳离子可以与氟化物结合，如SnF+和CuF+。在一些实施方案中，二价阳离子是Ca2+或Si2+。在某些实施方案中，二价阳离子与所述化合物、肽或肽模拟物的比例范围为1.02.0-1.010.0，如1.04.0。如本文所用，除非上下文另有要求，否则术语”包含(comprise)”和所述术语的变形如”包含(comprising)”、”包含(comprises)”和”包含(comprised)”并非意图排除其他添加物、成分、整体或步骤。附图简要说明图1在具有合成的αS1-酪蛋白(11-23)(Π)、β-酪蛋白(193-205)(□)、β-酪蛋白(193-209)(曰)和κ-酪蛋白(109-137)(S)肽的情况下，牙龈卟啉单胞菌ATCC33277全细胞的Arg特异性蛋白水解活性。用2个独立的细菌培养物和3次技术重复进行测定。测定中细胞的平均数量为4.0E+08cfu/mL。图2在具有合成的asl-酪蛋白(11-23)(Π)、β-酪蛋白(193-209)(Ξ)和κ-酪蛋白(109-137)(目)肽的情况下，牙龈卟啉单胞菌ATCC33277全细胞的Lys特异性蛋白水解活性。用2个独立的细菌培养物和3次技术重复进行测定。测定中细胞的平均数量为4.0E+08cfu/mLo图3在具有100μM合成的酪蛋白来源的肽的情况下，纯化的复合体的Arg-(B)和Lys特异性(Β)蛋白水解活性。用6次技术重复进行测定。图4在具有几种浓度的κ-酪蛋白(109-137)的情况下，纯化的RgpB的蛋白水解活性。RgpB的浓度为0.23μg/μL。图5利用荧光BSA底物(DQTMBSA)和500μM酪蛋白肽测量的牙龈卟啉单胞菌ATCC33277全细胞的Arg和Lys特异性蛋白酶活性。κ-酪蛋白(106-169)是天然来源的，而其他κ-酪蛋白肽是合成的。误差条计算为3次技术重复和2个生物复制品的标准偏差。所有肽均显著不同于(P<0.05)对照值。κ-酪蛋白(117-123)和κ-酪蛋白(127-137)彼此没有显著不同(P<0.05)，但是与其余的肽显著不同。κ-酪蛋白(106-169)显著不同于κ-酪蛋白(106-137)，而非显著不同于κ-酪蛋白(109-137)或κ-酪蛋白(117-137)。κ-酪蛋白(106-137)显著不同于除了κ-酪蛋白(117-137)以外的所有肽。κ-酪蛋白(109-137)显著不同于除了κ-酪蛋白(106-169)以外的所有肽。图6测定中，在ImM半胱氨酸浓度，具有合成的κ-酪蛋白(109-137)肽和SiCl2的情况下，牙龈卟啉单胞菌ATCC33277全细胞的Arg特异性蛋白水解活性。用3个独立的细菌培养物和4次技术重复进行测定。图7测定中，在ImM半胱氨酸浓度，具有合成的κ-酪蛋白(109-137)肽和SiCl2的情况下，牙龈卟啉单胞菌ATCC33277全细胞的Lys特异性蛋白水解活性。用2个独立的细菌培养物和3次技术重复进行测定。图8测定中，在ImM半胱氨酸浓度，具有合成的κ-酪蛋白(109-137)肽和SiCl2的情况下，纯化的蛋白复合体的Arg-和Lys-特异性(口)蛋白水解活性。用6次技术重复进行测定。图9测定中，在ImM半胱氨酸浓度，具有合成的asl-酪蛋白(11-23)肽(Π)、β-酪蛋白(193-209)(S)和SiCl2的情况下，牙龈卟啉单胞菌ATCC33277全细胞的Arg特异性蛋白水解活性。图10测定中，在ImM半胱氨酸浓度，具有合成的asl_酪蛋白(11-23)肽(Π)、β-酪蛋白(193-209)(S)和S1Cl2的情况下，牙龈卟啉单胞菌ATCC33277全细胞的Lys特异性蛋白水解活性。用2个独立的细菌培养物和3次技术重复进行测定。图11浓度为0μM(―X——)、25μM(—~)、50μM(―)、75μM(和100μΜ(~X~)的K-酪蛋白(109-137)肽和浓度为0.15、0·25和1.OmM的底物BapNA抑制纯化的RgpB的莱恩威佛-伯克图(Lineweaver-Burkplot)。图12评价κ-酪蛋白(109-137)肽抑制RgpB的抑制常数(Ki)的第二个图表。与每组点有关的线表示各个数据组的线性回归分析。将&评估为回归线的负截距。图13κ-酪蛋白(109-137)和人丝氨酸/半胱氨酸蛋白酶抑制剂G进化枝成员1剪接变体3(Q5UGI5)、血浆丝氨酸蛋白酶Cl抑制剂(P0515Q和推断的丝氨酸蛋白酶抑制剂(KU家族)(A3LQ30)的BLAST序列比对。图14:β-酪蛋白(193-209)与人丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal型5短同种型(Q3LX95)、人丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal-型5(Q9NQ38)、人抑弹性蛋白酶蛋白(弹性蛋白酶特异性抑制剂)(Ρ19957)和人ΡΙ3蛋白(肽酶抑制剂3、皮肤来源的(SKALP)、同种型CRAa)(Q6FG74)的BLAST序列比对。图15αS1_酪蛋白(11-23)与ATP依赖性Clp蛋白酶ATP-结合亚基clpX(P50866)、丝氨酸蛋白酶(Q1NE66)和ATP依赖性锌金属蛋白酶017VHT4)的BLAST序列比对。图16所提出的反竞争性抑制剂模型，E=Arg-或Lys-牙龈菌蛋白酶、S=BapNA或GPKNA底物、I=κ-酪蛋白(109-137)肽和P=ρ-硝基酰基苯胺产物。图17:a)参与与κ-酪蛋白(109-137)、Si(II)以及底物(BapNA)相互作用的RgpB活性位点的残基。RgpB的His211和G1u152、k-酪蛋白(109-137)的Aspll5(Asp7)和Glull8(GlulO)与Si(II)的静电相互作用突出显示。肽的Ilel22(Ilel4)与BapNA底物的疏水相互作用也突出显示。RgpB的Trp284和Cys244分别与底物的Arg残基以及酰胺键形成相互作用。b)在存在Si(II)的情况下，所提出的结合于RgpB=BapNA复合体的κ-酪蛋白(109-137)的分子模型。发明的详细描述应当理解的是，本说明书中公开和限定的本发明延伸至所提到的或根据正文或附图显而易见的两个或多个个体特征的所有可选组合。所有这些不同组合构成了本发明的各种可选方面。表现出蛋白酶抑制性的化合物、肽或肽模拟物可以用于口腔护理产品、功能食品和药物中。本发明鉴定了新的乳酪蛋白肽，其特征是具有牙龈卟啉单胞菌胞外蛋白酶抑制活性。这些肽可以合成产生或由乳酪蛋白的酶促消化获得。可以从来自多种物种的乳酪蛋白获得肽，包括人、牛、山羊和绵羊。牛乳酪蛋白是已知对进一步的蛋白水解分解具有相对抗性的蛋白的天然来源。牛乳在消化后，可在人的小肠的远端部分和血液中检测到它们。这些肽具有几个优势，包括但不限于它们可以来源于天然来源，不具有可感知的味道、并且当组合使用时可以掩盖二价阳离子如锌的味道。肽包含选自以下的氨基酸序列asl-酪蛋白(11-23)-(SEQIDNO1)β-酪蛋白(193-20-(SEQIDNO2)κ-酪蛋白(109-137)-(SEQIDNO3)β-酪蛋白(193-20-(SEQIDNO4)κ-酪蛋白(117-137)-(SEQIDNO:5)。本发明还包括SEQIDNO:1-5的氨基酸序列的功能片段。功能片段是比对应于SEQIDNO:1-5的氨基酸序列短但仍然保留了SEQIDNO:1_5的相应氨基酸序列的功能的氨基酸序列。通过例如利用外肽酶缩短氨基酸序列，或通过合成更短的氨基酸序列并随后检测任何蛋白酶抑制活性，如通过下文实施例所示的方法，能够很容易地确定功能片段。SEQIDNO:1-5的氨基酸序列的变体也在本发明的范围内，所述变体对应于衍生SEQIDNOS1-5的牛酪蛋白的直系同源和旁系同源蛋白的片段。如果序列被基因复制事件隔离，则序列是“旁系同源的”如果生物体中的基因经复制占据同一基因组的2个不同位置，则2个拷贝是旁系同源的。如果序列被物种形成事件隔离，则序列是“直系同源的”当一个物种分化为2个单独的物种时，则认为所产生的物种中的单基因的分化拷贝是直系同源的。本发明范围内的另一组变体是含有翻译后修饰的SEQIDNO:1_5的氨基酸序列。具体的翻译后修饰是磷酸化和糖基化。为了说明这些修饰，牛酪蛋白的许多已知的遗传变体作为以下而著称A.asl-酪蛋白1.%1-酪蛋白父3-9卩(遗传变体-八、8、(、03、卩、6和《)2.aS1-酪蛋白片段B.aS2-酪蛋白1.%2-酪蛋白^-15卩(遗传变体4、8、(、0)2.aS2-酪蛋白Xa-9P(f51_207)(遗传变体_A、C)3.αS2-酪蛋白Xa-5P(f65"203)(遗传变体-A、C)C.β-酪蛋白1.日-酪蛋白父3-5卩(遗传变体-八1、八2、八3、8、(、0』、卩、6、!11、硭和12.β-酪蛋白Xa-IP(f29-209)(遗传变体-A1、A2、A3、B、C、Ε、F、G、H1、H2禾口I)3.3-酪蛋白13-(打06-209)(遗传变体-八2、六3、8、卩、6、硭)4.β-酪蛋白Xa-(f108-209)(遗传变体-A2、B、F、G和H2)5.3-酪蛋白父3-4卩(打-28)(遗传变体-六2、0和庄)6.3-酪蛋白父3-5卩(打-105)(遗传变体-八1、六2、8、(、0』、卩、6、!11、硭和1)7.β-酪蛋白Xa-5P(f1-107)(遗传变体-A1、A2、A3、B、C、D、Ε、F、G、H1、H2禾口I)8.旦-酪蛋白父^卟江四-^^^遗传变体-八1]2』^』』；、!!1、!!2*!)9.β-酪蛋白Xa-IP(f29-107)(遗传变体-A1、A2、A3、B、C、Ε、F、G、H1、H2禾口I)D.k-酪蛋白1.1^-酪蛋白父3-2卩(遗传变体-八、8、(』、卩1、产、61、62、!1、1和了)2.κ-酪蛋白Xa-2P(fl06-169)(遗传变体-AJaEJ^F^G^G2和J)3.κ-酪蛋白Xa-2P(fll7-169)(遗传变体-AJaEaF^F^G^G2和J)aX表示遗传变体，其中遗传变体可以是下列括号中所说的任一变体。上文的名称描述了酪蛋白的已知变体，例如β-酪蛋白B-lP(f29_209)表示，蛋白是酪蛋白β家族的一部分，是B遗传变体，含有可以被磷酸化的氨基酸残基，并且是β-酪蛋白蛋白的从残基四到残基209的片段。已知的是，在这些蛋白中的氨基酸易于磷酸化。酪蛋白变体的名称和其他描述记载于Farrelletal.NomenclatureofProteinsofCow，sMilk(牛乳蛋白名称)-SixthRevision(第6次修订).JournalofDairyScience(2004)87:1641-1674中。因此，对应于SEQIDNO:1_5的氨基酸序列的这些序列的片段是变体，并且形成所公开的本发明的一部分。因为认为导致肽的蛋白酶抑制活性的是所述肽的物理性质而不是所述肽的具体序列，因此可以在肽序列中进行所谓的保守取代，而不会大量损失活性。在未限制本发明的情况下，在一些实施方案中，肽或肽模拟物的高达25%的氨基酸是保守取代的。意图是，将不会导致大量损失活性的此类保守取代包括于本发明内。尽管本领域技术人员完全理解上文提到的保守取代的概念，但是为了清楚，保守取代是下文所列的保守取代。Gly,Ala,Val,lie,Leu,Met；Asp,Glu,Ser；Asn,Gln；Ser,Thr；Lys,Arg,His；Phe，Tyr，Trp；以及Pro,Na-碱性氨基酸。本领域技术人员已知的是，氨基酸的极性、带电荷的(+)、带电荷的㈠或脂肪族组的一成员被同一组的另一成员的任何取代，都可以是保守取代。为了举例说明这些其他实施方案(并未限制本发明)，提供了下述序列asl-酪蛋白(11-23)，LeuProGlnGluValLeuAsnGluAsnLeuLeuArgPhe(SEQIDNO1)(家牛(Bosaurus)(牛(cow)))LeuProGlnGlyValLeuAsnGluAsnLeuLeuArgPhe(SEQIDNO:6)(水牛(Bubalusbubalis)(家养水牛(Domesticwaterbuffalo)))LeuSerProGluValLeuAsnGluAsnLeuLeuArgPhe(SEQIDNO:7)(山羊(Caprahircus)(山羊(Goat)))LeuSerSerGluValLeuAsnGluAsnLeuLeuArgPhe(SEQIDNO:8)(绵羊(Ovisaries)(绵羊(Sheep)))β-酪蛋白(193-209)，TyrGlnGluProValLeuGlyProValArgGlyProPheProlielieVal(SEQIDNO:2)(家牛(牛))TyrGlnGluProValLeuGlyProValArgGlyProPheProlieLeuVal(SEQIDNO9)(山羊(Caprahircus)(山羊(Goat))、绵羊(0visaries)(绵羊(Sheep)))β-酪蛋白(193-205)，TyrGlnGluProValLeuGlyProValArgGlyProPhe(SEQIDNO:4)(家牛(牛))κ-酪蛋白(109-137)，ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:3)(家牛(牛))ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProThrlieGlu(SEQIDNO:10)(非洲野牛(Synceruscaffernanus)(森林水牛(ForestBuffalo)))ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProlieThrGlu(SEQIDNO:11)(瘤牛(Bosindicus)(瘤牛(Zebu)))ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThr(0-连接的GalNAc)ThrThrGlu(SEQIDNO:12)(家牛(牛))ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThr(0-连接的GalNAc)krThrProThrThrGlu(SEQIDNO:13)(家牛(牛))ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProThrThr(0-连接的GalNAc)Glu(SEQIDNO:14)(家牛(牛))ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThHO-连接的GalNAc)lieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:15)(家牛(牛))ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSer(P)GlyGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:16)(家牛(牛))ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThrIleAsnThrlieValSerGlyGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:17)(水牛(家养水牛))ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerValGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:18)(水牛(家养水牛))ProProLysLysAspGlnAspLysThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:19)(美洲雪羊(Oreamnosamericanus)(里予生山羊))ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerAlaGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:20)(美洲雪羊(野生山羊))ProProLysLysAspGlnAspLysThrGluValProAlalieAsnThrlieAlaSerAlaGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:21)(山羊(Caprahircus)(山羊(Goat))、绵羊(Ovisaries)(绵羊(Sheep)))κ-酪蛋白(117-137)，ThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:5)(家牛(牛))ThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProThrIleGlu(SEQIDNO:22)(非洲野牛(森林水牛))ThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProlieThrGlu(SEQIDNO:23)(瘤牛(瘤牛))ThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThHO-连接的GalNAc)ProThrThrGlu(SEQIDNO:24)(家牛(牛))ThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThr(0-连接的GalNAc)SerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:25)(家牛(牛))ThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProThrThr(0-连接的GalNAc)Glu(SEQIDNO:26)(家牛(牛))ThrGlulieProThr(0_连接的GalNAc)lieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:27)(家牛(牛))ThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSer(P)GlyGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:28)(家牛(牛))ThrGlulieProThrlieAsnThrlieValSerGlyGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:29)(水牛(家养水牛))ThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerValGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:30)(水牛(家养水牛))ThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerAlaGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:31)(美洲雪羊(野生山羊))ThrGluValProAlalieAsnThrlieAlaSerAlaGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:32)(山羊(Caprahircus)(山羊(Goat))、绵羊(Ovisaries)(绵羊(Sheep)))(P)表示，前面的氨基酸是磷酸化的即kr(P)是磷酸化的丝氨酸氨基酸。(0-连接的(ialNAc)表示前面的氨基酸具有与氨基酸侧链羟基氧连接的N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)，即Thr(0-连接的(ialNAc)是具有与其侧链羟基氧连接的N-乙酰基半乳糖胺的苏氨酸氨基酸。其他聚糖可以连接于felNAc，从而使聚糖链的长度增加至包括二糖，例如Gal(βl_3)GalNAc，三糖例如NeuAc(α2-3)Gal(β1-3)GalNAc或Gal(β1-3)[NeuAc(a2_6)]GalNAc，和四糖例如NeuAc(α2-3)Gal(β1-3)[NeuAc(α2-6)]GalNac。本发明还提供了包含选自以下的氨基酸序列的化合物、肽或肽模拟物deptxptte(其中χ=tq或st),Qepvx1GpvrGPx2PIIx3I(其中&=l、n或Kx2=f、y或C禾口&=l、h或v)以及evlnenllrf。在这些实施方案中，本发明提供了化合物、肽或肽模拟物，其由选自SEQIDNos1-32(包括端点)中任一个的氨基酸序列组成，或基本上由选自SEQIDNos:1-32(包括端点)中任一个的氨基酸序列组成，但不包括全长酪蛋白序列。本领域技术人员应当理解的是，可以对SEQIDNos:1_32中任一个序列所限定的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸缺失，而不丧失所述化合物、肽或肽模拟物抑制、降低或防止蛋白酶活性的能力。在某些实施方案中，可以缺失高达25%的肽或肽模拟物，包括SEQIDNos:1_32，然而，所得的肽或肽模拟物必须保留抑制、降低或防止蛋白酶活性的能力。可以进行实验，包括本文所述的那些实验，来确定具有这样的氨基酸序列的化合物、肽或肽模拟物是否仍然能抑制、降低或防止蛋白酶活性，该氨基酸序列与SEQIDNos:1-32中任一个的区别在于一个或多个氨基酸的缺失。可以将本发明的化合物、肽、肽模拟物或组合物直接给予需要治疗或预防牙周病的个体的牙龈。在一些实施方案中，通常局部给予本发明的组合物，然而，本领域技术人员应当理解，也可以经肠胃外给予所述化合物、肽、肽模拟物或组合物，例如通过静脉内、腹膜内、肌肉内、鞘内或皮下注射。可选地，可以将本发明的化合物、肽、肽模拟物配制成用于口腔给药(包括舌下和颊)、肺部给药(鼻内和吸入)、透皮给药或直肠给药的组合物。需要治疗的个体可以是表现出牙周病的亚临床或临床症状的个体。牙周病的亚临床或临床表现包括牙龈的急性或慢性炎症。可以存在急性炎症的特点，包括血浆和白细胞从血液到受损组织的运动增加。也可以存在牙龈急性感染的临床病征，包括发红(红色)、灼热(热增加)、瘤(肿胀)、痛苦(疼)以及机能丧失(丧失功能)。慢性炎症的特征可以是白细胞(单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、血浆细胞)浸润。可以观察到组织和骨损失。需要治疗的个体的特征还可以是，存在于牙周部位的牙龈卟啉单胞菌细菌的水平增加，高于在无牙周病的个体中所观察到的正常范围。给药途径取决于许多因素，包括待给予的拮抗剂或组合物的属性，以及给个体疾病状态的严重程度。应当理解，本发明化合物、肽、肽模拟物的给药频率和所给予的本发明的化合物、肽、肽模拟物的量，在个体间可以变动，除了其他情况外，这还取决于个体中牙周病的阶段和进展。给药频率可以由医师决定。还考虑到，是牙龈菌蛋白酶或相关蛋白酶(例如其他半胱氨酸蛋白酶)的蛋白酶活性的结果或与其相关的任何疾病、疾病状态或综合征，可以通过本发明的化合物、肽、肽模拟物或组合物预防或治疗。此外，是牙周病的结果或与其相关的其他疾病、疾病状态或综合征也可以得到治疗，或者发展这些疾病、疾病状态或综合征的风险可以降低。例如，牙周病可以增加个体发展心血管疾病的风险。发展心血管疾病的这种增加风险可以通过给予患有牙周病的个体本发明的化合物、肽、肽模拟物或组合物来治疗牙周病而得到降低。“肽模拟物”是与本发明的肽具有基本相同的结构和/或功能特征的合成化合物，后者在下文有进一步的描述。通常，肽模拟物与本发明的肽具有相同或相似的结构，例如相同或相似的酪蛋白序列或其片段。肽模拟物通常含有至少一个非天然合成的残基。肽模拟物化合物的非天然成分可以基于下述的一种或多种a)除了天然酰胺键(肽键)连接以外的残基连接基团；b)替代天然存在的氨基酸残基的非天然残基；或c)诱导二级结构模拟物，即诱导或稳定二级结构的残基，所述二级结构如β转角、Y转角、β折叠、α螺旋构象寸。肽模拟物可以利用科技文献和专利文献所述的各种程序和方法合成，例如OrganicSynthesesCollectiveVolumes,Gilmanetal.(Eds)JohnWiley&Sons,Inc.，NY,al-0beidi(1998)Mol.Biotechnol.9:205-223；Hruby(1997)Curr.Opin.Chem.Biol.1114-119；Ostergaard(1997)Mol.Divers.3:17-27；Ostresh(1996)MethodsEnzymol.267220-234。本发明的化合物、肽或肽模拟物可以以药物组合物的形式给予。这些组合物可以在GMP条件下或在一些实施方案中通过常规混合、溶解、造粒、包糖衣(dragee-making)、研碎、乳化、装入胶囊、包封(entrapping)或冻干的方式制备。药物组合物可以利用一种或多种生理可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂配制。所述组分可以促进将肽或肽模拟物加工成可以药用的制品。用于治疗的给药可以是肠胃外、静脉内、口服、皮下、动脉内、颅内、鞘内、腹膜内、局部、鼻内或肌肉内给药。用于肠胃外给药的药物组合物通常是无菌的并且基本上是等渗的。也可以使用生理相容缓冲液，如汉克氏溶液(Hank'ssolution)、林格氏溶液(Ringer'ssolution)或生理盐水或乙酸盐缓冲液。溶液也可以含有悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。肽或肽模拟物可以以在使用前待溶解于溶剂中的粉末形式提供，所述溶剂如无菌无热源的水。有关肽或多肽序列即本文所定义的本发明的肽的“百分比氨基酸序列同一性)”或“百分比(％)相同”，被定义为，在比对序列并且如果需要引入缺口以实现最大百分比序列同一性，且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分后，候选序列中与具体肽或多肽序列即本发明的肽中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。本领域技术人员可以决定测量比对的适当参数，包括在被比较的序列的全长内实现最大比对所需的任何算法(下文描述了非限制性实例)。当比对氨基酸序列时，给定氨基酸序列A与、和或针对给定氨基酸序列B的百分比氨基酸序列同一性(可选地，其可以表述为，与、和或针对给定氨基酸序列B具有或包含一定百分比的氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)可以计算为百分比氨基酸序列同一性=X/Y100，其中X是利用A和B的序列比对程序或算法比对评分为相同匹配的氨基酸残基的数量，Y是B中氨基酸残基的总数。如果氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度，则A与B的百分比氨基酸序列同一性将会不等于B与A的百分比氨基酸序列同一性。在计算百分比同一性时，通常计算准确匹配。两条序列间百分比同一性的确定，可以利用数学算法完成。比较两条序列所用的数学算法的非限制性实例是，KarlinandAltschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264的算法，在KarlinandAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877中做了改进。将这种算法并入Altschuletal.(1990)J.Mol.Biol.215:403的LASTN和BLASTX程序。为了获得用于比较目的的带缺口的比对，可以利用Altschuletal.(1997)NucleicAcidsRes.25:3389所述的GappedBLAST(BLAST2.0)。可选地，可以用PSI-Blastan执行检测分子间疏远关系的迭代搜索。参阅Altschuletal.(1997)同上。当利用BLAST、GappedBLAST和PSI-Blast程序时，可以使用各自程序(如BLASTX和BLASTN)的缺省参数。比对也可以通过检查手动进行。比较序列所用的数学算法的另一非限制性实例是ClustalW算法(Higginsetal.(1994)NucleicAcidsRes.22:4673-4680)。ClustalW比较序列并比对氨基酸或DNA序列的全部，因此能够提供有关全部氨基酸序列的序列保守性的数据。ClustalW算法可以用于几个商业可利用的DNA/氨基酸分析软件包中，如VectorNTI程序组的ALIGNX模块(InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA)。在用ClustalW比对氨基酸序列后，可以评定百分比氨基酸同一性。可用于ClustalW比对分析的软件程序的非限制性实例是GENED0C或JalView(http:Ilwww,ialview.org/)。GENEDOC允许评定多个蛋白间的氨基酸(或DNA)相似性和同一性。用于比较序列的数学算法的另一非限制性实例是MyersandMiller(1988)CABIOS4:11-17的算法。将这一算法并入ALIGN程序(版本2.0)，其是第10版GCGWisconsinGenetics软件包(可从Accelrys，Inc.，9685ScrantonRd.，SanDiego,CA,USA获得)的一部分。当利用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以利用PAM120权重残基表、缺口长度罚分12和缺口罚分4。尽管本发明可以应用于人类，但是本发明也可以用于兽医目的。本发明用于治疗或预防如牛、绵羊、马的家畜和家禽、诸如猫和狗的伴生动物和动物园动物中的本文所述的疾病或疾病状态。可以制备含有上文所述的药物组合物的本发明的口腔组合物，并且可以以适用于口腔的各种形式使用，如包括牙膏、牙粉、液态洁牙剂在内的洁牙剂、漱口水、锭齐U、口香糖、牙膏、牙龈按摩膏、漱口片、乳制品和其他食品。本发明的口腔组合物还可以包含其他完全已知的组分，这取决于具体口腔组合物的类型和形式。任选地，组合物还包含一种或多种对革兰氏阴性厌氧菌有毒或抑制其生长的抗生素。潜在地，任何抑菌或杀菌抗生素都可以用于本发明的组合物中。合适的抗生素包括阿莫西林、强力霉素或甲硝哒唑。在本发明的某些形式中，口腔组合物的性质基本上可以是液态的，如漱口水或清洗剂。在这类制品中，媒介通常是水-醇混合物，期望包含下文所述的湿润剂。通常，水与醇的重量比的范围为约11到约201。这种类型的制品中水-醇混合物的总量的范围通常为制品总重量的约70%到约99.9%。醇通常是是乙醇或异丙醇。在某些实施方案中，醇是乙醇。这类液态制品和本发明其他制品的pH的范围一般为约5至约9，且通常为约5.0-7.0。可以用酸(如柠檬酸或苯甲酸)或碱(如氢氧化钠)或缓冲液(如用柠檬酸钠、苯甲酸钠、碳酸钠或碳酸氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等)控制PH。在本发明其他期望的形式中，组合物的性质基本上可以是固态的或糊状的，如牙粉、牙科用锭(dentaltablet)或牙膏(牙科用乳膏)或凝胶洁牙剂。这类固态或糊状口腔制品的媒介，通常含有牙齿可接受抛光材料。在牙膏中，液态媒介可以包含水和湿润剂，其量通常在制品重量的约10%到约80%的范围内。甘油、丙二醇、山梨醇和聚丙二醇是合适的湿润剂/载体的例子。水、甘油和山梨醇的液态混合物也是有利的。在折射率是重要考虑因素的透明凝胶中，通常使用约2.5-30%w/w的水、0至约70%的w/w甘油和约20-80%w/w的山梨醇。牙膏、乳膏和凝胶通常含有天然的或合成的增稠剂或胶凝剂，其比例为约0.w/w至约10%w/w，如0.5%w/w至约5%w/w。合适的增稠剂是合成蒙脱石，例如LaporteIndustriesLimited销售的名为Laponite(例如，CP、SP2002、D)的合成胶体镁碱金属硅酸盐复合物粘土。按重量计，LaponiteD为约58.00%SiO2,25.40%MgO,3.05%Na2O,0.98%Li2O,以及一些水和微量金属。其实际具体重量为2.53，并且在湿度为8%时，其表观松装密度为1.0g/ml。其他合适的增稠剂包括爱尔兰藓、i-卡拉胶(iotacarrageenan)、黄蓍胶、淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基丙基纤维素、羟丁基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素(例如商业名Natrosol)、羧甲基纤维素钠以及胶体硅如细微研磨的Syloid(如M4)。也可以包含增溶剂，如多羟基化合物湿润剂，如丙二醇、二丙二醇和己二醇；溶纤剂如甲基溶纤剂和乙基溶纤剂；在直链中含有至少12个碳的植物油和蜡，如橄榄油、蓖麻油和凡士林；以及酯，如乙酸正戊酯、乙酸乙酯以及苯甲酸苄酯。应当理解，常规情况下，口腔制剂通常是在合适的带标签的包装中进行销售或分销。因此，一瓶口腔清洗剂会具有将其在本质上描述为口腔清洗剂或漱口水并指导其使用的标记；并且牙膏、乳膏或凝胶通常位于软管包装(collapsibletube)中，通常为挂铝的、挂铅的或塑料的，或其他压挤器(squeeze)、泵或用于量化出内容物的加压分散器，并具有将其在本质上描述为牙膏、凝胶、牙齿乳膏的标记。在本发明的组合物中可以使用有机表面活性剂，以达到增强的治疗或预防作用，协助实现活性剂彻底、完全地分散在整个口腔中，并且使本发明的组合物更适合化妆品应用。所述有机表面活性物质的性质可以为阴离子的、非离子的或两性的，且在一些实施方案中不与所述活性剂相互作用。通常将去垢剂物质作为表面活性剂，所述去垢剂物质赋予组合物去垢和发泡性质。阴离子表面活性剂的合适实例是高级脂肪酸单硫酸甘油单脂的水溶性盐，例如氢化椰子油脂肪酸的单硫酸甘油单脂的钠盐；高级烷基硫酸盐，例如月桂基磺酸钠；烷基芳基磺酸盐，例如十二烷基苯磺酸钠、高级烷基磺基醋酸盐、1，2-二羟基丙磺酸盐的高级脂肪酸酯；以及低级脂肪族氨基羧酸化合物的基本饱和的高级脂肪族酰胺，诸如在脂肪酸、烷基或酰基中具有12-16个碳的那些化合物等。以上提到的酰胺的实例是N-月桂酰肌氨酸、以及N-月桂酰肌氨酸、N-肉豆蔻酰肌氨酸或N-棕榈酰肌氨酸的钠盐、钾盐和乙醇胺盐，以上应当基本脱离于肥皂或相似的高级脂肪酸材料。在本发明的口腔组合物中使用这些肌氨酸化合物是特别有利的，因为除了发挥部分降低牙釉质在酸溶液中的溶解性以夕卜，这些材料在抑制口腔中由于碳水化合物的分解导致的酸形成中还表现出延长的显著抑制作用。适合使用的水溶性非离子表面活性剂的实例是，环氧乙烷和可与其发生反应的各种反应性含氢化合物的缩合产物，所述含氢化合物具有长疏水性链(例如，约12-20个碳原子的脂肪族链)，该缩合产物(“ethoxamers")含有亲水性聚氧乙烯部分，所述缩合产生例如聚(环氧乙烯)与脂肪酸、脂肪醇、脂肪酰胺、多羟基醇(例如，山梨醇酐单硬脂酸酯)和聚环氧丙烷(例如，普流尼克(Pluronic)材料)的缩合产物。表面活性剂通常以约0.1-5%的重量比存在。值得注意的是，表面活性剂可以辅助溶解本发明的活性剂，并且由此降低所需的增容性湿润剂的量。可以将各种其他材料并入本发明的口腔制剂中，如增白剂、防腐剂、硅氧烷、叶绿素化合物和/或与氨结合的材料，如脲、磷酸氢二铵，以及以上的混合物。这些佐剂如果存在，则掺入制剂的佐剂的量应当基本上不会对所需的性质和特征产生不利影响。还可以使用任何合适的调味材料或增甜材料。合适的调味组分的实例是调味油和水杨酸甲酯，所述调味油例如，绿薄荷油、薄荷油、鹿蹄草油、檫木油、丁香油、鼠尾草油、桉树油、媒墨角兰油、肉桂油、柠檬油和橙油。合适的增甜剂包括蔗糖、乳糖、麦芽糖、山梨醇、木糖醇、环氨酸钠、紫苏亭、AMP(天冬酰胺苯丙氨酸酯甲酯)、糖精等。适当地，调味剂和增甜剂可以单独或共同占制剂的约0.1%至5%或更多。还可以将本发明的化合物、肽或肽模拟物并入锭剂或口香糖或其他产品中，如通过搅拌进胶基(gumbase)或包被到胶基的外表面，其说明性的实例是明胶(jelutong)、胶乳、乙烯基树脂等，理想地与常规可塑剂或柔软剂、糖或其他增甜剂或诸如葡萄糖、山梨醇等一起。在另一方面，本发明提供了组件试剂盒，包含(a)化合物、肽、肽模拟物或组合物以及(b)药学上可接受的载体。理想的是，所述试剂盒还包含使用它们治疗或预防有这类治疗需要的患者的牙周病的说明书。可以按照任何本领域内已知的制备药物组合物的方法来制备意图用于口腔的组合物，并且为了提供满足药学上外观和味觉的制剂，该组合物可以含有一种或多种选自以下的试剂增甜剂、调味剂、着色剂和防腐剂。片剂含有与适于制备片剂的无毒的药学可接受赋形剂混合的活性组分。这些赋形剂可以是，例如，惰性稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；成粒剂和崩解齐U，例如，玉米淀粉或褐藻酸；粘合剂，例如，淀粉、明胶或阿拉伯树胶；和润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是无包被的或可以用已知的技术进行包被以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而在更长的时期提供持续的作用。例如，可以使用时间延迟材料，诸如单硬脂酸甘油酯或双硬脂酸甘油酯。用于口腔的制品还可以以硬明胶胶囊的形式提供，其中活性组分与诸如碳酸钙、磷酸钙或高岭土的惰性固体稀释剂混合；用于口腔的制剂还可以以软明胶胶囊的形式提供，其中活性组分与水或诸如花生油、液体石蜡或橄榄油的油介质混合。水性悬液含有活性物质与适于制备水性悬液的赋形剂的混合物。这类赋形剂是悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯树胶。分散剂或润湿剂可以是天然存在的磷脂，例如，卵磷脂；或环氧烷烃与脂肪酸的缩合物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯；或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合物，例如十七乙烯氧基十六烷醇(h印tadecaethyleneoxycetanol)；或环氧乙烷与来自脂肪酸和己糖醇的部分酯的缩合物，例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯；或环氧乙烷与来自脂肪酸和己糖醇酐的部分酯的缩合物，例如聚乙烯脱水山梨聚醇单油酸酯。水性悬液也可以含有一种或多种防腐剂，例如苯甲酸盐，如乙基或η-丙基P-羟基苯甲酸盐，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂，以及一种或多种增甜剂，如蔗糖或糖精。可以通过将活性组分悬浮于植物油或矿物油中来配制油性悬液，所述植物油例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油；所述矿物油例如液体石蜡。油性悬液可以含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以添加调味剂和诸如上文列出的增甜剂，以提供符合味觉需要的口腔制品。通过添加诸如抗坏血酸的抗氧化剂可以使这些组合物防腐。为了更详细地说明本发明，描述了下列实施例，以说明本发明的某些方面和实施方案。材料和方法肽的酶消化和纯化通过缓慢添加于50°C、pH8.0的去离子水中同时持续搅拌溶解酪蛋白酸盐-HCl(BonlacFoods,MelbourneAustralia)，从而得到终浓度为21.5g/L。一旦酪蛋白酸盐溶解，将温度降至37°C，并通过缓慢添加IMHCl将pH调整至6.3，以避免酪蛋白沉淀。为了启动水解，添加Rennet(90%ChymosinEC3.4.23.4,145IMCU/ml,SingleStrength,Chr.Hanson)，至终浓度为1.2IMCU/g酪蛋白，并于37°C将溶液搅拌1小时。通过添加IMHCl和IMNaOH,将溶液的pH维持在6.3士0.2。通过添加4%终浓度的三氯乙酸，终止水解，通过离心(5，00(^，15分钟，4°0使沉淀的蛋白成团。通过利用3000Da截留膜(S10Y3,Amicon)渗滤，来浓缩含有酪蛋白巨肽(CMP)的上清液。接着使该材料冻干。利用连接于ΑΚΤΑExplorer系统(AmershamPharmaciaBiotech,USA)的Superose12柱(AmershamBiosciences,USA)，使制品分级，并利用50mMTris-HCl(pH8.0)以0.5ml/分钟的流速洗脱。以214ηπ^Π^0ηπι的波长监测洗脱液。每2分钟收集级分。将所有的样品在ChristFreezeDryer(OsterodeamHarz,Germany)中冻干，并保存于-70°C。通过反向HPLC、利用C18柱，对级分进一步分级，并用90%乙腈/0.v/vTFA洗脱。利用Agilent1100S二极管阵列和多波长检测器(AgilentTech.，PaloAlto,California)，用214nm的主波长，监测洗脱液。冻干所有收集的级分并保存于_70°C。每一级分的特性通过质谱分析证实。非糖基化κ-酪蛋白(106-169)通过凝乳酶消化获得，如以前所述(Malkoskietal.,2001)。通过将在具有来自金黄色葡萄球菌Gtaphylococcusaureus)菌株V8(Roche，PenzbergGermany)的内切蛋白酶-Glu-C的50mM乙酸铵(pH4.0)缓冲液中溶解了的非糖基化κ-酪蛋白(106-169)于37°C(ES；1200)水解Mh，获得κ-酪蛋白(106-137)。通过添加2ΜNaOH将pH增加到6.0，而终止水解，并利用分析(C18)RP-HPLC，分离肽。利用MS/MS分析，分析收集的级分，并鉴定肽。MALDIT0F/T0FMS用标准缓冲液(50%乙腈、0.1%TFA)中的饱和2，5_二羟基苯甲酸(DHB)基质，在MTP384型不锈钢非抛光靶板(targetgroundsteelplate)上使肽样品共结晶(11vol/vol)。在UltraflexMALDIT0F/T0F质谱仪(Bruker,Bremen,Germany)上分析样品。利用BrukerDaltonicsflexAnalysis2.4禾口BrukerDaltonicsBioTools3.O软件，用与本地MASCOT服务器所建立的酪蛋白数据库匹配的片段化谱，进行分析。固相肽分析利用标准的Fmoc化学方案在Liberty微波肽合成仪(Microwavepeptidesynthesizer,CEMCorporation,NorthCarolina)上，制备asl-酪蛋白(11-23)、β-酪蛋白(193-205)、β-酪蛋白(193-209)、κ-酪蛋白(106-137)、κ-酪蛋白(109-137)、κ-酪蛋白(117-137)、κ-酪蛋白(117-123)和κ-酪蛋白(127-137)肽。肽合成发生于与各自C末端氨基酸结合的Wang树脂上的酰胺末端。通过反向HPLC、利用C18柱，纯化肽。电喷雾MS利用在电喷雾质谱模型中运转的hquire-LCMS/MS系统(BrukerDaltonics)，分析从RP-HPLC收集的级分。以340μL/h进行样品注射，氮流为5L/分钟，且干燥气温度为300"C。细菌菌株和生长条件于37°C使牙龈卟啉单胞菌W50和ATCC33277细胞的甘油或冻干培养物在厌氧条件下生长于马血琼脂(HorseBloodAgar,HBA；Oxoid)上。通过传代维持牙龈卟啉单胞菌细胞，且仅用第3-7代接种20mL和200mL脑心浸液肉汤(37g/L)，该肉汤补充有氯高铁血红素(5mg/L)和半胱氨酸(0.5g/L)，并且对于ATCC33277，补充维生素K3(甲萘醌)(5mg/L)(BHI)。通过测量650nm波长处的培养物光密度(OD)，测定生长。对培养物进行革兰氏染色以检测任何污染。在指数生长期，通过离心(8000g，20分钟，4°C)，收获牙龈卟啉单胞菌细胞，并用含有0.5g/L半胱氨酸的TC150缓冲液(50mMTris-HCl、150mMNaCl、5mMCaCl2、pH8.0)洗涤一次。将洗涤的细胞重悬浮于2mLTC150缓冲液(具有0.5g/L半胱氨酸)中，并保存于4°C，以便在蛋白水解测定中直接使用。牙龈卟啉单胞菌RgpA-Kgp蛋白酶粘附素复合体和RgpB的纯化使牙龈卟啉单胞菌W50细胞在2L批量培养物中生长至对数晚期，并利用Arg-琼脂糖亲和层析基于之前所述方法(Pathiranaetal.，2006)，从TritonX114提取物中纯化RgpA-Kgp蛋白酶粘附素复合体。利用之前公开的方法(Chenetal.,2002；Pikeetal.,1994)，从牙龈卟啉单胞菌菌株HG66中纯化RgpB。利用显色底物测定牙龈卟啉单胞菌Arg-和Lys-特异性蛋白水解活性利用为牙龈卟啉单胞菌的全细胞Arg-和Lys-特异性蛋白水解活性而研发的测定，测定细菌蛋白酶抑制活性，该测定经过改良并且适合利用孵育体积减少的96孔板进行(O'Brien-Simpsonetal.,1998；0'Brien-Simpsonetal.,2001)利用合成显色底物N-α-苯甲酰-Arg-p-硝基苯胺(L-BapNA)和N-(ρ-甲苯磺酰基)-Gly-Pro-Lys4-硝基苯胺乙酸盐(GPK-NA)(SigmaAldrich)，测定Arg-和Lys-特异性蛋白水解活性。Arg-和Lys-特异性反应缓冲液含有2mML-BapNA或GPK-NA，其分别溶解于30%ν/ν异丙醇、0.93mML-半胱氨酸、400mMTris-HCl(pH8.0)和IOOmMNaCl中。用TC150缓冲液，稀释酪蛋白肽，这取决于所需的浓度。添加10μLIOmML-半胱氨酸(ρΗ8.0)，并添加牙龈卟啉单胞菌全细胞悬浮液、纯化的RgpA-Kgp蛋白酶-粘附素复合体(0.Olyg/μL)或纯化的RgpB(0.00116μg/μL)，至终体积为100μL。接着，在添加Arg-或Lys-特异性反应缓冲液之前(总体积200yL)，将样品于37°C孵育15分钟。通过用PerkinElmer1420MultilabelCounterVICT0R3(ffaltham,MA)，于37°C、pH8.0，以IOs间隔持续约20分钟，测量405nm处的吸光度，测定活性。在去离子吐0中制备8mMZnCl2溶液的母液，并以具体测定所需的浓度溶解冻干的酪蛋白肽。对照样品与测试样品相同，然而它们缺少任何蛋白酶抑制物质，即肽和/或锌。孵育后，通过RP-HPLC、利用分析(C18)柱和0-100%缓冲液B的线性梯度，分析测定内容物来确定在测定过程中是否存在酪蛋白肽的降解。利用ESI-MS和MS/MS分析，分析洗脱的级分。用荧光标记的牛血清白蛋白测定牙龈卟啉单胞菌的蛋白水解活性还利用DQGreenBSA(MolecularProbes,Eugene,OR)，同时对以前所公开的方法(Grenieretal.，2002；Yoshiokaetal.，2003)做了改良，测定细菌蛋白酶抑制活性。用在指数生长期(0.D65tlnm=0.6)收获的牙龈卟啉单胞菌ATCC33277全细胞进行测定，每孔5.6x109cfu/mL。测定混合物含有牙龈卟啉单胞菌细胞(100μL培养物)、TC150和抑制剂(终体积80μ1)以及DQBSA(20μL；200μg/mL)。用ImMNα-ρ-甲苯磺酰基-1-赖氨酸氯甲基酮(TLCK)处理的细胞作为对照。已知TLCK抑制Rgp和Kgp活性(Fletcheretal.,1994,Pikeetal.，1994)。在利用荧光计(PerkinElmer1420MultilabelCounterVICT0R3)测量荧光(Em535nm,Ex485nm)之前，将测定混合物在黑暗中于37°C孵育浊。从所有值中减去从阴性对照(TLCK-处理的细胞)获得的荧光值。除非另有声明，用2-3个生物复制品进行所有测定，一式三份。分级抑制浓度指数分级抑制浓度指数(FIC指数)是定义两种或多种抑制剂或抗菌剂协同、加成或拮抗相互作用的标准(Berenbaum,1978)0FIC指数计算为:FIC指数=[(A+B)/A]+[(A+B)/B]，其中A表示κ-酪蛋白(109-137)的作用，B表示氯化锌的作用，且A+B表示两种组合的作用。FIC指数>1表示拮抗作用，FIC指数=1表示加成作用，而FIC指数<1表示协同作用。抑制类型和抑制常数(κ0的确定以0.15,0.25和ImM的底物(BapNA)浓度，获得以OD4tl5/秒表示的初始反应速率。抑制剂(肽)浓度的变化范围为0、25、50、75和100μΜ。将数据作成莱恩威佛-伯克(双倒数)图，并利用一阶线性回归，测定斜率。莱恩威佛-伯克图可以用于测定Km(酶亲和性)和Vmax(最大反应速度)值和酶抑制类型，从而区分竞争性抑制剂、非竞争性抑制剂以及反竞争性抑制剂(Stryeretal.，2002)。通过莱恩威佛-伯克图的斜率针对抑制剂浓度作图，测定抑制常数(Ki)。分子建模用程序FUGUE(Shietal.，2001)针对含有10；34个蛋白家族和10230个比对结构的专业(curated)蛋白数据库H0MSTRAD鉴定抑制剂肽的可能结构基序(Mizuguchietal.，1998)。FUGUE扫描结构特征数据库，计算序列结构相容性得分并产生一列潜在的同系物和比对结果。根据Z-得分计算特异性、敏感性和等级。Z-得分阈值为6表示99%的特异性，且Z-得分阈值为5表示95%的特异性。利用STOnVTripos构建抑制剂肽模型。利用内部软件，通过金属原子位置相对于模型肽的主链和C原子位置的位置，鉴定抑制剂肽中潜在的金属结合位点。结果利用显色底物测定牙龈卟啉单胞菌Arg-和Lys特异性蛋白水解活性在200μΜ肽浓度时，κ-酪蛋白(109-137)表现出最有效的结果，对全细胞Arg-和Lys-特异性蛋白水解活性的抑制为约90%，而Qsi-酪蛋白(11_23)对全细胞Arg-和Lys特异性蛋白水解活性分别表现出约70%和约60%的抑制(图1、图2和表1、表2;参见上文“附图简要说明”标题下阴影(shadingkey)的)。β-酪蛋白(193-209)抑制50%的全细胞Arg-和Lys-特异性蛋白水解活性，而较短的β-酪蛋肽(193-205)仅抑制15%的Arg-特异性蛋白水解活性(图1、图2以及表1、表2；参见上文“附图简要说明”标题下阴影的)。分析各种浓度的肽，蛋白水解活性的％抑制证明对肽浓度的剂量响应(图1、图2；参见上文“附图简要说明”标题下阴影的)。随后，将包含RgpA和Kgp的纯化的外膜蛋白酶复合体用于蛋白水解测定中，以确保所观察的蛋白水解抑制不是可能存在于全细胞中的其他蛋白酶的假象。因此，肽抑制Arg-和Lys特异性蛋白水解活性，并且甚至仅用100μM肽就表现出抑制潜力的增加(图3、表1、表2;参见上文“附图简要说明”标题下阴影的)。κ-酪蛋白(109-137)对Arg-和Lys-特异性蛋白水解活性表现出最显著的抑制，对其做进一步评估。针对纯化的RgpB评估肽，以确定肽的结合位置。RgpB蛋白水解活性的抑制表明，肽结合蛋白酶自身而非蛋白酶复合体(图4、表1)。表1具有各种浓度的合成肽的精氨酸牙龈菌蛋白酶的蛋白酶活性(％)权利要求1.用于抑制、降低或防止细菌酶活性的化合物、肽或肽模拟物，其中所述化合物、肽或肽模拟物基本上由选自以下的氨基酸序列和其中的保守取代组成SEQIDNO=USEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO4禾口SEQIDNO:5。2.如权利要求1所述的化合物、肽或肽模拟物，其中所述氨基酸序列选自SEQIDNOUSEQIDNO:2,SEQIDN0:3、SEQIDNO:4禾口SEQIDNO:5。3.如权利要求1所述的化合物、肽或肽模拟物，其中所述氨基酸序列是SEQIDNO:5。4.用于抑制、降低或防止细菌酶活性的化合物、肽或肽模拟物，其由与NOs1-32中任一个至少60%相同的氨基酸序列组成。5.如权利要求1-4中任一项所述的化合物、肽或肽模拟物，其中所述细菌酶是牙龈菌蛋白酶。6.如权利要求5所述的化合物、肽或肽模拟物，其中所述牙龈菌蛋白酶来自牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)07.用于抑制细菌酶的药物组合物，其包含化合物、肽或肽模拟物和药学上可接受的载体，所述化合物、肽或肽模拟物包含酪蛋白的氨基酸序列或其片段。8.如权利要求7所述的药物组合物，其中所述氨基酸序列基本上由SEQIDNO=USEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO4或SEQIDNO5中的任何一个或多个和其中的保守取代组成。9.如权利要求7或8所述的药物组合物，其还包含二价阳离子。10.如权利要求9所述的药物组合物，其中所述二价阳离子是锌。11.用于治疗牙周病的药物组合物，其包含权利要求1-6中任一项所述的化合物、肽或肽模拟物和药学上可接受的载体。12.如权利要求11所述的药物组合物，其还包含二价阳离子。13.如权利要求12所述的药物组合物，其中所述二价阳离子是锌。14.权利要求1-6中任一项所述的化合物、肽或肽模拟物在制备治疗牙周病的药物中的用途。15.预防或治疗牙周病的方法，其包括给予有需要的个体有效量的权利要求1-6中任一项所述的化合物、肽或肽模拟物。16.抑制细菌酶的方法，其包括使所述酶与包含化合物、肽或肽模拟物的组合物接触，所述化合物、肽或肽模拟物包含选自SEQIDNOs:1-32中任一个的氨基酸序列和其中的保守取代。全文摘要本发明涉及抑制蛋白酶活性的化合物、肽、肽模拟物和药物组合物以及这些化合物、肽、肽模拟物和药物组合物治疗或预防疾病状态的用途。特别是，所述疾病状态是牙周病。所述化合物、肽和肽模拟物可以来源于各种酪蛋白，如α-酪蛋白、β-酪蛋白以及κ-酪蛋白。本发明的化合物、肽、肽模拟物和药物组合物抑制的蛋白酶活性包括牙龈菌蛋白酶的活性。文档编号A61K38/10GK102459321SQ201080035149公开日2012年5月16日申请日期2010年6月18日优先权日2009年6月19日发明者埃里克·查尔斯·雷诺兹,斯图尔特·杰弗里·达斯弗申请人:口腔健康澳洲私人有限公司