一种铁蛋白重链亚基纳米载药系统及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种表皮生长因子-铁蛋白重链亚基蛋白的衍生蛋白，即表皮生长因子-5半胱氨酸-铁蛋白重链亚基蛋白（EGF-5Cys-FTH1)，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示。本发明还公开了一种铁蛋白重链亚基纳米载药系统DOX/EGF-5Cys-FTH1，其采用所述EGF-5Cys-FTH1蛋白作为药物载体通过交联剂含马来酰亚胺酰肼的三氟乙酸盐与阿霉素连接，可以特异性地在富含EGFR的肿瘤细胞表面富集。所述纳米载药系统提高了载药量，有望在制造抗肿瘤药物，特别是在抗乳腺癌药物中有所应用。
【专利说明】一种铁蛋白重链亚基纳米载药系统及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制药领域，具体涉及一种铁蛋白重链亚基纳米载药系统及其制备 方法与应用。
【背景技术】
[0002] 纳米材料的特性使其在肿瘤诊断分析方面具有许多优势，将纳米技术与生物医学 领域相结合已成为纳米【技术领域】中发展最为迅速的研究领域之一。
[0003] 铁蛋白作为天然蛋白具有高度的生物安全性，且铁蛋白作为笼状蛋白能够自行组 装成天然构象为其作为纳米载药载体提供基础。近年来的研究表明，小尺寸的纳米粒子能 够更深入地进入实体肿瘤组织当中，这使得铁蛋白纳米粒子引起人们更多的关注。
[0004] 另外，研究结果（Xu Li, Lihui Qiu，Xuni Cao et al.，Epidermal Growth Factor-Ferritin H-Chain Protein Nanoparticles for Tumor Active Targeting"small2012,8, No. 16,2505-2514)也表明表皮生长因子（EGF)-铁蛋白重链亚 基（FTHl)纳米粒子（EGF-FTHl)由于其表面的EGF能有效地与许多肿瘤细胞表面过表达的 EGFR结合，使其在体内能富集于肿瘤组织。
[0005] 但是，纳米粒子EGF-FTHl由于无法直接与药物连接来组成载药系统而直接作用 于肿瘤细胞表面，目前仍然没有关于纳米粒子EGF-FTHl作为载药系统的应用或报道。
【发明内容】
[0006] 本发明克服现有纳米粒子EGF-FTHl粒径较小，缺乏合适的高载药物的载药 技术而难以直接应用到药物载体的缺陷，提供一种表皮生长因子（EGF)-铁蛋白重链 亚基（FTHl)蛋白的衍生蛋白，即表皮生长因子-5半胱氨酸-铁蛋白重链亚基蛋白 (EGF-5Cys-FTHl蛋白），并将其通过交联剂连接药物，形成铁蛋白重链亚基纳米载药系统。
[0007] 现有的EGF-FTHl由于其表面的EGF能有效地与许多肿瘤细胞表面过表达的EGFR 结合，能够与肿瘤细胞，特别是与EGFR高表达的肿瘤细胞相结合，说明EGF-FTHl有应用于 载药系统的前景，但是由于其粒径较小，缺乏合适的高载药物的载药技术，故发明人考虑到 应用交联剂来尝试连接。
[0008] 具有EGFR高表达的肿瘤细胞的癌症有乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌等，目前，可以广 谱地抑制或者治疗这些癌症的药物有顺钼、紫杉醇、阿霉素等，综合考虑所构建药物载体的 药代动力学特性、毒副作用和逆转肿瘤细胞耐药性的前景，选取了经典药物阿霉素作为载 药系统中的被载药物。
[0009] 由于阿霉素含有羰基，故发明人希望交联剂一方面可以与药物的羰基相 连接，一方面还可以与EGF-FTHl相连接。交联剂含马来酰亚胺酰肼的三氟乙酸盐 (Ν-[ ε-Maleimidocaproic acid)hydrazide,trifluoroacetic acid salt)(EMCH)的一端 为酰肼可与羰基反应形成稳定的腙键；而另一端为马来酰亚胺，可与游离巯基反应形成稳 定的硫醚键。腙键在低pH (pH < 5)的条件下会断裂，而肿瘤细胞的溶酶体恰可满足这一 pH 条件，这也就意味着使用交联剂EMCH与阿霉素连接可以在药物进入肿瘤细胞时腙键发生 断裂，从而可以达到药物可控释放、针对目标肿瘤细胞进行靶向定位的目的，故选择交联剂 EMCH。
[0010] 由此，发明人考虑需要对纳米粒子EGF-FTHl进行修饰，使其衍生蛋白含有巯基而 与交联剂EMCH相连接。发明人经反复试验筛选后发现，EDF与FTHl亚基之间能够插入含 有巯基的天然氨基酸，较佳地如半胱氨酸。而半胱氨酸插入数目的选择也需要筛选：半胱氨 酸数目的减少会导致巯基位点数目的减少并减少载药量；而半胱氨酸数目过多，如9个，则 会使EGF-Cys-FTHl蛋白内部形成二硫键，破坏其空间构型，使其难以保持稳定性，故发明 人最后选择插入5个半胱氨酸的EGF-5Cys-FTHl蛋白，这样每个EGF-5Cys-FTH纳米粒子可 以提供120个疏基位点，以实现对药物的商载。
[0011] 由此，本发明提供一种表皮生长因子-铁蛋白重链亚基蛋白的衍生蛋白，所述衍 生蛋白为表皮生长因子-铁蛋白重链亚基蛋白中间插有5个半胱氨酸，即为表皮生长因 子-5半胱氨酸-铁蛋白重链亚基蛋白（EGF-5Cys-FTHl)，所述的EGF-5Cys-FTHl蛋白的氨 基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 1所示。
[0012] 较佳地，为了更好地构建质粒表达载体进行转化并适用于本发明，编码所述的 EGF-5Cys-FTHl蛋白的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 2所示。
[0013] 本发明还提供一种编码所述的EGF-5Cys-FTHl蛋白的DNA分子，所述DNA分子编 码如序列表中SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。
[0014] 较佳地，为了更好地构建质粒表达载体进行转化并适用于本发明，所述DNA分子 的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 2所示。并且，本领域的技术人员都清楚，编码如序列 表中SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列的DNA分子中的核苷酸可以为了适应不同的表达载体 或转化体等进行替换或修饰。
[0015] 本发明还提供一种含有上述如序列表中SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列的表达载 体。
[0016] 所述的表达载体的空质粒可以为本领域常规的表达载体的空质粒，较佳地，由于 便于获得和试验操作，所述的空质粒为pET-28a(+)，由此得到的表达载体为pET-28a(+)/ EGF-5Cys-FTHl〇
[0017] 本发明还提供一种含有编码所述的EGF-5CyS-FTHl蛋白的DNA分子的核苷酸序列 的基因工程菌。
[0018] 所述基因工程菌中的宿主细胞可以选用本领域常规的宿主细胞；较佳地，由于 便于获得和试验操作，所述基因工程菌的宿主细胞为大肠杆菌；更佳地为大肠埃希氏菌 (E. coli)BL21(DE3)。
[0019] 较佳地，所述的基因工程菌含有编码所述的EGF-5Cys-FTHl蛋白的DNA分子的 核苷酸序列的表达载体，例如上述的pET-28a (+) /EGF-5Cys-FTHl，得到的基因工程菌为 E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)/EGF-5Cys-FTH 1〇
[0020] 所述基因工程菌的接种量为本领域常规的接种量；较佳地，所述基因工程菌的接 种量与培养基的体积比为1 : 100。
[0021] 本发明提供一种所述的EGF-5Cys-FTHl蛋白的制备方法，所述的制备方法包括： 培养所述的含有编码所述的EGF-5Cys-FTHl蛋白的DNA分子的核苷酸序列的表达载体的转 化体，分离纯化培养物得到所述的EGF-5Cys-FTHl蛋白。
[0022] 较佳地，所述的转化体为所述的含有编码所述的EGF_5Cys-FTHl蛋白的DNA 分子的核苷酸序列的基因工程菌，例如本发明上述E. coli BL21 (DE3) /pET-28a (+) / EGF-5Cys-FTHl〇
[0023] 本发明提供一种铁蛋白重链亚基纳米载药系统，其采用本发明所述的 EGF-5Cys-FTHl蛋白作为药物载体。
[0024] 所述的铁蛋白重链亚基纳米载药系统还包括含羰基的药物；所述的 EGF-5Cys-FTHl蛋白和所述的含羰基的药物通过交联剂连接。较佳地，所述交联剂可以一端 与含羰基的药物且另一端与所述的EGF-5Cys-FTHl蛋白连接。
[0025] 较佳地，所述含羰基的药物为阿霉素（DOX)。
[0026] 更佳地，所述的交联剂为含马来酰亚胺酰肼的三氟乙酸盐（EMCH)。当然，基于本发 明的发明构思，其他符合一端可以与含羰基的药物连接，并且另一端与所述的衍生蛋白的 巯基相连接的双功能交联剂也可以运用到载药系统的制备中来。
[0027] 更佳地，所述的铁蛋白重链亚基纳米载药系统为阿霉素与所述的EGF-5Cys-FTHl 蛋白通过交联剂EMCH连接，得D0X/EGF-5Cys-FTHl纳米载药系统。
[0028] 本发明提供一种铁蛋白重链亚基纳米载药系统的制备方法，包括以下的步骤：所 述的交联剂EMCH与所述的DOX连接形成化合物A，所述化合物A为EMCH-DOX ;所述的化合物 A与所述的EGF-5Cys-FTHl蛋白连接即得。所述化合物A的制备方法可以参见Willner，D et al. , (6-Maleimidocaproyl)hydrazone of doxorubicin-a new derivative for the preparation of immunoconjugates of doxorubicin. Bioconjug. Chem. 1993,4,521-527。
[0029] 较佳的，所述连接的pH条件为6. 5?7. 5 ;所述连接中，所述的化合物A与所述的 EGF-5Cys-FTHl蛋白的用量的摩尔比为（1?240) : 1，较佳地为120 : 1。所述连接的溶 剂为常规的缓冲溶液，如PBS等；所述连接的温度为4?65°C ;所述连接的时间为1?24 小时。
[0030] 所述的EGF-5CyS-FTHl蛋白由于热稳定性极好，在65°C依然可以进行连接反应。
[0031] 发明人经实验发现，当所述的化合物A与所述的EGF-5Cys-FTHl蛋白的用量的 摩尔比为小于I : 1时，化合物A数量过少,连接效率过低，而所述的化合物A与所述的 EGF-5Cys-FTHl蛋白的用量的摩尔比大于240 : 1时，会极大地增加制备成本。当两者摩尔 比为120 : 1时，能够达到较佳的连接效果，同时成本比较合理。
[0032] 发明人经实验发现，pH < 6. 5或者> 7. 5时，连接反应副反应比较严重，所述的化 合物A与巯基连接的效率较低。
[0033] 本发明提供所述的铁蛋白重链亚基纳米载药系统在制备抗肿瘤的药物中的应用。 [0034] 较佳地，所述的药物为抗乳腺癌的药物。
[0035] 较佳地，在制备抗耐药株肿瘤细胞药物中的应用。
[0036] 更佳地，所述的耐药株肿瘤细胞为乳腺癌MCF-7/ADR细胞。
[0037] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0038] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0039] 本发明的积极进步效果在于：以纳米粒子EGF-FTHl为载体通过交联剂EMCH构建 靶向药物，可以使药物富集在药物所作用的组织上；由于EMCH的酰肼与药物的羰基形成的 腙键在低PH条件下能够断裂，从而释放药物，所以应用本发明所述的药物载体可以实现药 物的可控释放；在EGF-FTHl亚基中插入5个含巯基的半胱氨酸，这样每个纳米粒子将提供 120个巯基位点，以实现对药物的高载药量；本发明所述的载药系统对耐药株细胞抑制作 用明显，有望在制造抗肿瘤多药耐药性的药物中有所应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0040] 图1为制备的EGF-5cys_FTHl蛋白透射电镜图。
[0041] 图2D0X/EGF-5Cys-FTHl的SDS-PAGE(A)荧光检测图（B)考马斯亮蓝染色图。泳 道 1，EGF-5Cys-FTHl 纳米粒子（8 μ g);泳道 2, D0X/EGF-5Cys-FTHl 纳米粒子（20 μ g)。
[0042] 图3为制备的D0X/EGF-5cys-FTHl纳米给药系统用于MCF-7/ADR细胞48小时后 存活率的折线图。
【具体实施方式】
[0043] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。
[0044] 实施例 1 构建 pET-28a(+)/EGF-5Cys_FTHl 工程表达菌
[0045] 1、将编码EGF-FTHl蛋白的核苷酸序列插入pET-28a(+)质粒上的Nco I和Not I 多克隆位点之间，得到 pET-28a(+)/EGF-FTHl，具体可参见（Xu Li，Lihui Qiu，Xuni Cao et al. , Epidermal Growth Factor-Ferritin H-Chain Protein Nanoparticles for Tumor Active Targeting，small 2012,8, No. 16, 2505-2514)。然后设ii 对反向引物，在 EGF-FTHl之间插入5个半胱氨酸，（见表1)。
[0046] 表 1
[0047]
【权利要求】
1. 一种表皮生长因子-铁蛋白重链亚基蛋白的衍生蛋白，其特征在于，所述的衍生蛋 白为表皮生长因子-铁蛋白重链亚基蛋白中间插有5个半胱氨酸，即为表皮生长因子-5半 胱氨酸-铁蛋白重链亚基蛋白，所述的衍生蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 1所 示；较佳地，编码所述的衍生蛋白的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 2所示。
2. -种编码表皮生长因子-铁蛋白重链亚基蛋白的衍生蛋白的DNA分子，其特征在于， 所述DNA分子编码如序列表中SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列；较佳地，所述DNA分子的核 苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 2所示。
3. -种含有如权利要求2所述的DNA分子的核苷酸序列的表达载体；较佳地，所述的 表达载体的空质粒为pET-28a(+)。
4. 一种含有如权利要求2所述的DNA分子的核苷酸序列的基因工程菌；较佳地，所述 的基因工程菌含有如权利要求3所述的表达载体；较佳地，所述的基因工程菌的宿主细胞 为大肠埃希氏菌（E. coli)BL21 (DE3)。
5. -种如权利要求1所述的衍生蛋白的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括： 培养含有如权利要求3所述的表达载体的转化体，分离纯化培养物得到所述的衍生蛋白； 较佳地，所述的转化体为如权利要求4所述的基因工程菌。
6. -种铁蛋白重链亚基纳米载药系统，其特征在于，所述的铁蛋白重链亚基纳米载药 系统采用如权利要求1所述的衍生蛋白作为药物载体。
7. 如权利要求6所述的铁蛋白重链亚基纳米载药系统，其特征在于，所述的铁蛋白重 链亚基纳米载药系统还包括含羰基的药物，所述的衍生蛋白和所述的含羰基的药物通过交 联剂连接；较佳地，所述的含羰基的药物为阿霉素；更佳地，所述的交联剂为含马来酰亚胺 酰肼的三氟乙酸盐。
8. -种铁蛋白重链亚基纳米载药系统的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括 以下的步骤：交联剂含马来酰亚胺酰肼的三氟乙酸盐与阿霉素反应形成化合物A，所述的 化合物A与如权利要求1所述的衍生蛋白连接。
9. 如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述连接的pH条件为6. 5?7. 5 ;所 述连接中，所述的化合物A与所述的衍生蛋白用量的摩尔比为（1?240) : 1，较佳地为 120 ： 1〇
10. 如权利要求6-7任一项所述的铁蛋白重链亚基纳米载药系统在制备抗肿瘤细胞的 药物中的应用；较佳地，所述的药物为抗乳腺癌的药物；较佳地，在制备抗耐药株肿瘤细胞 的药物中的应用；更佳地，所述的耐药株肿瘤细胞为MCF-7/ADR细胞。
【文档编号】A61K47/42GK104211815SQ201410464802
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月12日 优先权日:2014年9月12日
【发明者】曹旭妮, 黄雅佩, 黄培森, 沈阳 申请人:华东理工大学