5-Aza-CdR在上调骨肉瘤细胞中RASSF1A基因表达的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了甲基化转移酶抑制剂5-Aza-CdR在上调骨肉瘤细胞中RASSF1A基因表达的应用。
【专利说明】5-Aza-CdR在上调骨肉瘤细胞中RASSF1A基因表达的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物和药物学【技术领域】，具体而言，涉及5-Aza-CdR在上调骨肉瘤细胞中RASSF1A基因表达的应用。
【背景技术】
[0002]骨肉瘤在原发性恶性骨肿瘤中属于最常见的一种类型，多见于青少年和年轻成人，在儿童肿瘤中约占5%。尽管在早期诊断和综合治疗上获得了很大进步，但是骨肉瘤患者的五年生存率仍然只能达到60%左右。骨肉瘤的发生是一个多因素和多阶段的过程癌基因激活和抑癌基因失活共同导致了其表型的变化。近几年来发现DNA甲基化状态水平的改变成为肿瘤相关抑癌基因功能失活的一个重要分子机制。有学者在研究骨肉瘤细胞时通过对骨肉瘤组织细胞中RASSF1A的甲基化的状态进行检测发现在骨肉瘤细胞中RASSF1A的启动子CpG岛区域的CpG序列也处于高甲基化状态。
[0003]肿瘤细胞的高甲基化状态水平可以通过甲基化转移酶抑制剂5-Aza-CdR的去甲基化作用逆转，甲基化转移酶的这种去甲基化效应为肿瘤疾病的临床治疗带来了新的希望和契机，部分研究发现在治疗有些白血病危象和顽固性急性白血病时甲基化转移酶抑制剂的效果显著，但是甲基化转移酶抑制剂的具体作用机制及其在骨肉瘤等疾病中的治疗作用尚不清楚。在骨肉瘤细胞株MG63中，甲基化转移酶抑制剂5-Aza-CdR对RASSF1A基因的表达水平以及对细胞生长增殖的影响如何有待进一步研究，未见有相关文献进行报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种上调骨肉瘤细胞系MG63中抑癌基因RASSF1A的mRNA及蛋白表达的方法，为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案:
[0005]本发明一方面涉及甲基化转移酶抑制剂5-Aza-CdR在上调骨肉瘤细胞中RASSF1A基因表达的应用。
[0006]在本发明的一个优选实施方式中，所述的骨肉瘤细胞系为骨肉瘤细胞系MG63。
[0007]在本发明的另一个优选实施方式中，所述的骨肉瘤细胞系为离体骨肉瘤细胞系。
[0008]在本发明的另一个优选实施方式中，甲基化转移酶抑制剂5-Aza-CdR在同时增加抑癌基因RASSF1A的mRNA浓度中的应用。
[0009]在本发明的另一个优选实施方式中，所述的应用是非诊断目的和非治疗目的的。
【具体实施方式】
[0010]实施例1
[0011]I 材料
[0012]1.1细胞及抗体:
[0013]目的细胞MG-63(人成骨肉瘤细胞)由长沙赢润生物技术有限公司提供。
[0014]RASSFla 抗体购自 Abcam，货号 ab23950。[0015]2实验方法
[0016]2.15-Aza-CdR对MG63细胞生长影响的研究:
[0017]取生长良好的细胞分16组，分别用不同剂量(0、5、10、50ymol/L)的5-Aza-CdR处理，分别处理(24h、48h、72h、96h)后，MTT法检测各组细胞的增殖情况。
[0018]2.25-Aza-CdR处理后RASSF1A的mRNA的表达变化情况:
[0019]收集细胞同时进行常规细胞计数后将细胞接种于培养皿中，密度为5X105个/皿，分别予以(0、5、10、50ymol/L)的5-Aza-CdR处理，固定干预时间点72h，依此收集细胞，抽提样品总RNA行逆转录后获得cDNA，cDNA为模板，分别扩增RASSFla及GAPDH内参片段，其中引物对:
[0020]RAS-399-f:5，-AACGTGGACGAGCCTGTGGAGT-3，
[0021]RAS-399-r:5， -ACGCTCAGCGCGCTCAAAGA-3’
[0022]product:Length = 399bp, Ta = 58.7
[0023]GAPDH-452-f:5’ -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’
[0024]GAPDH-452-r:5’ -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’
[0025]product:Length = 452bp, Ta = 58
[0026]取PCR产物在I %琼脂糖凝胶中电泳20min后，在凝胶成像分析系统下显影照相存档。通过使用影像分析仪对凝胶进行照相并做灰度扫描分析，获取每个样品中PCR产物的灰度值，结果以与相对应样品GAPDH带灰度值的比值表示。
[0027]2.35-Aza-CdR处理后RASSFla蛋白的表达变化情况:
[0028]取生长良好的细胞MG634组，分别用不同剂量(0、5、10、50 μ mol/L)的5-Aza-CdR处理72h后，提取细胞总蛋白质，经SDS-PAGE及免疫印迹及显影检测细胞系RASSFla蛋白的表达水平。采用影像分析仪对凝胶摄像并做图片灰度扫描，对灰度扫描数据进行分析，获取每个样品West-Blotting产物的灰度值，结果以对照组为0，做一个相对取值表示。3统计学分析
[0029]本实验中数据结果用均数土标准差(又士 SD)表示，采用SPSS13.0统计分析软
件，组间计量资料比较采用t检验分析，当P < 0.05时，统计学差异显著。
[0030]3.1MTT检测不同浓度5-Aza-CdR在不同时间点对MG63细胞株生长增殖状态的影响:
[0031]1.同一时间点随着甲基化转移酶抑制剂5-Aza-CdR处理浓度的增加，MG63细胞的增殖生长速度明显下降，并且与空白对照组差异有显著统计学意义(P <0.05)；
[0032]2.同一浓度甲基化转移酶抑制剂5-Aza-CdR处理后不同时间点(24h、48h、72h、96h)，检测发现随着处理 时间的延长，MG63细胞株的增殖生长速度下降明显，差异具有统计学意义(P < 0.05)
[0033]表1不同浓度甲基化转移酶抑制剂5-Aza-CdR作用MG63细胞后对细胞增殖生长的影响，用各组细胞的吸光度值(A)表示
【权利要求】
1.甲基化转移酶抑制剂5-Aza-CdR在上调骨肉瘤细胞中RASSF1A基因表达的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，所述的骨肉瘤细胞为骨肉瘤细胞系MG63。
3.根据权利要求1所述的应用，所述的骨肉瘤细胞为离体骨肉瘤细胞。
4.根据权利要求1所述的应用，甲基化转移酶抑制剂5-Aza-CdR在同时增加抑癌基因RASSFIA的mRNA浓度中的应用。
5.根据权利要求 1-4所述的应用，所述的应用是非诊断目的和非治疗目的的。
【文档编号】A61P35/00GK103989697SQ201410081347
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年3月7日 优先权日:2014年3月7日
【发明者】臧晓方, 周勇, 熊军, 肖智 申请人:臧晓方, 周勇