已经将各种化学结构部分(‘有效负荷’)与酶、抗体和其它大的多肽类或蛋白质连接，形成缀合物。有效负荷可以用于定位它们所连接的蛋白质(例如标记)，以改变该蛋白质的理化特性或稳定性(例如聚乙二醇化)，从而能够使得该蛋白质连接至另一个分子或蛋白质(用于使缀合物连接至另一种化合物或另一种缀合物的偶联基团)或改变所述有效负荷或蛋白质的功能或活性(例如疫苗缀合物)。蛋白质还可以作为载体起作用以便将连接的有效负荷递送至特定的组织或细胞类型，例如以抗体-药物缀合物(ADC)的形式。可以有用地连接至蛋白质的有效负荷的类型包括可检测的部分(标记)、使蛋白质连接至表面或另一种化合物的锚定结构部分、在与蛋白质缀合时引起免疫应答的抗原、易于与化学互补偶联配偶体反应的偶联基团(由此使蛋白质连接至另一种实体)和治疗结构部分，例如细胞毒素和另外的生物活性剂。使这些不同的结构以可控和可再现的方式连接至蛋白质通常对于缀合物正确地起作用而言是关键的。因此，对于使许多类型的有效负荷连接至许多不同的蛋白质或多肽类的各种方法存在需求。已经研发了大量用于使有效负荷连接至蛋白质以形成蛋白质缀合物的方法。参见，例如Sletten,E.M.和Bertozzi,C.R.Angew.Chem.Int.Ed.2009,48,6974–6998；Basle′,E.；Joubert,N.；和Pucheault,M.Chemistry&Biology2010,17,213-227。在一些蛋白质缀合物中，连接蛋白质和有效负荷的方法可能对缀合物的活性或相关特性具有不可预测的影响；在另外的情况中，蛋白质与有效负荷之间的连接基团的性质可以显著地影响缀合物的活性或特性。有时，关键在于，例如控制每个蛋白质中有效负荷结构部分的数量，或控制其中连接有效负荷的精确的位置，以便它们不干扰蛋白质的功能。例如，ADC需要蛋白质识别并且结合靶细胞上的表面结构，以便传递选择性，由此有效负荷不得定位于干扰抗体结合该抗体必须识别的表面结构(抗原)的位置。参见，例如ExpertOpin.Biol.Ther.2012,12,1191-1206；Toxins2011,3,848-883；和LaurentDucryDrugDeliveryinOncology：FromBasicResearchtoCancerTherapy,第1版.Wiley-VCHVerlagGmbH&Co.KGaA.2012,12,355-374。大部分连接有效负荷与蛋白质的方法包括在蛋白质与所关注的特定有效负荷之间添加连接化学结构(连接基)。连接基提供使用每个结构部分上可利用的官能团来使所关注的有效负荷连接至蛋白质的方式。连接基通常允许有效负荷与要调节的蛋白质之间存在一定距离，并且还可以包括可以在体内被裂解或降解以便从蛋白质中释放有效负荷的可裂解的部分，其中释放对于有效负荷实现其目的是重要的。例如，在ADC中，对于缀合物而言关键在于在有效负荷能发挥期望的作用的位置上分解并且释放有效负荷。由于不同类型的蛋白质-有效负荷缀合物对连接有效负荷和蛋白质的方式提出不同要求，所以对于使有效负荷持续地和有效地连接至蛋白质的新方法存在持续的需求。用于形成蛋白质缀合物的最常用的方法依赖于天然出现在许多天然蛋白质中的一些氨基酸的化学反应性：通常使用赖氨酸和半胱氨酸，因为它们提供用于使有效负荷连接至蛋白质的反应位点。赖氨酸具有游离氨基，其可以与连接基或有效负荷上适合的亲电官能团反应，半胱氨酸可以通过其游离巯基反应。然而，依赖于这些天然存在的反应位点可能是复杂的：例如，当所关注的蛋白质中特定类型的氨基酸过多或多少时，难以在蛋白质上得到恰好正确的有效负荷‘载量’。蛋白质表面上的赖氨酸高丰度使得位点-和区域选择性缀合是困难的，并且产生不均匀产物。相反，半胱氨酸相对稀少且在蛋白质中主要以二硫键合对存在。在半胱氨酸上缀合通常需要还原二硫键，随后与缀合试剂(例如马来酰亚胺)反应以单独标记各个半胱氨酸。因为这除去了二硫键，所以通过这种方法潜在地破坏蛋白质结构和稳定性。蛋白质还通常具有多于要连接的最佳数量的有效负荷的赖氨酸：添加足够的有效负荷结构部分以占据所有可利用的赖氨酸，以确保一致性的均匀产物，这种方式可能添加了对于最佳效能而言过多的有效负荷分子。可以通过仅使用这些赖氨酸中的一部分用于缀合来避免这种情况，但这样部分的或不完全的加载通常提供不均匀产物，这可能造成问题，其原因不同—例如，在MylotargTM的情况中，第一种商业化ADC，该ADC产物的不均匀性看来很可能导致了问题，后者导致从注册中撤回产品的决定。Fuenmayor等人,Cancers,第3卷,3370-93(2011)。此外，甚至当存在足够的特定类型的氨基酸基团(例如赖氨酸)用于最佳加载时，它们的一些或全部可能在蛋白质是其溶液构象时被‘掩蔽’在蛋白质内部，从而赋予它们无法有效地利用于缀合或使得它们‘部分地’接近，也可能导致缀合物的不均匀性。因此，尽管赖氨酸可以是用于缀合的有用位点，但是在许多情况中，它并不理想。在天然蛋白质中半胱氨酸的出现频率低于赖氨酸，当具有足够的利用数量的半胱氨酸时半胱氨酸可以适合于用作缀合位点；如果存在的半胱氨酸过少，则可以通过标准蛋白质修饰方法插入一个或多个。然而，通常优选避免通过插入半胱氨酸改变天然蛋白质序列；除此之外，天然蛋白质中表面可接近的半胱氨酸通常定位于接近另外的半胱氨酸，以形成二硫键，其对于维持蛋白质的活性构象是重要的。尽管不难通过还原二硫键将二硫键转化成2个游离半胱氨酸，但是如此进行可能破坏蛋白质的二级或三级结构。已经报道了用于尝试在通过还原蛋白质上的二硫键形成的半胱氨酸残基之间插入链(tether)的一些方法。一种这类的方法牵涉砜取代的甲基丙烯酸酯衍生物。US2006/0210526。这种方法形成反应性中间体，其需要在环化前进行消除步骤，且用于多步法的条件可能导致在半胱氨酸之间的连接基(链(tether))形成不完全，且反应条件甚至可能导致蛋白质变性。另一种方法使用马来酰亚胺衍生物。WO2011/018613。然而，在这种方法中形成的缀合物存在稳定性问题，因为马来酰亚胺上的巯基的迈克尔加成是可逆的。因此，对于使化学结构部分与包含二硫键的蛋白质缀合以形成蛋白质缀合物的改进方法存在需求。具体地，需要使用二硫键成分(硫氢基)的方法，但不会消除二硫键的构象控制效应，同时还提供有效的缀合、稳定性和一致的有效负荷/蛋白质比例。此外，对于保持特定构象形式的蛋白质的固定(staple)方法存在需求(参见，例如ExpertOpin.DrugDiscov.(2011)6(9)：937-963；Tetrahedron55(1999)11711-11743)，其还可以提供使所固定的蛋白质与有效负荷缀合的方式。本发明提供这类方法，包括用于在酮修饰的蛋白质或多肽与烷氧基胺化合物之间形成肟的改进方法。概述本发明提供用于使酮修饰的多肽或蛋白质与氨基氧基化合物(例如，烷氧基胺或芳氧基胺)缀合以形成如下反应中示例的肟修饰的多肽或蛋白质的改进方法。该方法包括选择促进高度有效地形成肟的条件，提供高收率的肟和更完全的肟形成；结果是肟形成的收率改善，并且对于具有两个或多个酮修饰部分的多肽或蛋白质，产物的均匀性改。该方法包括使用胺或胺盐作为促进剂，典型地在pH3-8的缓冲液中进行。通常，促进剂或缓冲液或它们两者包含羧酸，例如可以使用乙酸盐或苯甲酸盐缓冲剂。任选地，胺可以作为羧酸盐使用，或它可以是羧基-取代的胺化合物，其可以为两性离子型的。苯胺、氨基苯甲酸、3,5-二氨基苯甲酸、肼类和3,5-二羧基苯胺是用于这些方法的适合的胺类。在一个优选的实施方案中，所述酮修饰的多肽和肟具有如下所示的式，其中硫原子来自所述多肽的半胱氨酸基团：其中n是2-8，优选2或4，且n表示存在于多肽上的酮修饰或衍生自酮修饰的肟的数量。所述多肽可以是抗体或抗体片段，其中两个硫原子来源于多肽的链间二硫键。因为改进的方法提高了肟形成的效率，所以它们在肽类中特别有用，其中n大于1，因为它们改善了缀合产物的均匀性。尤其是在抗体中，其中典型地存在可利用于酮修饰的4个二硫键，所述改进的方法提高了缀合产物的收率、例如每个抗体分子具有4个有效负荷基团(DAR＝4)的抗体-药物缀合物(ADC)的收率。ADC中的均匀性的重要性是很确定的，正如MylotargTM的经历所示例的，其中认为不均匀性导致了第一种USFDA批准的ADC从市场上撤回。在一个方面，本发明提供了如下的方法，其使用在蛋白质表面上形成二硫键的两个半胱氨酸残基来使有效负荷连接至蛋白质，形成蛋白质缀合物。该方法包括还原二硫键，得到两个游离巯基，并且使用链(tether)将这两个巯基连接在一起，所述链使得它们保持在与它们形成二硫键时所占据的位置大致相同的位置上。保持半胱氨酸基团在基本相同的位置上使得在二硫键还原时可能发生的对蛋白质构象的任何不良影响降至最低。所引入的以便将2个巯基连接在一起的链包含能用于结合所关注的有效负荷的反应性官能团。在一些实施方案中，所述链包含足以与外部的氨基反应形成亚胺或肟或腙连接基团的羰基，且有效负荷通过形成这样的连接基团与活化的蛋白质缀合。例如，还原的蛋白质可以与1,3-二卤代丙酮例如二氯丙酮或二溴丙酮反应，由此插入将这2个硫原子连接在一起的3-碳链。这可以适合地模拟二硫键的作用，即，使蛋白质保持在与存在二硫键时所具有的构象极为类似的构象，同时还提供高于该二硫化物的稳定性和用于连接有效负荷的位置。用于本发明方法和组合物中的链提供了化学反应性官能团，且包含在两个半胱氨酸硫原子之间的该类型的链的蛋白质在本文中被称作活化的蛋白质。优选的链是通过使还原的二硫化物基团与1,3-二氯丙酮反应得到的酮连接基，即-CH2-C(O)-CH2-。可以使用所述链上的官能团使有效负荷连接至活化的蛋白质。例如，通过使蛋白质的巯基与二卤代丙酮反应形成的链提供了作为缀合用的位置的羰基。包含适合的胺(胺化的有效负荷)、优选如本文进一步所述的式R-O-NH2中的氨基氧基的有效负荷可以容易地通过在有效负荷的氨基氧基官能团与所述链的羰基(酮)之间形成肟来与这类活化的蛋白质缀合。在一个优选的实施方案中，使具有插入在两个半胱氨酸残基之间的酮的活化的多肽或蛋白质与烷氧基胺(RONH2)在胺促进剂的存在下接触，其中烷氧基(R)包含有效负荷，例如治疗剂或能够用于连接治疗剂的反应性基团。适合的胺促进剂包括苯胺或苯铵盐(例如乙酸苯铵盐、苯甲酸苯铵盐等)、酰基肼类(例如乙酰肼)或氨基苯甲酸例如PABA、3-氨基苯甲酸、3,5-二氨基苯甲酸、3,5-二羧基苯胺等。促进有效肟形成的适合的反应条件在本文中提供。这些方法可以应用于具有一个或多个可接近的二硫连接基团的任意蛋白质，并且典型地用于具有500Da以上且典型地2,000Da以上的分子量的天然蛋白质，其中二硫键存在于所述蛋白质的天然或活性形式中。它们可以用于包含多于一个的二硫化物基团、例如2-10个或典型地至多6个二硫化物基团的蛋白质，其中至少一个是表面可接近的，用常规的二硫化物还原剂足以将其还原。这些方法生产了缀合物，所述缀合物对于每个所利用的二硫化物基团包含至少一个有效负荷，且所述链基本上保持了所述蛋白质的天然或活性构象。在另一个实施方案中，本发明提供通过将两个半胱氨酸残基连接在一起来固定蛋白质的方式，其提供了刚性构象，其中所述固定方法使用包含酮的连接基团将2个半胱氨酸联结在一起，所述包含酮的连接基团然后可用于使所固定的蛋白质与有效负荷缀合。固定是通过以下进行的：使包含至少2个半胱氨酸残基的蛋白质与二卤代酮例如1,3-二氯丙酮或1,3-二溴丙酮反应，形成包含[cys1]-S-CH2-C(＝O)–CH2-S-[cys2]连接基团的环化蛋白质，然后允许该连接基团与式H2N-O-L-PL的氨基氧基化合物经由肟形成进行反应，来形成缀合物，如本文进一步所述。本发明提供了制备这些固定的缀合的肽类的改进方法。附图简述图1是示例从包含二硫化物基团的蛋白质开始并且提供了蛋白质-有效负荷缀合物的本发明的应用的示意图(当X是O时)。图2示例两个蛋白质-有效负荷缀合物的偶联，它们具有作为其有效负荷的互补偶联基团。图3显示实施例1的起始蛋白质、活化的蛋白质和蛋白质缀合物的质谱。图4显示来自实施例1的叠氮基取代的CRM197构建体的SDSPage凝胶电泳。图5显示实施例4的活化的蛋白质的示意图描述和所述活化的(酮修饰的)蛋白质的LC-MS数据。图6显示实施例4中所述的蛋白质-有效负荷缀合物的示意图描述和产物的LC-MS数据。图7显示实施例6方法A的缀合物和还原的缀合物的凝胶，还附有用于比较的分子量阶梯。它还显示方法B的产物的LC-MS，其显示形成几种不同的缀合物。图8显示来自实施例7的步骤1；步骤2、方法A(PL1)；和步骤2、方法B(PL2)的LC-MS数据。图9显示实施例8的产物的SDSPAGE凝胶和LC-MS数据。本发明实施方案的详细描述本文所用的‘蛋白质’和多肽是指包含5个或更多、典型地10个或更多通过酰胺(肽)键连接的氨基酸残基的肽类。典型地，本文所述的蛋白质主要包含或仅包含天然存在的氨基酸，不过，所述方法同样可用于包含一个或多个非天然氨基酸的多肽类。常用(但并非必需)，所述氨基酸主要或完全具有L构型且选自通常的‘必需’氨基酸。缩写DAR药物与抗体比DCM二氯甲烷DIC二异丙基碳二亚胺DIPEA二异丙基乙胺EDT乙双硫酚HBTUN,N,N′,N′-四甲基-O-(1H-苯并三唑-1-基)脲鎓六氟磷酸盐MeCN乙腈NMPN-甲基吡咯烷酮PBS磷酸缓冲盐水TCEP三(羧基乙基)膦TFA三氟乙酸TIPS三异丙基硅烷本发明提供用于在使酮修饰的多肽与取代的烷氧基胺缀合时用于肟形成的改善的条件。所述改善的条件使用有利于肟形成的胺促进剂：可以使用苯胺，但取代的苯胺类、特别是羧基-取代的苯胺类例如本文公开的那些是更适合的。还可以使用酰肼类(Acylhydrazides)，例如乙酰肼或苯甲酰基酰肼。可以添加作为游离胺或具有任意适合的抗衡离子的胺盐的胺促进剂；在一些实施方案中，优选羧酸盐抗衡离子，例如乙酸盐或柠檬酸盐。典型地，使用过量的胺促进剂。该反应典型地在pH3-8、优选pH4-8的缓冲液中进行。可以使用不同的缓冲液，包括PBS、Tris、磷酸钠、乙酸钠、甲酸钠、柠檬酸钠等，以维持适合的pH。用于反应的适合的多肽浓度高于常用浓度：在一些实施方案中，多肽浓度至少为1mg/mL或至少2mg/mL，且优选约为5mg/mL或更高，至多是其中溶解度受损(compromised)的浓度，例如至多约为25mg/mL。该反应典型地在适合于维持多肽结构和功能的温度下进行；该温度通常为4－70℃，优选10－30℃。可以使用0.5－48小时的反应时间：易于通过用已知方法监测反应进程确定反应时间。在约4℃－约25℃的温度下，少于1小时－约4小时的反应时间一般是足够的。在一些实施方案中，该方法包括在1,3-二氯丙酮的存在下还原多肽的二硫键。本文提供的数据证实，在添加打开二硫键的还原剂之前向多肽的缓冲溶液中添加二氯丙酮令人意外地提供了产物收率的显著改善。在启动二硫键还原时，存在二氯丙酮在多肽上多于一个二硫键被还原时是特别重要的。例如，当多肽是抗体时，用TCEP还原还原了4个链间二硫键，从而允许与二氯丙酮反应，以引入4个包含酮的束缚基团。当反应通过首先添加TCEP以启动还原步骤、然后添加二氯丙酮进行时，完全修饰的抗体的收率约为33-35％(pH8.0、50mMTRIS作为缓冲液，环境温度)。约50％的所述多肽产物包含与轻链片段共价连接的重链片段。当在相同条件下在添加TCEP前将1,3-二氯丙酮与多肽底物一起预温育时，完全修饰的抗体的收率增加至75-77％。用于这些反应的产物组成通过微芯片电泳SDS方法评价(参考文献：Electrophoresis2012,33,765–772.)。HC-HC、HC-LC和HC-HC-LC片段的检测显示对所关注的共价束缚(tethered)的产物的部分修饰(链间二硫键中的1个或2个已经被二氯丙酮-衍生的链替代)，且对应于(HC)2(LC)2的‘完整’抗体相当于完全修饰的四聚化抗体，其具有的链间二硫键各自被二氯丙酮-衍生的链替代。本发明应用的实例如图1中所示。该图描述表示为环并且具有暴露的二硫化物基团的蛋白质。二硫化物被还原，形成具有2个衍生自二硫化物的游离巯基。然后使还原的蛋白质与二卤代丙酮或类似的双-亲电体(例如1,3-二氯丙酮或1,3-二溴丙酮)反应，形成活化的蛋白质，其中2个巯基通过官能团化的链连接在一起：本实例中的链包含酮基，其具有倾向于席夫碱形成的相对反应性。然后使有效负荷分子与所述活化的蛋白质的所述链通过席夫碱形成而连接，得到蛋白质缀合物。本实例中的有效负荷通过连接基连接至所述链。式H2N-X-L-PL的化合物(其中PL是有效负荷化合物)包含活化的氨基(H2N-)，其通过连接基L连接至PL，且通过使用氨基氧基或类似活化的胺、-X-NH2(其中X是O)使胺尤其具有反应性，这有利于酮羰基与连接至PL的胺之间的席夫碱形成。可选的实施方案从具有2个游离半胱氨酸基团的蛋白质开始，例如图1中还原的蛋白质，并且使用它们‘固定’蛋白质为限定的构象，同时还提供了用于要缀合在所述固定的蛋白质上的有效负荷的连接点。本发明的方法适于使用任意酮修饰的多肽，但尤其可用于由包含至少一个位于2个半胱氨酸之间的二硫键或包含2个游离半胱氨酸残基的蛋白质形成缀合物，所述2个游离半胱氨酸残基可以通过与1,3-二卤代丙酮反应剂反应而连接在一起。典型地，所述蛋白质是这样的蛋白质，其中2个巯基与二氯丙酮或二溴丙酮在本文所述的条件下反应，产生所述2个巯基的至少50％的交联，并且通常交联度至少为约70％、80％或90％。两个要连接在一起的半胱氨酸可以位于单一多肽上，或它们可以位于形成蛋白质复合物的单独的各多肽上。在一些实施方案中，所述方法使用具有1-6个二硫键或2-6个游离半胱氨酸残基的蛋白质并且包括还原这些二硫键的至少一个。包含二硫键的蛋白质可以是任意的具有至少5个氨基酸残基、优选至少10个氨基酸的多肽，其在单一多肽序列或蛋白质复合物(其中二硫键使一个多肽序列连接至另一个氨基酸或多肽)内包含二硫键，条件是该复合物在二硫键被还原以便在硫原子之间插入链时并未快速地分离。用于本发明方法的典型的蛋白质包括：环肽类和线性肽类，其包含约5－约5000个氨基酸，典型地至少10个氨基酸且至多约为1000个氨基酸，包括功能性蛋白质，例如酶或受体；具有至少一个二硫键的蛋白质复合物(通常连接2个单独的多肽链)；结构蛋白；用作疫苗骨架的蛋白质，例如CRM197或其它具有佐剂活性的蛋白质；和抗体或抗体片段。用于这些方法的特别有用的蛋白质包括抗体，尤其是单克隆抗体，包括改造的抗体、修饰的抗体和抗体片段；疫苗载体蛋白，例如CRM197；和具有至少一个二硫键或至少两个半胱氨酸残基并且具有500－500,000、典型地1,000－200,000的分子量的单链蛋白质。例如，用于改造抗体或其它蛋白质以便导入一个或多个半胱氨酸残基，以及用于修饰抗体的方法是本领域众所周知的。所述方法尤其可用于具有至少两个链间二硫键的抗体和抗体变体，包括IgG和Fc。这些方法也可用于疫苗载体蛋白，例如白喉类毒素、白喉类毒素的无毒性交叉反应性材料(197)(CRM197)、破伤风类毒素、钉形贝血蓝蛋白、脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)外膜蛋白和无法分类的流感嗜血菌(H.influenza)-衍生的蛋白质D。可以通过已知方法和/或本文公开的方法用抗原使这些疫苗载体蛋白官能团化。本方法还可用于连接佐剂化合物，例如TLR激动剂(TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8或TLR9的配体)，包括咪喹莫特、咪唑并喹啉类和gardiquimod、PRR配体、RLR配体、NOD2配体、环二-AMP、环二-GMP、鞭毛蛋白、单磷酰脂质A、N-羟乙酸化胞壁酰二肽(N-glycolatedmuramuldipeptide)、CpG寡脱氧核苷酸(CpGODN)、三酰化脂蛋白或聚(I:C)，来得到增强的免疫应答。用于本发明的方法和组合物的包含二硫键的蛋白质的二硫键被还原成2个游离的巯基：用于这类还原的方法是本领域众所周知的。在一些实施方案中，该还原使用还原剂进行，所述还原剂选择性地还原易于接近蛋白质周围溶剂的二硫键：一种适合的还原剂是三(2-羧基乙基)膦(TCEP)及其盐—参见，AnalysisBiochemistry273,73–80(1999)。还可以使用其它已知的还原二硫化物的物质，例如二硫苏糖醇、2-巯基乙醇、半胱胺和二硫代丁胺(JMPerkel,Chem.Eng’gNews,Feb.29,2012；Lukesh等人,J.Am.Chem.Soc.,134,4057-59(2012))和三烷基膦类，例如三丁膦(WO2008/157380)。用于还原蛋白质中的二硫键的方法是本领域众所周知的。连接基L可以是使有效负荷化合物连接至–X-NH2的任意适合的有机连接基团，其中X表示O。适合的连接基团的一些实例包括[X]-(CH2)1-6-[PL]；[X]-CH2C(＝O)-[PL]；[X]-CH2C(＝O)-NH-[PL]；[X]-CH2C(＝O)-O-[PL]；[X]-(CH2CH2O)n-[PL]；[X]-苯基-C(O)NH-[PL],[X]-(CH2)1-10-C(＝O)-NH-(CH2)2-10-NH-C(＝O)-(CH2)0-10-(OCH2CH2)0-10-(AA)0-10-[PL](AA可以是任何的必需氨基酸，例如glu、gly、ala、asp等)等，其中n典型地是1-20，且[X]和[PL]分别表示连接基的哪个末端连接至X以及哪个末端连接至PL。在一些实施方案中，连接基L可以具有2或3个连接的有效负荷以便增加缀合物上的有效负荷载量，且其中多于一个的有效负荷连接至指定的连接基，有效负荷可以相同或不同。适合的连接基还包括这些基团的成分的组合：连接基的本质对于实施本发明而言并不重要，且可以基于连接至至少一个有效负荷PL的方法的便利性和可利用性或基于缀合物的期望的理化特性。适合的连接基的选择属于本领域技术人员的水平范围，并且取决于有效负荷的结构和用于修饰它以便连接连接基L的可利用的方法。典型地，连接基通过酰胺或酯基团在一端或两端上被连接；通常连接基L包含肽键或酯，以便在体内被蛋白酶或酯酶的活性所裂解(例如val-cit，一种被组织蛋白酶B裂解的二肽；或Gly-phe-leu-gly，其也可以被组织蛋白酶B裂解)；任选地，它包含一个或多个环氧乙烷单元(-OCH2CH2-)；且在许多实施方案中，它包含至少一个且至多6个氨基酸结构部分。L的适合的实施方案还可以包含一个或多个间隔基，其可以选自如下基团：(a)键、-O-、-S-、-S-S-、-NH-、-N((C1-C6)烷基)-、–NH-C(O)-NH-、–C(O)-NH-、–NH-C(O)-；(b)(C1-C20)亚烷基、(C2-C20)亚烯基、(C2-C20)亚炔基、-Z-(C1-C20)亚烷基-、-Z-(C2-C20)亚烯基、-Z-(C2-C20)亚炔基、(C1-C20)亚烷基-Z-(C1-C20)亚烷基、(C2-C20)亚烯基-Z-(C2-C20)亚烯基、(C2-C20)亚炔基-Z-(C2-C20)亚炔基，其中Z是–NH-、-N(C1-C6)烷基)-、–NH-C(O)-NH-、–C(O)-NH-、–NH-C(O)-、(C3-C7)亚环烷基、亚苯基、亚杂芳基或亚杂环，且其中所述(C1-C20)亚烷基、所述(C2-C20)亚烯基和所述(C2-C20)亚炔基结构部分各自独立地任选地包含一个或多个散布于所述结构部分内的氧原子，使得氧原子被至少一个、优选两个碳原子分隔开；(c)(C3-C7)亚环烷基、(C3-C7)亚环烷基-Y-(C3-C7)亚环烷基、-Y-(C3-C7)亚环烷基、亚苯基、-Y-亚苯基、亚苯基-Y-亚苯基、亚杂芳基、Y-亚杂芳基、亚杂芳基-Y-亚杂芳基、亚杂环、-Y-亚杂环或亚杂环-Y-亚杂环，其中Y是(C1-C20)亚烷基、(C2-C20)亚烯基、(C2-C20)亚炔基、-O-、-C(O)-、-S-、–NH-、-N((C1-C6)烷基)-、–NH-C(O)-NH-、–C(O)-NH-或–NH-C(O)-，且其中所述(C3-C7)亚环烷基、所述亚苯基、所述亚杂芳基和所述亚杂环结构部分各自分别任选地被1－3个选自卤素、(C1-C4)烷基或卤素取代的(C1-C4)烷基的取代基取代；(d)-[OCH2CH2]v-，其中v是1-2000，优选1-10；和(e)包含1－100个氨基酸、优选1-30或1-6个氨基酸的肽；(f)能够携带2、3、4、5或6或2-10个有效负荷部分的多价连接基。此外，L可以是或可以包含可裂解的连接基，例如Val-Cit(缬氨酸-瓜氨酸，一种选择性地被组织蛋白酶B裂解的二肽)或val-cit-PABC(缬氨酸-瓜氨酸对-氨基苄基氨基甲酸酯，参见，BioconjugateChem.19(10),1960-63(2008))、二硫化物、或被葡糖醛酸糖苷酶裂解的连接基，例如存在于这种下式中的连接基：其中蛋白质表示用于缀合的蛋白质，PL表示如本文所述的有效负荷，且L1和L2独立地是任选的连接基，例如上述基团L。(ACSMed.Chem.Letters,第1卷,277-280(2010)。有效负荷(PL)可以是用于连接至蛋白质的任何结构部分。可以有用地连接至蛋白质的化合物的许多实例是本领域已知的。实例包括能够使得使用者定位或鉴定所述蛋白质的标记结构部分，包括结合金属离子以便提供缀合物的可检测性的鳌合剂；结合结构部分，例如生物素或抗生物素蛋白、聚核苷酸类、抗体或其片段、包含5-15个氨基酸残基的聚-Arg或聚-lys等，这使得易于纯化或分离该蛋白质或使其附加于表面；改变特性的基团(property-modifyinggroups)，例如脂肪酸基团或聚乙二醇(PEG)；抗原基团，例如多糖类，或作为特定类型细胞或细菌的特征的细胞表面蛋白；能够使得修饰的蛋白质或肽连接至另一个分子以制备更复杂的缀合物的偶联基团，例如双特异性抗体(参见图2)；和生物活性化合物，包括核酸，如RNA、DNA、mRNA、siRNA及其片段；药物化合物，例如各种治疗药物；和放射性核素和细胞毒素，其可以携带在所述蛋白质上到达期望的组织或细胞，在此它们可以产生期望的作用。这些携带的化合物可以起作用，同时它们保持与蛋白质或其部分缀合，或它们可以首先从蛋白质上脱离，条件是连接基是易于在体内裂解的连接基团。用于这些方法的适合的药物有效负荷包括微管抑制剂、拓扑异构酶I抑制剂、嵌入剂、胞内信号传导途经抑制剂、激酶抑制剂、转录抑制剂例如siRNA、aRNA和miRNA和DNA小沟结合剂；这些有效负荷包括这样的化合物类型，例如美登素类(maytansinoids)、阿里他汀(auristatins)、鹅膏亭类、刺孢霉素、psymberins、多卡米星、蒽环类(anthracyclins)、喜树碱、多柔比星、紫杉醇类(taxols)、吡咯苯并二氮杂类等。这些具有治疗或诊断用途的药物有效负荷的具体实例包括紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、光辉霉素、放线菌素、glucorticoids、嘌呤霉素、表柔比星、环磷酰胺、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、f-氟尿嘧啶、铂(platins)、链脲霉素、美浓霉素C、蒽环类、更生霉素或放线菌素、博来霉素、光辉霉素、氨茴霉素、多卡米星、异环磷酰胺、米托蒽醌、道诺霉素、洋红霉素、animoterin、美法仑、埃斯波霉素、lexitropsins、阿里他汀(auristatins)(例如阿里他汀E、阿里他汀F、AEB、AEVB、AEFP、MMAE、MMAF)、艾榴素(eleuthorobin)、纺缍菌素、鬼臼毒素、美登素类包括美坦辛和DM1和考布他汀(combretestatins)。可以用作有效负荷的适合的偶联基团(可以用于使缀合物与另外的结构部分偶联的基团)包括马来酰亚胺、硫醇类、α-卤代酮类(例如--C(＝O)-CH2-X，其中X是氯、溴或碘)、羧酸、胺类、羟基、烯类、炔类、包括可以用于不含铜的‘点击’化学的环辛炔类、叠氮化物等。使用这些偶联基团使本发明的缀合物连接至具有互补偶联基团的另外的化合物的方法是本领域众所周知的，其包括硫醇至马来酰亚胺的迈克尔加成、使用α-卤代酮的硫醇烷基化、胺与羧酸之间的酰胺键形成、‘点击’化学(参见，例如Meldal等人,ChemRev.,第108卷,2952-3015(2008))以便通过形成1,2,3-三唑环使叠氮化物连接至炔和‘不含铜的点击’化学。参见，例如Meeuwissen等人PolymerChemistry,第3卷,1783-95(2012)。‘互补’偶联基团是易于组合形成共价键的两个偶联基团，例如上述举出的对(羧酸盐/酯+胺以形成酰胺；叠氮化物+炔以形成1,2,3-三唑；马来酰亚胺+硫醇，其中巯基通过迈克尔加成添加到双键上；α-卤代酮+硫醇，其通过硫醇的烷基化形成α-硫代酮等)。图2显示了将包含作为有效负荷的偶联基团的缀合物与包含互补偶联基团的第二种缀合物偶联。在具体的实例中，用作有效负荷(PL)的偶联基团选自卤素、-C≡CH、-C＝CH2、-OH、-SH、-SO2-CH＝CH2,–O-NH2、-N3、-O-P(O)(OH)2、-C(O)-H、-C(O)-CH3、-NH-C(O)-CH2-I、马来酰亚胺、3,5-二氧代-1,2,4-三唑烷-4-基、1H-吡咯-2,5-二酮-1-基、吡啶-2-基-二硫烷基、四氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-2(3H)-酮-4-基、1-羰基氧基-2,5-二氧代吡咯烷、1-羰基氧基-2,5-二氧代吡咯烷-3-磺酸钠、-SSR1、-C(O)-OR1、-N(R1)H、-NH-N(R1)H，其中R1是H或(C1-C6)烷基以及-C(O)-R2，其中R2是H、(C1-C4)烷基、卤素取代的(C1-C4)烷基、-CH＝CH2、N(R1)H或-NH-N(R1)H。当这些有效负荷用作起始有效负荷(PLa)时，缀合物可以与包含第二种有效负荷(PLb)的化合物反应，并且可以在形成新缀合物的过程中引入另外的连接基L’：PLa是偶联基团，例如马来酰亚胺、被保护的巯基、N3、炔R是PLa的互补反应性基团PLb是新的有效负荷，例如标记或生物学物质，包括蛋白质、抗体、si-RNA、毒素等注意，在这些反应中，本领域技术人员应当理解，L和L’可以保留PLa和/或R的一部分，视用于连接新的有效负荷PLb的反应而定。下面编号的实施方案示例本发明的具体方面。1.将酮修饰的多肽转化成肟修饰的多肽的方法，其中该方法包括使酮修饰的多肽在胺促进剂的存在下接触式R-O-NH2的基团。2.实施方案1的方法，其中所述胺促进剂是苯胺、取代的苯胺、包括3,5-二氨基苯甲酸或3,5-二羧基苯胺，或酰肼，例如乙酰肼。在这些方法的一个实施方案中，所述酮修饰的多肽通过将二硫化物还原成2个游离巯基而由二硫化物形成；且所述游离的巯基通过与1,3-二氯丙酮或1,3-二溴丙酮反应而连接在一起。在该方法的一个具体的实施方案中，使具有可还原二硫键的多肽与还原剂、例如但不限于TCEP和1,3-二氯丙酮在缓冲液中接触，所述缓冲液例如但不限于TRIS或PBS。优选地，使所述多肽和缓冲液与1,3-二氯丙酮合并，然后加入还原剂，使得在还原发生时存在1,3-二氯丙酮。3.实施方案1或2的方法，其中式R-O-NH2的基团是式H2N-O-L-PL的化合物，其中L表示连接基，且PL表示有效负荷基团。4.实施方案1的方法，其中所述酮修饰的多肽具有下式结构：其中环表示多肽，且每个硫原子是所述多肽的半胱氨酸残基的巯基，且z是1-10的整数。5.上述实施方案任一项的方法，其中蛋白质-有效负荷缀合物具有下式结构：其中X是O，L表示连接基，且PL、PL1和PL2在每次出现时独立地表示有效负荷基团，其中m和n各自独立地是1-10；z是1-10，优选1-5，条件是m和n均不为0。6.上述实施方案任一项的方法，其中所述多肽是抗体(例如IgG、Fab或F(ab)2、Fc)。7.实施方案1-5任一项的方法，其中所述多肽是疫苗载体。8.实施方案1-8任一项的方法，其中所述有效负荷包含治疗剂。9.实施方案1-7任一项的方法，其中所述有效负荷包含可检测标记或适合于连接有效负荷基团的反应性基团，所述有效负荷基团包含互补的反应性基团。10.实施方案8的方法，其中L包含可裂解的连接结构部分。11.实施方案1-10任一项的方法，其中L包含至少一个间隔基，其选自：(a)键、-O-、-S-、-NH-、-N((C1-C6)烷基)H-、–NH-C(O)-NH-、–C(O)-NH-、–NH-C(O)-；(b)(C1-C20)亚烷基、(C2-C20)亚烯基、(C2-C20)亚炔基、-Z-(C1-C20)亚烷基-、-Z-(C2-C20)亚烯基、-Z-(C2-C20)亚炔基、(C1-C20)亚烷基-Z-(C1-C20)亚烷基、(C2-C20)亚烯基-Z-(C2-C20)亚烯基、(C2-C20)亚炔基-Z-(C2-C20)亚炔基，其中Z是–NH-、-N(C1-C6)烷基)-、–NH-C(O)-NH-、–C(O)-NH-、–NH-C(O)-、(C3-C7)亚环烷基、亚苯基、亚杂芳基或亚杂环，且其中所述(C1-C20)亚烷基、所述(C2-C20)亚烯基和所述(C2-C20)亚炔基结构部分各自独立地任选地包含1-10个散布于所述结构部分内的氧原子；(c)(C3-C7)亚环烷基、(C3-C7)亚环烷基-Y-(C3-C7)亚环烷基、-Y-(C3-C7)亚环烷基、亚苯基、-Y-亚苯基、亚苯基-Y-亚苯基、亚杂芳基、Y-亚杂芳基、亚杂芳基-Y-亚杂芳基、亚杂环、-Y-亚杂环或亚杂环-Y-亚杂环，其中Y是(C1-C20)亚烷基、(C2-C20)亚烯基、(C2-C20)亚炔基、-O-、-C(O)-、-S-、–NH-、-N((C1-C6)烷基)H-、–NH-C(O)-NH-、–C(O)-NH-或–NH-C(O)-，且其中所述(C3-C7)亚环烷基、所述亚苯基、所述亚杂芳基和所述亚杂环结构部分各自分别地任选地被1-3个选自卤素、(C1-C4)烷基或卤素取代的(C1-C4)烷基的取代基取代；(d)-[OCH2CH2]v-、-X{CH2[OCH2CH2]v}w-，其中v是1-2000，w是1-4；X是C或N；和(e)包含1-100个氨基酸的肽；和(f)树枝状大分子，包括树枝状聚合物、树突状分子(dendrons)和超支化聚合物(hyperbranchedpolymers)。12.将包含可还原二硫键的多肽转化成包含式[PP]–S-CH2-C(＝O)-CH2-S-[PP]的基团的酮修饰的多肽的方法，其中每个S是来自二硫键的硫，且[PP]表示在此该连接基的末端连接至所述多肽，其中该方法包括形成包含可还原二硫键的多肽、含水缓冲液和1,3-二卤代丙酮的混合物，然后添加能够还原所述二硫键的还原剂。13.实施方案12的方法，其中所述1,3-二卤代丙酮是1,3-二氯丙酮。14.实施方案12或13的方法，其中所述还原剂是水溶性膦或膦盐。TCEP是适合的还原剂。15.实施方案12-14任一项的方法，其中所述多肽是抗体或抗体片段。适合地，所述多肽是抗体，其可以是单克隆抗体且可以是人源化的。针对作为癌细胞的特征的抗原的抗体是适合的多肽类。16.将酮修饰的多肽转化成肟修饰的多肽的方法，其中该方法包括使酮修饰的多肽在胺促进剂的存在下和至少约1mg/mL的多肽浓度下接触式R-O-NH2的基团。典型地，这些方法中的R包含如本文所述的有效负荷和连接基。适合的有效负荷包括美登素类(例如DM1、DM4)、阿里他汀(例如MMAE、MMAF)、鹅膏亭类、刺孢霉素、psymberins、多卡米星、蒽环类、喜树碱、多柔比星、紫杉醇、吡咯苯并二氮杂类等。17.权利要求5的方法，其中所述酮修饰的多肽通过实施方案12-16任一项的方法制备。18.实施方案17的方法，其中所述胺促进剂是羧基取代的苯胺或是酰基肼。19.实施方案12-17任一项的方法，其中式R-O-NH2的基团是式H2N-O-L-PL的化合物，其中L表示连接基，且PL表示有效负荷基团。20.实施方案16的方法，其中所述酮修饰的多肽具有下式结构：其中环表示多肽，且每个硫原子是所述多肽的半胱氨酸残基的巯基。21.实施方案16-20任一项的方法，其中蛋白质-有效负荷缀合物具有下式结构：其中X是O，L表示连接基，z是1-10的整数，且PL、PL1和PL2在每次出现时独立地表示有效负荷基团。22.实施方案12-21任一项的方法，其中所述多肽是抗体。23.实施方案12-21任一项的方法，其中所述多肽是疫苗载体。24.实施方案16-23任一项的方法，其中所述有效负荷包含治疗剂。25.实施方案16-24任一项的方法，其中所述有效负荷包含可检测标记或结合基团。26.实施方案25的方法，其中L包含可裂解的连接结构部分。27.实施方案16-26任一项的方法，其中L包含至少一个间隔基，其选自：(a)键、-O-、-S-、-NH-、-N((C1-C6)烷基)-、–NH-C(O)-NH-、–C(O)-NH-、–NH-C(O)-；(b)(C1-C20)亚烷基、(C2-C20)亚烯基、(C2-C20)亚炔基、-Z-(C1-C20)亚烷基-、-Z-(C2-C20)亚烯基、-Z-(C2-C20)亚炔基、(C1-C20)亚烷基-Z-(C1-C20)亚烷基、(C2-C20)亚烯基-Z-(C2-C20)亚烯基、(C2-C20)亚炔基-Z-(C2-C20)亚炔基，其中Z是–NH-、-N(C1-C6)烷基)H-、–NH-C(O)-NH-、–C(O)-NH-、–NH-C(O)-、(C3-C7)亚环烷基、亚苯基、亚杂芳基或亚杂环，且其中所述(C1-C20)亚烷基、所述(C2-C20)亚烯基和所述(C2-C20)亚炔基结构部分各自独立地任选地包含1-10个散布于所述结构部分内的氧原子；(c)(C3-C7)亚环烷基、(C3-C7)亚环烷基-Y-(C3-C7)亚环烷基、-Y-(C3-C7)亚环烷基、亚苯基、-Y-亚苯基、亚苯基-Y-亚苯基、亚杂芳基、Y-亚杂芳基、亚杂芳基-Y-亚杂芳基、亚杂环、-Y-亚杂环或亚杂环-Y-亚杂环，其中Y是(C1-C20)亚烷基、(C2-C20)亚烯基、(C2-C20)亚炔基、-O-、-C(O)-、-S-、–NH-、-N((C1-C6)烷基)H-、–NH-C(O)-NH-、–C(O)-NH-或–NH-C(O)-，且其中所述(C3-C7)亚环烷基、所述亚苯基、所述亚杂芳基和所述亚杂环结构部分各自分别任选地被1-3个选自卤素、(C1-C4)烷基或卤素取代的(C1-C4)烷基的取代基取代；(d)-[OCH2CH2]v-或-J-{CH2[OCH2CH2]v}w-，中v是1-2000，w是1-4，且J是CH2或NH；(e)包含1-100个氨基酸的肽；和(f)树枝状大分子，包括树枝状聚合物、树突状分子和超支化聚合物。在本发明的方法中，如图1中所概括的，包括还原修饰的蛋白质的二硫键，形成还原的包含2个游离巯基的蛋白质。使所述还原的蛋白质与官能团化的束缚(tethering)化合物接触，其能够与所述还原的蛋白质上的2个游离巯基反应以便将所述游离巯基束缚在一起，而所述链上还保留至少1个适合于连接有效负荷的官能团。在一些实施方案中，所述链上的官能团是羰基，例如，当使得游离巯基与1,3-二卤代酮反应时得到的酮。因为游离巯基具有强烈的亲核性，所以它们易于通过包括置换离去基并且形成共价硫-碳键的不可逆反应与亲电体例如烷基卤或甲苯磺酸烷基酯类反应。官能团化的包含羰基的束缚化合物的适合的实例包括1,3-二氯丙酮和1,3-二溴丙酮。这些试剂已经用于通过将巯基束缚在一起来提供在小环肽类中的二硫化物结构部分的稳定性。参见，例如WO2008/157380(二氯丙酮与还原的环五肽反应，然后还原羰基)。还可以使用1,3-二羟基丙酮的磺酸酯类(例如甲磺酸酯、三氟甲磺酸酯、苯基磺酸酯、甲苯磺酸酯等)。这些试剂对还原的蛋白质的游离巯基有充足的反应性，从而提供合理快速的反应，来形成具有2个束缚在一起的半胱氨酸残基的活化蛋白质，其中游离巯基各自与该官能团化束缚基团共价结合。使还原的蛋白质和官能团化的束缚化合物在适合于促进束缚化合物与还原的蛋白质的2个游离巯基之间的反应的条件下，特别是在有利于导致之前以二硫键形式连接过的2个游离巯基与束缚化合物的单一分子反应的浓度和温度下接触，使得它们再次被连接在一起，但现在使用的是短的链连接它们，而不是直接的二硫键。该反应形成如图1中示例的活化蛋白质，其具有2个硫原子之间的官能团化的链[-CH2C(O)-CH2-]。图1中的链包括可以用于有效地连接有效负荷的羰基，其通过清洁和有效的席夫碱形成化学进行。应当理解，在本讨论的自始至终，尽管将蛋白质描述为环状或球形，但是该蛋白质可以是小于10个氨基酸的小多肽或者具有2个或多个亚单位或不同的蛋白质的较大的酶或复合物。二硫化物的2个硫原子可以是多聚化复合物的1个亚单位上，或它们可以在不同的亚单位上。除参与本文所述的转化二硫键外，蛋白质还可以包含另外的二硫键，它们可以被还原并且被官能团化，或可以因其在蛋白质内的位置而不被还原。尽管仅有单个二硫键、束缚基团或缀合物被显示出来，但是应当理解，包含一个这样的二硫键、键合基团或缀合物的多肽或蛋白质也可以包含多于一个。本发明的方法可以使用已知的方法选择性地还原接近折叠蛋白质表面的、溶剂可接近的二硫键，而通常不还原‘埋藏的’二硫键，后者对于维持蛋白质的总体形状和功能性(functionality)或对于保持2个亚单位在多亚单位复合物中彼此连接是必要的。如实施例所示例，蛋白质或多肽可以包含多于一个的官能团化束缚基团，且由此可以包含多于一个的缀合位置，不过，为简单起见，典型地仅描述了1个。一旦形成活化的蛋白质，则可以将有效负荷连接至官能团化的链。例如，包含胺的(或胺化的)有效负荷可以连接至由二卤代丙酮形成的所述链，其通过在有效负荷的胺与所述链的酮之间形成席夫碱来进行。适合的有效负荷化合物包含–NH2氨基团，其易于接近且易于反应；在优选的实施方案中，所述胺是被活化以形成席夫碱的胺。适合的胺类的实例包括，例如羟基胺(X＝O)、硫胺(X＝S)和肼(X＝NH)：已知这些杂原子取代的胺类易于与酮例如由二卤代丙酮形成的活化蛋白质的链上的酮缩合，如图1中所示。典型地使活化的蛋白质接触包含氨基的有效负荷，无需纯化或分离该活化的蛋白质。如果可以利用，则可以使用有效负荷(PL)上的游离–NH2基团，但如果无法利用，则其可以通过连接基来添加，如图1和实施例中所示例的。在一些实施方案中，一旦生成活化的蛋白质，则在促进所期望的席夫碱形成的条件下将氨基-有效负荷添加到形成了活化的蛋白质的反应混合物中。氨基-有效负荷然后通过其氨基团与活化蛋白质的羰基反应，如图1中所示例的，由此形成所期望的蛋白质-有效负荷缀合物，其中X是O、NH或取代的N；L是连接基；且PL表示有效负荷。实施例下列HPLC方法用于如下实施例。方法A：洗脱液A：水+0.1％甲酸,洗脱液B：乙腈+0.08％甲酸梯度：3－80％B，2min–流速1.0ml/min.柱：ProswiftMonolith4.6*50mm40℃方法B：洗脱液A：水+0.1％甲酸,洗脱液B：乙腈+0.04％甲酸梯度：3－80％B，2min–流速1.0ml/min.柱：ProswiftMonolith4.6*50mm40℃方法C：洗脱液A：水+3.75mM乙酸铵+2％乙腈,洗脱液B：乙腈梯度：2－98％B，1.7min–流速1.0ml/min.柱：AcquityCSH2.1*50mm50℃方法D(HRMS)：洗脱液A：水+0.05％甲酸+3.75mM乙酸铵,洗脱液B：乙腈+0.04％甲酸.梯度：2－98％B，4.4min–流速1.0ml/min.柱：AcquityCSH2.1*50mm50℃连接基的合成将100mL玻璃器皿中的2-氯三苯甲基氯树脂(1.55mmol/g)(0.500g,0.775mmol)在DCM(20ml)中溶胀30min，使其液体排出。向树脂中加入2-(氨基氧基)乙酸半盐酸盐(0.338g,3.10mmol)和DIPEA(1.354ml,7.75mmol)在NMP(7ml)/DCM(4ml)中的混悬液，将该体系振摇5h。排出溶剂。分别用DCM/MeOH/DIPEA(17/2/1,40mL)、DCM(50mL),NMP(50mL)和DCM(50mL)冲洗树脂。将得到的树脂用KOH/NaOH干燥过夜。将100mL玻璃器皿中的树脂(0.775mmol)在DCM(20ml)中溶胀30min，使其液体排出。向2-氨基乙基氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯盐酸盐(0.081g,0.775mmol)、HOAt(0.422g,3.10mmol)和DIPEA(1.354ml,7.75mmol)在NMP(8ml)中的混悬液中加入在NMP(2.5ml)中的HBTU(1.176g,3.10mmol)，将该体系在RT振摇2h。排出溶剂，依次用NMP(10mL)和DCM(10mL)冲洗树脂。将得到的树脂干燥过夜。将树脂(0.775mmol)装入反应容器。加入10mL20％哌啶/NMP(v/v)，将该混悬液在室温搅拌5min。排出溶剂后，再加入10mL20％哌啶/NMP(v/v)，在室温搅拌20min。将HOAt(0.316g,2.325mmol)和1-(9H-芴-9-基)-3-氧代-2,7,10-三氧杂-4-氮杂十二烷-12-酸(0.896g,2.325mmol)在NMP(8mL)中的溶液加入树脂，加入在NMP(1ml)中的DIC(0.362ml,2.325mmol)。将该反应混合物在室温搅拌2h，过滤出树脂，用NMP(10ml)冲洗4次。将得到的树脂干燥过夜。将树脂(0.775mmol)装入反应容器。向树脂中加入10mL20％哌啶/NMP(v/v)，将该混悬液在室温搅拌5min。排出溶剂后，再加入10mL20％哌啶/NMP(v/v)，在室温搅拌20min。将HOAt(0.316g,2.325mmol)和Fmoc-Glu-OtBu(0.989g,2.325mmol)在NMP(8mL)中的溶液加入树脂，加入在NMP(2.00ml)中的DIC(0.362ml,2.325mmol)。将该反应混合物在室温搅拌2h，过滤出树脂，用NMP(10ml)冲洗4次。将得到的树脂干燥过夜。有效负荷与连接基的连接将树脂(2-氯三苯甲基氯树脂,0.775mmol)装入反应容器。向树脂中加入10mL20％哌啶/NMP(0.775mmol,v/v)，将该混悬液在室温搅拌5min。排出溶剂后，再加入10mL20％哌啶/NMP(0.775mmol)，在室温搅拌20min。将18-叔丁氧基-18-氧代十八烷酸(0.862g,2.325mmol)和HOAt(0.316g,2.325mmol)在NMP(8mL)中的溶液加入树脂，加入在NMP(2.00ml)中的DIC(0.362ml,2.325mmol)。将该反应混合物在室温搅拌4h，过滤出树脂，用NMP(10ml)冲洗4次。将得到的树脂干燥过夜。在室温用20mL裂解混合物(TFA/TIPS/水＝95/2.5/2.5,v/v)将来自上述步骤的树脂步骤(0.775mmol)处理1.5h。通过过滤除去树脂，用TFA冲洗。真空浓缩滤液。使用C18柱进行RP-HPLC，用15-50％MeCN/水+0.1％TFA洗脱，得到(S)-1-(氨基氧基)-19-羧基-2,7,16,21-四氧代-9,12-二氧杂-3,6,15,20-四氮杂三十八烷-38-酸与2,2,2-三氟乙酸(1：1)(207mg,0.294mmol,37.9％收率)(PL1)。HRMS[M+1](方法D)；704.4459(测定值),704.4486(预测值)。实施例1用TCEP(xx)处理CRM197(参考文献：G.Giannini和R.Rappuoli,NucleicAcidsRes.,1984,25,4063.)，导致C201-C185二硫键还原，几乎没有或无C451-C471二硫键还原(参见，实施例3)。用1,3-二氯丙酮处理还原的CRM197，得到活化的蛋白质，其具有完整的C451-C471二硫键和通过–CH2-C(＝O)-CH2-连接基团束缚至C185的C201。使这种活化的蛋白质接触PL1，即包含氨基氧基的胺化的脂肪酸衍生物(其制备如上所述)，形成使脂肪酸衍生物连接至蛋白质的肟。预期具有连接的脂肪酸基团的缀合物减少了肾清除率，由此延长了CRM197蛋白质的循环半衰期并且增加了其作为缀合物疫苗中的载体的有用性。天然蛋白质(图3A,使用方法A)、活化的蛋白质(图3B)和蛋白质缀合物(图3C)的质谱数据如图3中所示。位置确定的具有CRM197的叠氮基化合物的合成方法A-洗脱液A：水+0.1％甲酸,洗脱液B：乙腈++0.1％甲酸梯度：3－80％B，2min–流速1.8ml/min.柱：AcQuityBEH300SEC4.6x30mm50℃SDSPage凝胶电泳–NuPage4-12％Bis-TrisGel；1.5mm*10孔向在磷酸钠缓冲液pH7.4(230μL)中的CRM197(32.5mg/ml)(185μL,0.103μmol)中加入TCEPHCl(3mg/mL,水,58.9μL,0.616μmol)。将该反应体系在室温搅拌16h，然后添加1,3-二氯丙-2-酮(20mg/mL,在DMSO中,13.04μL,2.054μmol)。将该反应体系搅拌3.5h，然后使其通过0.5mLZebaTM自旋尺寸排阻柱(7KMWCO,来自ThermoScientific)，缓冲液交换为0.1M磷酸钠缓冲液pH6，得到具有酮的CRM197(6.78mg/ml,1.3mL,纳米点滴法(nanodropmethod))。LCMS[M+1]＝58465向酮修饰的CRM197的溶液(6.78mg/ml–磷酸钠缓冲液pH6,1.3mL,0.151μmol)中加入O-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)羟基胺(300mg/ml–DMSO)(0.044mL,0.045mmol)。将该反应混合物在23℃搅拌36h，然后使其通过5mLZebaTM自旋柱，用PBS7.4洗脱，得到标题化合物(4.41mg/ml,1.6mL,80％收率,纳米点滴法)。LCMS[M+1]＝58682.5图4显示标题化合物即修饰的CRM197的SDSPage。实施例2原料制备：pE-R-P-R-L-C-H-K-G-P-Nle-C-F-OH(二硫键C6-C12)(8)的合成·中间体8a的制备(向2-氯三苯甲基氯树脂加载Fmoc-F-OH、Fmoc除去和树脂载荷测定)用DCM(3x)洗涤2-氯三苯甲基氯树脂(40.0g,64.0mmol)。加入Fmoc-F-OH(24.8g,64.0mmol)在DCM(400mL)和DIPEA(44.7mL,256mmol)，将该混悬液在室温振摇22h。用DCM/MeOH/DIPEA(17：2：1)(3x)、DCM(3x),DMA(3x)、DCM(3x)充分洗涤树脂。然后用哌啶/DMA(1：4)(400mL)混合物将树脂处理4次10min，然后用DMA(2x180ml)洗涤。收集哌啶/DMA溶液和DMA洗涤溶液用于测定树脂载量。用MeOH将1mL合并的溶液稀释至500mL，299.8nm处的UV吸光度测定为A＝0.368。这相当于Fmoc的量为46.2mmol。用DCM(3x)、DMA(3x)、DCM(3x)充分洗涤树脂，真空干燥，得到中间体8a(50.7g；载量＝0.91mmol/g)。·中间体8b的制备(线性肽的组装)使用PreludeTM肽合成仪使中间体8a(2.64g,2.40mmol)进行固相肽合成。如下进行偶联：·中间体8c的制备(从树脂上裂解，除去保护基)谨慎地用DCM(4x)洗涤中间体8b(2.40mmol)。加入含水95％TFA/EDT/TIPS混合物(95：2.5：2.5)(50mL)，将该混悬液在室温振摇1h。过滤出裂解溶液，加入新鲜裂解溶液(35mL)。将该混悬液在室温振摇1h，然后过滤出裂解溶液。加入新鲜溶液(35mL)。将该混悬液在室温振摇1h。过滤出裂解溶液。将合并的裂解溶液缓慢地倾倒在搅拌的冷庚烷/乙醚(1：1)(500mL)混合物上，得到沉淀。将该混悬液在室温搅拌2h，然后使沉淀沉降。经釉料漏斗抽吸出上清液。用冷庚烷/乙醚(1：1)(2x100mL)洗涤残余物，用釉料漏斗(frit)抽吸出上清液。在高度真空干燥固体，得到中间体8c，为米白色固体(3.75g,1.88mmol)。环肽8的制备(环化和纯化)将中间体8c(3.75g,1.88mmol)溶于H2O(375mL)。向搅拌的溶液中一次加入50mMI2在AcOH中的溶液(45.1mL,2.26mmol)，将该溶液在室温搅拌10min。加入0.5M抗坏血酸H2O溶液(5.64mL,2.82mmol)以猝灭过量的I2。浓缩该溶液至近干。该反应分两次在室温下进行：0.188mmol等级和1.69mmol等级。合并粗产物用于纯化。通过制备型HPLC纯化粗产，从ACN/H2O中冻干，得到化合物8，为白色固体(1.53g,0.767mmol)。通过分析型HPLC(分析方法C：tR＝3.43min)和UPLC-MS(分析方法B；测定值：[M+3]/3＝512.4；计算值：[M+3]/3＝512.6)分析纯产物。该实施例示例从环肽8形成活化的蛋白质。将环肽8(12mg,6.76μmol)溶于50mM磷酸Na缓冲液pH6.5(1.5ml)，在室温向其中加入TCEPHCl(2.91mg,10.13μmol)。将该反应混合物在室温搅拌1h。在室温向上述溶液中加入1,3-二氯丙-2-酮(4.29mg,0.034mmol)，将该体系在室温搅拌30min。进行RP-HPLC，用15-60％MeCN/水(含有0.1％TFA)洗脱，得到活化的蛋白质8d(6mg,2.93μmol,43.4％收率)。HRMS[M+1](方法D)；1590.7911(测定值),1590.7912(预测值).具有6和12[C6-C12]位上的2个半胱氨酸之间的–S-CH2-C(＝Z)-CH2-S-连接基团的pE-R-P-R-L-C-H-K-G-P-Nle-C-F-OH，且Z是：在室温向化合物8((S)-2-((3S,6R,14R,17S,20S,28aS)-17-((1H-咪唑-5-基)甲基)-20-(4-氨基丁基)-3-丁基-14-((S)-2-((S)-5-胍基-2-((S)-1-((S)-5-胍基-2-((S)-5-氧代吡咯烷-2-甲酰氨基)戊酰基)吡咯烷-2-甲酰氨基)戊酰氨基)-4-甲基戊酰氨基)-1,4,10,15,18,21,24-七氧代二十六氢吡咯并[2,1-i][1,23,4,7,10,13,16,19]二硫杂六氮杂环二十六烷基(dithiahexaazacyclohexacosine)-6-甲酰氨基)-3-苯基丙酸)(11.5mg,5.62μmol)与(S)-1-(氨基氧基)-19-羧基-2,7,16,21-四氧代-9,12-二氧杂-3,6,15,20-四氮杂三十八烷-38-酸化合物和2,2,2-三氟乙酸(1：1)(9.19mg,0.011mmol)在100nM磷酸Na缓冲液pH6.0(1ml)中的溶液中加入苯胺(2.051μl,0.022mmol)。添加DMSO(50μl)，得到均匀溶液。将该反应混合物在室温搅拌2h。进行RP-HPLC，用15-60％MeCN/水(含有0.1％TFA)洗脱，得到预期的缀合物(1-((Z)-((3S,6R,14R,17S,20S,28aS)-17-((1H-咪唑-5-基)甲基)-20-(4-氨基丁基)-3-丁基-6-((S)-1-羧基-2-苯基乙基氨基甲酰基)-14-((S)-2-((S)-5-胍基-2-((S)-1-((S)-5-胍基-2-((S)-5-氧代吡咯烷-2-甲酰氨基)戊酰基)吡咯烷-2-甲酰氨基)戊酰氨基)-4-甲基戊酰氨基)-1,4,15,18,21,24-六氧代二十二氢吡咯并[2,1-i][1,23,4,7,10,13,16,19]二硫杂六氮杂环二十六烷-10(1H,9H,11H)-亚基)氨基氧基)-19-羧基-2,7,16,21-四氧代-9,12-二氧杂-3,6,15,20-四氮杂三十八烷-38-酸)(4.5mg,1.646μmol,29.3％收率)。HRMS(方法D)[(M+3)/3]；759.7487(测定值),759.7462(预测值)。保留时间4.12min.实施例3向CRM197(200μg,6.2ul,0.0034μmol)在50mM磷酸Na缓冲液pH7.4(10μl)中的溶液中加入TCEPHCl水溶液(5.89μg,0.021μmol)。将该反应混合物保持在室温下15h。向该混合物中加入1,3-二氯丙-2-酮(4.58μg,0.034μmol10eq)。将该反应体系保持在室温下2h。使粗产物通过ZebaTM尺寸排阻柱。LCMS；[M+1]＝58465。这种活化的蛋白质可以与胺化的有效负荷例如TLR激动剂反应，形成缀合了化合物的载体蛋白，所述化合物可以增强针对添加到载体蛋白上的任意抗原的免疫应答。向酮修饰的CRM197的溶液(5mg/ml,磷酸Na缓冲液,pH6.0)(50μg,0.00086μmol)中加入N-(3-(4-(2-(4-(2-(5-氨基-8-甲基苯并[f][1,7]萘啶-2-基)乙基)-3-甲基苯氧基)乙基)哌嗪-1-基)丙基)-2-(氨基氧基)乙酰胺(66.8μg,0.064μmol)和苯胺(0.0020μl,0.021μmol)。将该反应体系保持在23℃下14h，基于LCMS分析得到期望的缀合物A。使反应混合物通过0.5mLZebaTM尺寸排阻柱，用PBSpH7.2缓冲液洗脱。LCMS；[M+1]＝59032.PL的合成：在RT向2-(3-溴丙基氨基)-2-氧代乙氧基氨基甲酸叔丁酯(53.3mg,0.171mmol)和8-甲基-2-(2-甲基-4-(2-(哌嗪-1-基)乙氧基)苯乙基)苯并[f][1,7]萘啶-5-胺(52mg,0.114mmol)在DMF(0.5ml)中的溶液中加入碳酸钾(39.4mg,0.285mmol)，将该体系在RT搅拌24h。加入水和EtOAc。分离有机层。用EtOAc萃取水层。用Na2SO4干燥合并的有机层，过滤，真空浓缩，得到粗Boc-保护的材料，将其溶于DMF(0.5ml)，向其中加入TFA(0.5mL,6.49mmol)。将该体系在RT搅拌30min。除去溶剂后，进行RP-HPLC纯化，用15-60％MeCN/水(含有0.1％TFA)洗脱，得到N-(3-(4-(2-(4-(2-(5-氨基-8-甲基苯并[f][1,7]萘啶-2-基)乙基)-3-甲基苯氧基)乙基)哌嗪-1-基)丙基)-2-(氨基氧基)乙酰胺(25mg,0.024mmol,21.02％收率)。LCMS；[M+1]＝586.实施例4如下实施例使用抗-VEGF抗体片段(VEGF-Fab)和脂肪酸衍生物，添加所述脂肪酸衍生物以增加该抗体片段的血清半衰期。使用TCEP、在PBSpH7中、在几个较不易于接近的链内二硫键的存在下，对链间二硫键进行选择性还原。使还原的蛋白质与二卤代丙酮(二溴丙酮或二氯丙酮)反应，得到活化的蛋白质，其具有将硫原子连接在一起的3-碳链–CH2-C(＝O)-CH2-。使活化的蛋白质接触具有作为反应性部分的氨基氧基的连接基-有效负荷结构部分，以与衍生自二卤代丙酮的酮形成肟。本实施例中的连接基L是其中[X]和[PL]分别表示–X-NH2和有效负荷PL的连接点，且有效负荷是C18脂肪酸基团。在本实施例中，X是–ONH2，其与活化蛋白质的丙酮基酮的羰基形成肟。图5描述本实施例的活化蛋白质的形成并且显示其形成的质谱证据。向A(72.72μg,6.0uL,0.0015μmol)在PBSpH7.4(8μl)中的溶液中加入TCEPHCl(2.63μg,0.0092μmol)。将该反应混合物保持在室温下3h。加入1,3-二氯丙-2-酮(1.945μg,0.015μmol)，将该反应体系在室温下静置1h。A被消耗，并转化成期望的产物B。使粗产物通过尺寸排阻柱。LCMS；[M+1]＝47538在室温向B(36.36μg,0.00076μmol)在PBSpH7.4(22.5μl)中的溶液中加入(S)-1-(氨基氧基)-19-羧基-2,7,16,21-四氧代-9,12-二氧杂-3,6,15,20-四氮杂三十八烷-38-酸化合物和2,2,2-三氟乙酸(1：1)(64.33μg,0.079μmol)与苯胺(0.00105μl,0.011μmol)，将该体系在23℃搅拌14h。B被消耗并转化成期望的产物C。使粗产物通过ZebaTM自旋脱盐柱7KMWCO(来自ThermoScientific))LCMS；[M+1](方法A)＝48222。图6描述蛋白质缀合物的形成并且显示缀合物形成的质谱证据。实施例5将肽A(1mg,0.519μmol)溶于缓冲液(2.5ml)(50mM磷酸钠缓冲液pH6.5(1.5mL)、40％MeCN(0.9mL)、2.5％DMF(0.1mL))，在室温向其中加入TCEPHCl(0.164mg,0.571μmol)。将该反应混合物搅拌60min。在室温向该反应混合物中加入在DMF(0.1ml)中的1,3-二溴丙酮(0.164mg,0.571μmol)。搅拌3min后，基于分析LCMS观察到形成定量转化的丙酮加合物。LCMS(方法C)[M+2]/2＝991.实施例6：抗Her2抗体-药物缀合物的制备方法A：步骤1.步骤1：向抗HER2IgG(20.36mg/ml，在0.1MTris/HCl中,30μl,610.8μg,0.0041μmol)和1,3-二氯丙-2-酮(66.1μg,0.495μmol)中的溶液中加入TCEPHCl(14.17μg,0.049μmol)，将该体系在4℃搅拌16h。使该反应混合物通过0.5mLZebaTM自旋柱，用PBS缓冲液(pH7.2)洗脱。通过使用取自反应溶液的样品进行的PNGaseF(NewEnglandBiolab)、内蛋白酶Lys-C(Roche)和非还原/还原SDSPAGE(4-12％Bis-Tris凝胶与胶体蓝染色)分析证实4个链间二硫键的修饰。LCMS(方法B)；145394(使用PNGaseF去糖基化后)。步骤2：在室温向步骤1中制备的修饰的抗-HER2IgG(7.14mg/mL,100mM乙酸苯铵缓冲液pH4.8,600μg,0.0040μmol)中的溶液中加入(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(氨基氧基)-N-甲基己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基己酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(30mg/ml,104μg,0.121μmol)。将得到的混合物在室温搅拌19h。使该混合物通过0.5mlZebaTM自旋柱1次，用PBS缓冲液(pH7.2)洗脱。通过使用取自反应溶液的样品进行的PNGaseF(NewEnglandBiolab)、内蛋白酶Lys-C(Roche)和非还原/还原SDSPAGE(4-12％Bis-Tris凝胶与胶体蓝染色，如下所示)分析证实酮的修饰。DAR(药物-抗体比)为3.2。LCMS(方法B)；148770(去糖基化后)。图7显示缀合物和还原后的缀合物(参见下文)。将SeeBlue预染的标准品(Invitrogen)用作表观分子量阶梯。这表明在缀合产物中几乎不存在或不存在未缀合的抗体：由于仅通过二硫键将分离的抗体保持在一起，所以在还原后未缀合的抗体可以产生低分子量带。具有通过–S-CH2-C(＝X)-CH2-S-连接基团共价连接的各个片段的缀合物在还原后不能分离。方法B：步骤1：向抗-HER2IgG(20.36mg/ml，在0.1MTris/HCl中)(610.8μg,0.0041μmol)(30ul)和1,3-二氯丙-2-酮(66.1μg,0.495μmol)的溶液中加入TCEPHCl(14.17μg,0.049μmol)，将该体系在4℃搅拌16h。使该反应混合物通过0.5mLZebaTM自旋柱，用PBSpH7.2洗脱。通过使用取自反应溶液的样品进行的PNGaseF(NewEnglandBiolab)、内蛋白酶Lys-C(Roche)和非还原/还原SDSPAGE(4-12％Bis-Tris凝胶与胶体蓝染色)分析证实了在链间二硫键上因4个丙酮形成而被成功修饰。LCMS(方法B)；145394(去糖基化后)。按照上述方法制备用于SDSPAGE的还原的样品。步骤2：在室温向修饰的抗-HER2IgG(7.14mg/mL,100mM乙酸苯铵缓冲液pH4.8)(600μg,0.0040μmol)的溶液中加入(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(氨基氧基)-N-甲基己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基己酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(30mg/ml,104μg,0.121μmol)，将该体系在RT搅拌19h。使得到的混合物通过0.5mlZebaTM自旋柱1次，用PBSpH7.2洗脱。通过使用取自反应溶液的样品进行的PNGaseF(NewEnglandBiolab)、内蛋白酶Lys-C(Roche)和非还原/还原SDSPAGE(4-12％Bis-Tris凝胶与胶体蓝染色，图8中所示)分析证实酮被成功修饰。DAR为3.8。LCMS(方法B)；148770(去糖基化后)。将SeeBluePlus2TM预染的标准品(Invirtogen)用作表观分子量阶梯。按照上述方法制备用于SDSPAGE的还原的样品。SDSPAGE如图8中所示。实施例7：抗体B-DM1缀合物的制备：步骤1：向二氯丙酮(7.35mg,0.055mmol,368ul)在Tris缓冲液(4800ul)中的溶液中加入抗体BIgG(抗体BIgG识别不同于Her2的抗原：68.2mg,0.458μmol,400ul)，将该体系冷却至4℃60min。在4℃的TCEPHCl(1.576mg,5.50μmol,524ul)，将其在4℃的室内保持16h。通过10K膜过滤浓缩该混合物，用PBS稀释。将该循环重复2次。过滤后，使样品通过5mlZebaTM脱盐柱。通过使用取自反应溶液的样品进行的PNGaseF(NewEnglandBiolab)和非还原/还原SDSPAGE(4-12％Bis-Tris凝胶与胶体蓝染色)分析证实在链间二硫键上因4个丙酮形成而被成功修饰。LCMS(方法B)；146020(去糖基化后)。按照上述方法制备用于SDSPAGE的还原的样品。步骤2：PL1(方法A)：向修饰的抗体BIgG的溶液(48mg,0.322μmol,1.2ml)中加入DM-1衍生物的DMSO溶液(10.00mg,8.05μmol,67ul)和3,5-二氨基苯甲酸(14.70mg,0.097mmol,30ul)，将该体系在23℃搅拌15h。通过10K膜过滤浓缩该混合物，用PBS稀释。将该循环重复3次。过滤后，使样品通过5mlZebaTM脱盐柱。通过使用PNGaseF(NewEnglandBiolab)分析证实酮被成功修饰。基于LCMS，DAR为4。LCMS(方法B)；150915(去糖基化后)。PL1(方法B)：在RT向修饰的抗体BIgG(679μg,0.0046μmol)在0.1M磷酸NaH6.0中的溶液中加入在DMSO中的2-(氨基氧基)-N-(1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4,13-二氧代-6,9,15,18-四氧杂-3,12-二氮杂二十碳烷-20-基)乙酰胺(563μg,0.911μmol,2.25ul)，将该体系在23℃搅拌20h。使该反应混合物通过0.5ml脱盐柱，用100mM含有EDTA的EPES洗脱3次。通过LCMS证实引入了3.8个马来酰亚胺连接基/抗体(DAR＝3.8)。LCMS(方法B)；147968(去糖基化后，使用PNGaseF(NewEnglandBiolab))。在RT向修饰的抗体BIgG(177μg,0.0012μmol)在100mM含有10mMEDTA的HEPES缓冲液中的溶液中加入在DMSO中的DM-1(8.65μg,0.012μmol,0.288ul)，将该体系在23℃搅拌6h。将N-甲基马来酰亚胺(在DMSO中1.3mg/ml)(2.083μg,0.019μmol)加入该反应溶液，将该体系搅拌10min。使该反应混合物通过0.5mL脱盐柱，用100mMHEPES缓冲液洗脱。基于LCMS，DAR为3.7。LCMS(方法B)；153967(DAR4)(糖基化的)。PL2：在RT向修饰的抗体BIgG(420μg,0.0028μmol)在含有10mMEDTA的HEPES缓冲液中的溶液中加入在DMSO中的DM-1(10.61μg,0.014μmol,0.55ul)，将该体系在RT搅拌8h。使该反应混合物通过0.5ml脱盐柱，用100mM含有EDTA的HEPES洗脱3次。使该反应混合物通过0.5mL脱盐柱，用100mMHEPES缓冲液洗脱。基于LCMS，DAR为3.6。LCMS(方法B)；150101(DAR4)(去糖基化后，使用PNGaseF(NewEnglandBiolab))。在RT向修饰的抗体BIgG(420μg,0.0028μmol)在含有10mMEDTA的HEPES缓冲液中的溶液中加入在DMSO中的DM-1(10.61μg,0.014μmol,0.55ul)，将该体系在RT搅拌8h。使该反应混合物通过0.5ml脱盐柱，用100mM含有EDTA的HEPES洗脱3次。使该反应混合物通过0.5mL脱盐柱，用100mMHEPES缓冲液洗脱。基于LCMS，DAR为3.6。LCMS(方法B)；150101(DAR4)(去糖基化后，使用PNGaseF(NewEnglandBiolab))。PL3：在RT向修饰的抗体BIgG溶液(47.3mg,0.317μmol,1.1ml)中加入DM-1衍生物(6.34mg,6.35μmol,42.3ul)和3,5-二氨基苯甲酸(13.52mg,0.089mmol,27ul)的DMSO溶液，将该体系在23℃搅拌15h。通过10K膜过滤浓缩该混合物，用PBS稀释。将该循环重复2次。过滤后，使样品通过5mlZebaTM脱盐柱。通过使用PNGaseF(NewEnglandBiolab)分析证实酮被成功修饰。基于LCMS，DAR为4。LCMS(方法B)；150915(去糖基化后)。PL4：在RT向修饰的抗体BIgG(250μg,0.0017μmol,10ul)在PBS中的溶液中加入所需的如上所示的烷氧基胺(21.66μg,0.025μmol,0.245ul)和3,5-二氨基苯甲酸(383μg,2.52μmol,0.43ul)，将该体系在23℃搅拌24h。使该反应混合物通过0.5mL脱盐柱2次，用PBS洗脱。基于LCMS，DAR为4。LCMS(方法B)；152446(糖基化的)。PL1合成：在RT将(2-(2-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(245mg,0.746mmol)溶于4NHCl的二噁烷溶液(2mL,8.00mmol)，将该体系在RT搅拌1h。除去溶剂后，将粗产物不经进一步纯化用于下一步反应。在RT向2-(((叔丁氧羰基)氨基)氧基)乙酸(185mg,0.970mmol)和TEA(0.520mL,3.73mmol)在DCM(8mL)中的溶液中加入EDC(172mg,0.895mmol)和HOBT(114mg,0.746mmol)，将该体系在RT搅拌5min。将在DCM(4mL)中的1-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(197mg,0.746mmol)加入上述反应混合物。在搅拌1h后，加入DCM和水。分离有机层。用DCM萃取水层。用Na2SO4干燥合并的有机层，过滤，真空浓缩。进行RP-HPLC纯化，用15-65％MeCN/水(含有0.1％TFA)洗脱，得到2-((2-(2-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)-2-氧代乙氧基氨基甲酸叔丁酯(62mg,0.154mmol,2步的收率20.70％)，为无色油状物。ESI-MS(方法A)m/z：402[M+1]+,保留时间：1.60min.1H-NMR(CDCl3-d,400MHz)；1.48(s,9H),3.49-3.75(m,14H),6.71(s,2H).在RT向2-((2-(2-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)-2-氧代乙氧基氨基甲酸叔丁酯(62mg,0.154mmol)在DCM(400μl)中的溶液中加入TFA(400μl)，将该体系在RT搅拌1h。除去溶剂后，将粗产物放入真空过夜，不经进一步纯化使用。ESI-MS(方法A)m/z：302[M+1]+PL2合成：向2-ClTrt树脂(1.70mmol/g)(0.086g,1.7mmol)和1-(9H-芴-9-基)-3-氧代-2,7,10-三氧杂-4-氮杂十二烷-12-酸(2g,5.19mmol)在DCM(8mL)/DMF(4mL)中的混悬液中滴加DIPEA(2.67mL,15.30mmol)，将该体系在RT搅拌15h。排出溶剂。用DCM/MeOH/DIPEA(17/2/1,40ml)、DCM(8mL*2)、DMF(8mL*2)、DCM(8mL*2)冲洗树脂，真空干燥。将树脂(0.679g,1.7mmol)装入反应容器。加入5mL20％哌啶的DMF溶液，将该体系温和地搅拌1min，取出。再加入10mL20％哌啶的DMF溶液，在间歇搅拌下静置20min，取出。加入DMF(10ml)，搅拌15秒，通过真空过滤除去。重复该步骤4次(用Kaiser检验检查；阳性，紫色-深蓝色)。将HOAt(0.463g,3.40mmol)和2-(((叔丁氧羰基)氨基)氧基)乙酸(0.650g,3.40mmol)在DMF(8mL)中的溶液加入树脂中，加入在DMF(4mL)中的DIC(0.530mL,3.40mmol)。将该反应混合物在RT搅拌1.5h。过滤出树脂，用DMF(10ml)冲洗4次，真空干燥。将树脂(0.926g,1.7mmol)装入反应容器。加入5mL20％哌啶的DMF溶液，将该体系温和地搅拌1min，取出。再加入10mL20％哌啶的DMF溶液，在间歇搅拌下静置20min，取出。加入DMF(10ml)，搅拌15秒，通过真空过滤除去。重复该步骤4次(用Kaiser检验检查；阳性，紫色-深蓝色)。将HOAt(0.463g,3.40mmol)和2-(((叔丁氧羰基)氨基)氧基)乙酸(0.650g,3.40mmol)在DMF(8mL)中的溶液加入树脂中，加入在DMF(4mL)中的DIC(0.530mL,3.40mmol)。将该反应混合物在RT搅拌1.5h。过滤出树脂，用DMF(10ml)冲洗4次，真空干燥。用30％HFIP(六氟异丙醇)的CHCl3溶液(20mL,1.700mmol)混悬树脂，将该体系在RT搅拌2h。浓缩排出的溶剂，得到粗制的2,2-二甲基-4,8,17-三氧代-3,6,12,15,21,24-六氧杂-5,9,18-三氮杂二十六烷-26-酸(1.13g,2.347mmol,138％收率)。将其不经进一步纯化用于下一步反应。ESI-MSm/z：482[M+1]+,保留时间：1.10min(方法B).在RT向2,2-二甲基-4,8,17-三氧代-3,6,12,15,21,24-六氧杂-5,9,18-三氮杂二十六烷-26-酸(819mg,1.7mmol)在DMF(6mL)中的溶液中分别加入HOAt(463mg,3.40mmol)和DIC(0.530mL,3.40mmol)，将该体系在RT搅拌5min。在RT向上述混合物中加入1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(518mg,2.040mmol)和DIPEA(二异丙基乙胺,0.594mL,3.40mmol)，将该体系在RT搅拌1h。用水和EtOAc(乙酸乙酯)稀释该反应混合物。分离有机层。用EtOAc萃取水层。用Na2SO4干燥合并的有机层，过滤，真空浓缩。基于LCMS，期望的化合物大部分在水层中。在冻干水层后，通过RP-HPLC纯化粗产物，用15-70％MeCN/水(含有0.1％TFA)洗脱，得到(23-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,11,20-三氧代-6,9,15,18-四氧杂-3,12,21-三氮杂二十三烷基)氧基氨基甲酸叔丁酯(600mg,0.994mmol,58.5％收率)。ESI-MSm/z：604[M+1]+,保留时间：1.14min(方法B).1H-NMR(CDCl3-d,400MHz)；1.48(s,7.5H),1.55(s,1.5H),3.47-3.71(m,20H),3.97(s,2H),4.04(s,2H),4.37(s,1.65H),4.47(s,0.35H),6.72(s,2H).在RT向(23-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,11,20-三氧代-6,9,15,18-四氧杂-3,12,21-三氮杂二十三烷基)氧基氨基甲酸叔丁酯(8.4mg,0.014mmol)在DCM(100μl)中的溶液中加入TFA(100μl)，将该体系在RT搅拌1h。除去溶剂，得到2-(氨基氧基)-N-(1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4,13-二氧代-6,9,15,18-四氧杂-3,12-二氮杂二十碳烷-20-基)乙酰胺。将其不经进一步纯化用于下一步反应。ESI-MSm/z：504[M+1]+,保留时间：0.69min(方法A).PL3合成：在5℃向2-(氨基氧基)-N-(1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4,13-二氧代-6,9,15,18-四氧杂-3,12-二氮杂二十碳烷-20-基)乙酰胺(22.79mg,0.031mmol)在DMA(0.6mL)中的溶液中加入DM-1(23mg,0.031mmol)和100mM磷酸NapH7.4(0.600mL)。在相同温度下加入DIPEA(10.88μl,0.062mmol)。将该反应混合物保持温热至RT，搅拌1.5h。用DCM和饱和碳酸氢钠水溶液稀释该反应混合物。用饱和NH4Cl(水溶液)和盐水洗涤有机层。用Na2SO4干燥合并的有机层，过滤，真空浓缩。进行硅胶色谱，用0-15％MeOH/DCM洗脱，得到期望的化合物(21mg,0.017mmol,54.3％收率)。ESI-MSm/z：1242[M+1]+,保留时间：1.00min(方法A).1H-NMR(CDCl3-d,400MHz)；0.80(s,3H),1.21-1.33(m,9H),1.41-1.51(m,1H),1.56-1.59(m,1H),2.31-2.39(m,1H),2.57-2.65(m,2H),2.79-2.88(m,1H),2.86(s,3H),2.91-3.13(m,5H),3.16-3.24(m,1H),3.20(s,3H),3.36(s,3H),3.43-3.76(m,25H),3.90(d,J＝3.6Hz,2H),3.98(s,3H),4.02(s,2H),4.17(s,2H),4.25-4.32(m,1H),4.77-4.80(m,1H),5.30-5.37(m,1H),5.62-5.69(m,1H),6.26(s,1H),6.38-6.45(m,1H),6.63-6.68(m,2H),6.82-6.84(m,1H),6.92(brs,1H),7.14-7.24(2H).在5℃向(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(320mg,1.289mmol)在DCM(3mL)中的溶液中加入2-溴乙酰溴(0.225mL,2.58mmol)和DIPEA(0.563mL,3.22mmol)，将该体系搅拌15min，保持温热至RT。除去溶剂后，进行硅胶色谱纯化，用0-40-100％EtOAc/庚烷洗脱，得到(2-(2-(2-(2-溴乙酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(317mg,0.858mmol,66.6％收率)。ESI-MSm/z：269[M+1-Boc]+,保留时间：1.41min(方法A).H-NMR(CDCl3,400MHz)；1.45(s,9H),3.34(brs,2H,3.48-3.52(m,2H),3.53-3.60(m,4H),3.63(s,4H),3.88(s,2H).向(2-(2-(2-(2-溴乙酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(317mg,0.858mmol)在DCM(1mL)中的溶液中加入TFA(1mL)，将该反应体系在RT搅拌30min。除去溶剂后，将得到的粗产物不经进一步纯化用于下一步反应。在5℃向N-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-2-溴乙酰胺(329mg,0.858mmol)在DCM(1.5mL)中的溶液中加入预活化的酯(在RT由2-(((叔丁氧羰基)氨基)氧基)乙酸(328mg,1.716mmol)、HOAt(175mg,1.287mmol)和DIC(0.267mL,1.716mmol)在DMF(1.5mL)中搅拌5min制备)和DIPEA(0.749mL,4.29mmol)，将该体系搅拌20min，保持温热至RT。加入EtOAc和水。分离有机层，用EtOAc萃取水层。用Na2SO4干燥合并的有机层，过滤，真空浓缩。进行硅胶色谱纯化，用0-5％MeOH/DCM洗脱，得到(14-溴-2,13-二氧代-6,9-二氧杂-3,12-二氮杂十四烷基)氧基氨基甲酸叔丁酯(150mg,0.339mmol,39.5％收率)。ESI-MSm/z：343[M+1-Boc]+,保留时间：1.30min((方法A).H-NMR(CDCl3,400MHz)；1.49(s,9H),3.47-3.55(m,4H),3.59-3.63(m,4H),3.65(s,4H),3.88(s,2H),4.34(s,2H).在RT将(14-溴-2,13-二氧代-6,9-二氧杂-3,12-二氮杂十四烷基)氧基氨基甲酸叔丁酯(150mg,0.339mmol)溶于DCM(体积：1mL,比率：1.000)，向其中TFA(体积：1,比率：1.000)。将该反应混合物在RT搅拌30min。除去溶剂后，进行RP-HPLC，用10-25％MeCN/水(包含0.1％TFA)洗脱，得到2-(氨基氧基)-N-(2-(2-(2-(2-溴乙酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)乙酰胺(110mg,0.241mmol,71.1％收率)。ESI-MSm/z：344[M+2]+,保留时间：0.44min(方法A).在5℃向2-(氨基氧基)-N-(2-(2-(2-(2-溴乙酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)乙酰胺(42.9mg,0.075mmol)在DMA(1mL)中的溶液中加入DM-1(37mg,0.050mmol)和75mM磷酸NapH8.5(1mL)。在相同温度下加入DIPEA(0.026mL,0.150mmol)。将该反应混合物保持温热至RT，搅拌1h。用DCM和饱和碳酸氢钠水溶液稀释该反应混合物，用饱和NH4Cl水溶液和盐水洗涤有机层，用Na2SO4干燥合并的有机层，过滤，真空浓缩。进行硅胶色谱，用0-15％MeOH/DCM洗脱，得到期望的化合物(31mg,0.031mmol,61.9％收率)。ESI-MSm/z：1000[M+1]+,保留时间：1.61min(方法A).1H-NMR(CDCl3-d,400MHz)；0.79(s,3H),1.20-1.33(m,9H),1.41-1.50(m,2H),2.17-2.22(m,1H),2.50-2.63(m,2H),2.70-2.81(m,2H),2.86-2.94(m,3H),2.99-3.01(m,1H),3.10-3.13(m,1H),3.18-3.20(m,4H),3.36(s,3H),3.45-3.62(m,14H),3.98(s,3H),4.17(s,2H),4.25-4.31(m,1H),4.78-4.82(m,1H),5.30-5.35(m,1H),5.63-5.69(m,1H),6.27(s,1H),6.39-6.45(m,1H),6.61-6.64(m,2H),6.83(s,1H),6.87(brs,1H).实施例8：抗体CFab缀合物：步骤1：在RT向抗体CFab(抗体C结合不同于Her2的靶标抗原和抗体B：1668μg,0.035μmol,120ul)在100mM具有EDTA的pH7.4的磷酸Na中的溶液中加入TCEPHCl(35.2μg,0.123μmol,11.73ul)，将该体系在23℃搅拌1.5h。将1,3-二氯丙-2-酮(117μg,0.878μmol,5.85ul)加入该反应混合物，将该体系在23℃搅拌40min。通过LCMS观察到了1个丙酮桥修饰。使该反应混合物通过0.5脱盐柱，用100mMNaOAc缓冲液pH5.2洗脱。LCMS(方法B)；47554.步骤2：在RT向修饰的抗体CFab(1668μg,0.035μmol,148ul)在100mMNaOAc缓冲液pH5.2和所示的氨基氧基-取代的脂肪酸(1852μg,2.63μmol)中的溶液中加入3,5-二氨基苯甲酸(694μg,4.56μmol,5.34ul)，将该体系在23℃搅拌20h。再向该混合物中加入另外的氨基氧基-脂肪酸(1852μg,2.63μmol)，将该体系在RT搅拌24h。使该反应混合物通过5ml脱盐柱，用PBSpH7.4洗脱，得到预期的抗体CFab-脂肪酸缀合物(30％收率)。LCMS(方法B)；48238.该缀合物的SDSPAGE影像和质谱如图9中所示。实施例9：二氯丙酮和TCEP的添加次序的作用所有反应均在25℃、使用在pH8.0的50mM缓冲液(TRIS，另有指定的除外)进行。反应使用(58.8微升)和缓冲液(20微升的1M缓冲液)在孔中进行，然后添加IgG1(6.6微升的包含170.5mg/mL的溶液)和TCEP(8.6微升的具有3mg/mLTCEP的水溶液)。等待指示的时间期限后，加入1,3-二氯丙酮(6微升的在DMSO中20mg/mL的溶液)。在第一系列的实验中，反应通过首先添加还原剂(TCEP-HCl)且1小时后添加1,3-二氯丙酮进行。在用DTT或TCEP还原产物混合物后通过微型芯片电泳-SDS方法分析产物分布(Electrophoresis2012,第33卷,765-72)，结果如下表中所示：LC＝轻链，HC＝重链，HL＝重链+轻链，HH＝重链+重链；HHL＝HC+HC+LC；且LHHL＝LC+HC+HC+LC。数据显示在还原以裂解任何保留的二硫键后，主要产物是HC-LC(重链-轻链)加合物。这表明在这些条件下仅发生部分反应。该数据显示该反应主要在前半小时内进行。样品名称相对面积相对面积相对面积相对面积相对面积相对面积％LC％HC％HL％HH％HHL％LHHLTCEP首个t＝0.5h3.35.450.90.66.533.3TCEP首个t＝1h3.24.751.90.85.933.6TCEP首个t＝1.5h2.94.650.10.66.435.5TCEP首个t＝2h3.04.551.80.76.033.9TCEP首个t＝3h2.94.052.20.66.134.2TCEP首个t＝17h2.74.550.60.86.435.0第二组实验在相同条件下进行，除了在添加还原剂前将1,3-二氯丙酮添加到多肽/缓冲液反应混合物中之外。来自这些实验的结果如下表中所示，其显示LHHL显著增加，对应于抗体的4个二硫键中的至少3个转化成共价连接基团，所述共价连接基团通过1,3-二氯丙酮与来自二硫键的两个硫原子反应形成。此外，反应显示基本上在30分钟内完成。样品名称相对面积相对面积相对面积相对面积相对面积相对面积％LC％HC％HL％HH％HHL％LHHL二氯丙酮首个t＝0.5h2.830.827.130.9813.0175.23二氯丙酮首个t＝1h2.950.726.941.1713.4274.81二氯丙酮首个t＝1.5h2.640.616.421.0913.6175.63二氯丙酮首个t＝2h2.630.616.431.0813.4975.77二氯丙酮首个t＝3h2.380.516.41.0713.4176.23二氯丙酮首个t＝17h2.470.565.941.0413.3976.59这些实验表明在启动二硫键还原之前添加二氯丙酮提供了巯基-巯基交联反应的效能的令人惊奇的大幅增加。使用PBS作为缓冲液的产物收率较低。在单独的实验中，经证实将所用二氯丙酮的量提高10倍阻碍了该反应，且将pH降至7.40、7.10、6.80－6.60导致LHHL产物的收率类似的或稍微的改善。实施例10：缓冲液筛选反应通过在室温向1,3-二氯丙酮和IgG在缓冲液(100mM)中的预混合溶液中添加还原剂进行。在用DTT或TCEP还原产物后7h后通过微型芯片电泳-SDS方法分析产物混合物分布。结果如下表中所示：LC＝轻链，HC＝重链，HL＝重链+轻链，HH＝重链+重链；HHL＝HC+HC+LC；且‘完整的’＝(HC)2(LC)2；LHHL＝LC+HC+HC+LC。收率来源于LHHL百分比。当前第1页1 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