角膜仿生生物材料：玻璃化的胶原‑环糊精植入物的制作方法

本申请要求于2015年4月24日提交的国际专利申请第PCT/US2015/027503号和于2015年5月4日提交的美国临时专利申请第62/156,833号的权益，其为了所有目的通过引用在此被并入，如同在本文充分陈述一样。

发明背景

由于角膜炎、圆锥角膜(keratoconus)、其他疾病和损伤，今天世界上大量人口患有角膜失明(corneal blindness)。但是，由于供体角膜的有限的可获得性，特别是在亚洲和非洲的发展中区域，不是所有个体都可以接受治疗。

以下是现行标准的简述。现有的护理标准包括现在可获得的最佳角膜置换的供体角膜。但是，存在可获得性、保存和分配的问题。在临床中也存在合成角膜或人工角膜(keratoprosthesis)诸如Boston Kpro或AlphaCor。但是，尽管它们可以成功地矫正受损角膜的屈光性质，它们是基于合成的聚合物的，并且不支持组织重建或生物整合，引起并发症。在临床试验中存在生物工程角膜，诸如碳二亚胺交联的RHCIII。这些显示出广阔的前景。但是，这些材料具有低缝合性和与角膜不匹配的胶原组织超微结构(图8)。

在角膜中观察到的常规胶原组装体中，存在大量蛋白聚糖诸如辅助三螺旋形成、原纤维排列和组织的核心蛋白聚糖(decorin)和光蛋白聚糖(lumican)。我们想在实验室环境使用可以充当人工伴侣蛋白并可以提供这些相同功能的分子重复此结果。发明人早期专注于将环糊精作为此类分子(图12)——在PCT/US2015/027503中详述的根据环中的葡萄糖单体的数量分类的小型环状寡糖，该申请通过引用并入本文。之前，这些已经在癌症治疗和用于药物递送的其他应用被使用，并且被认为是非常安全且生物相容的。

环糊精(CD)是包含6至8个葡萄糖分子的环的环状寡聚物的家族。这些环状分子的特征是可以与小分子或大的化合物的部分形成复合物的内部疏水核和外部亲水环。天然环糊精的溶解性非常差，并且起初这阻止环糊精成为有效的络合剂。在20世纪60年代末，发现在2-、3-和6-羟基位点的化学取代将极大增强溶解性。化学取代的程度和用于取代的基团的性质决定了环糊精在水性介质中的最终的最大浓度。大多数化学改性的环糊精在水中能够达到50％(w/v)浓度。另外，在羟基基团的取代和反应可以通过例如将该基团转化为酸、胺或其它来提供额外的官能度。另外，在羟基基团的取代和反应可以通过例如将该基团转化为酸、胺或其它来提供额外的官能度。

细胞外基质(ECM)是由蛋白、蛋白聚糖和其他可溶性分子组成的复杂的大分子混合物。胶原(动物中最丰富的蛋白)在多种生物应用中被广泛应用。然而，由于获得大量纯化的蛋白聚糖的困难，对工程化包含胶原和蛋白聚糖二者的ECM支架做出了很少的努力。在天然角膜中，蛋白聚糖通过调节胶原原纤维(fibril)直径和间距在角膜透明度中起至关重要的作用。因此，仍存在对蛋白聚糖的替代物的需求，以开发仿生的基于胶原的ECM来解决与临床应用诸如角膜再生相关的富有挑战的问题。

发明概述

根据公开的实施方案，本发明提供了用于制备真正的角膜仿生结构的组合物和方法。角膜是由上皮层和内皮层组成的透明的多层组织，最厚的区域是角膜基质(corneal stroma)，角膜基质的大部分是基于胶原I的细胞外基质，稀少地分布有角膜细胞。在一些实施方案中，一个可能的策略是开发聚焦于复制基质、之后可以增加其它层的角膜仿生物。然后，该复制的基质被用作制造基于胶原的角膜植入物的基底，所述角膜植入物可以被调节以自组装成角膜仿生结构。目的是模仿天然健康角膜的超微结构和物理性质。

根据一个实施方案，本发明提供了一种组合物或膜，所述组合物或膜包含排列的原纤维，所述排列的原纤维包含胶原和环糊精。组合物或膜可以包含玻璃化的基质凝胶的排列的原纤维，所述玻璃化的基质凝胶包含胶原和环糊精。

排列的原纤维与更随机的取向截然不同，并且可以用方法诸如检测排列的取向而非更随机的构型的样品的透射电子显微术评价来评估。

在本发明的组合物或膜中，可以适当地使用不同类型的胶原，包括I型、II型、III型和IV型胶原。对于某些组合物或膜，可以使用I型胶原。在某些组合物或膜中，可以优选组合物的胶原含量的大部分是I型胶原，例如，其中组合物或膜中的总胶原含量的40重量％、50重量％、60重量％、70重量％、80重量％、90重量％、95重量％或100重量％是I型胶原。

还可以使用不同环糊精，包括α-环糊精(α-CD)、β-环糊精(β-CD)和γ-环糊精(γ-CD)。对于某些组合物或膜，可以优选α-CD，包括与I型胶原组合。在某些组合物或膜中，可以优选组合物或膜的环糊精含量的大部分是α-CD，例如，其中组合物或膜中的总环糊精含量的40重量％、50重量％、60重量％、70重量％、80重量％、90重量％、95重量％或100重量％是α-环糊精(α-CD)，包括与I型胶原组合。

本发明的组合物或膜还可以包含一种或更多种另外的生物活性剂或治疗剂，诸如例如吲哚美辛。

本发明的组合物或膜尤其可用于充当延长药物向患者的释放的药物储库(drug reservoir)。

本发明的组合物或膜还可以适当地为多层的。组合物或膜可以形成不同的构型，包括适用于用作人工角膜的形状，和/或适用于用作角膜置换物、贴片(patch)或移植物的形状。本发明的组合物和膜将具有作为多种其它生物材料的另外的用途。

根据一个或更多个实施方案，本发明的发明人假设，与天然组织中的蛋白聚糖类似，环糊精在胶原基质中的掺入将调节胶原纤维发生，同时保持胶原三螺旋形成。具有原纤维结构的传统工程化的I型胶原基质是不透明的，而包含无定形胶原网络的透明凝胶则表现出不良的机械性能。预期环糊精可以作为蛋白聚糖替代物被添加至胶原基质，并且将协助优化用于角膜再生的光学性质和机械性质。

根据一个实施方案，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含具有第一组分和第二组分的玻璃化基质凝胶，其中所述第一组分包含胶原，并且其中所述第二组分包含环糊精。

根据另一个实施方案，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含具有第一组分和第二组分的玻璃化基质凝胶，其中所述第一组分包含胶原，并且其中所述第二组分包含环糊精，并且所述组合物还包含至少一种生物活性剂。

根据又一个实施方案，本发明提供了一种用于制造玻璃化基质凝胶的方法，所述玻璃化基质凝胶具有第一组分和第二组分，其中所述第一组分包含胶原，并且其中所述第二组分包含环糊精，所述方法包括：a)获得胶原的水性溶液；b)获得环糊精的水性溶液；c)将a)和b)的溶液合并；和d)使c)的合并的溶液脱水持续足以允许所述溶液玻璃化的一段时间。

根据又另一个实施方案，本发明提供了以上描述的组合物作为用于修复哺乳动物的组织的基质的用途。

根据另一个实施方案，本发明提供了以上描述的组合物作为用于修复哺乳动物的眼角膜的基质的用途。

根据另外的实施方案，本发明提供了可以被制成分层的、每层具有不同的功能以更好地模仿角膜的眼用组合物。

附图简述

图1A描绘了包括以下的三种基于胶原的膜的差示扫描量热法(DSC)第一加热曲线：常规胶原玻璃质凝胶(vitrigel)(CV)、本发明的α-CD-col组合物和交联的CV。

图1B示出了α-CD诱导多种胶原超微结构(横截面视图)。

图2是示出了本发明的α-CD-col组合物表现出优异的透明度的图，具有在550nm的高达96％的透光率。图中的插图示出了置于印刷的单词“eye”上的湿膜的照片。

图3是描绘了厚度分别为520μm和170μm的本发明的两种α-CD-col组合物的缝合性(suturability)测试的荷载相对变形(displacement)的图。图中的插图示出了较厚的膜在拉伸超过5.6mm后的照片。

图4是在本发明的组合物的荷载测试中使用的装置的照片。

图5示出了细胞突起分析的示意图和不同玻璃质凝胶组合物胶原密度对牛角膜细胞的原代培养物的作用。

图6描绘了牛角膜细胞的原代培养物中的三个不同的基因标志物的基因表达如何被本发明的玻璃质凝胶组合物的原纤维纳米结构所影响。

图7是示出了不同环糊精的结构和它们在溶液中如何与胶原原纤维相互作用的示意图。环糊精分子中的空间可以被用作水不溶性药物和生物活性剂的药物储库。

图8是描绘用于角膜修复和移植物的护理标准选项的示意图。

图9是描绘本发明的角膜仿生生物材料的一个或更多个实施方案的研制的示意图。示意图描绘了本发明的基于胶原的生物材料如何模拟天然健康角膜的超微结构和物理性质。

图10是来自Biomaterials 34:9365-9372(2013)的图像，示出了玻璃化如何导致具有高胶原密度、更好的强度和透明度的胶原玻璃质凝胶的形成。

图11a-11b是描绘了胶原装配的现有技术方法和本发明的一个或更多个实施方案之间的对比的示意图。11a)在体内，I型胶原自组装成有序的原纤维超微结构涉及小蛋白聚糖诸如核心蛋白聚糖。11b)在体外，使用环糊精作为胶原三螺旋的分子伴侣蛋白可以获得相似的超微结构。

图12是描绘了环糊精结构的现有技术图像。与在直链淀粉(amylose)(淀粉的片段)中一样，环糊精包括5个或更多个1->4连接的α-D-吡喃型葡萄糖苷单元。5-元大环是非天然的。最近，良好表征的最大的环糊精包含32个1,4-脱水吡喃型葡萄糖苷单元，而作为没有良好表征的混合物，还已知至少150-元的环状寡糖。典型的环糊精在环中含有范围从6-8个单元的数量的葡萄糖单体，形成锥形。

图13示出了本发明的CD Col植入物实施方案的透明度。

图14描绘了本发明的CD Col植入物实施方案的角膜仿生超微结构。

图15示出了本发明的βCD-COOH Col植入物的仿生超微结构的特写显微照片。

图16描绘了角膜细胞和上皮细胞的显微照片，示出了本发明的植入物组合物的生物相容性。

图17描绘了H&E染色的截面，示出了本发明的植入物组合物的生物相容性。

图18描绘了本发明的βCD CV植入物的体内角膜移植的照片。

发明详述

根据一个或更多个实施方案，本发明的发明人使用环糊精用于作为蛋白聚糖替代物来工程化仿生的基于胶原的基质组合物。所产生的环糊精在本发明的胶原组合物中的掺入增强了胶原热稳定性并降低了胶原纤维发生。结果，形成了厚的、透明的且机械强度高的基于胶原的组合物。这些环糊精-胶原组合物具有被用作用于角膜修复的治疗性眼植入物的极大潜力。

根据一个实施方案，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含具有第一组分和第二组分的玻璃化基质凝胶，其中所述第一组分包含胶原，并且其中所述第二组分包含环糊精。

根据另一个实施方案，胶原-环糊精组合物可以被塑造成多层的(multilayered)或多片层(multi-lamellar)的结构，其中每层的厚度可以被控制。例如，人角膜为10-500微米厚。本发明可以被制成10-500、25-500；50-500；100-500；250-500(微米)的厚度。多层结构支持多功能，并且因此，组合物比现有人工角膜、移植物或贴片与角膜更相似地起作用。另外，组合物可以在表面被包衣以增强生物作用。

根据本发明的组合物的一个或更多个实施方案，发明人使用胶原玻璃质凝胶技术。胶原凝胶玻璃化是在受控的温度和受控的湿度下的缓慢脱水过程，该过程引起具有高透明度和强度的胶原膜或胶原片的形成。结合水从胶原释放导致熵的增加，驱使高密度原纤维的形成。胶原凝胶的玻璃化允许形成具有高胶原密度、更高强度和更高透明度的玻璃质凝胶膜。(三步：凝胶化、玻璃化、再水合)以前，具有更大厚度(500um)的CV膜具有非常低的透明度(见图9、10和11)

如本文使用的，术语“玻璃化”或“玻璃质凝胶(vitrigel)”意指组合物包含一种或更多种胶原和一种或更多种环糊精的混合物的水性溶液，并且允许形成水凝胶。在一些实施方案中，组合物的凝胶化在37℃的温度进行。在形成水凝胶之后，通过脱水，诸如例如在特定温度和湿度加热水凝胶、持续允许玻璃化发生的特定时间长度来使水凝胶玻璃化。在一些实施方案中，玻璃化在35℃至45℃的温度和在约30％和50％相对湿度之间的湿度进行。在一个实施方案中，玻璃化在40℃的温度和40％的相对湿度进行。组合物的玻璃化所需的时间可以从数天至数周变化。在一个实施方案中，用于组合物的玻璃化的时间为约1周至2周。

“凝胶”指介于液体和固体之间的物质状态，并且通常被定义为在液体介质中膨胀的交联聚合物网络。通常，凝胶是包含固体和液体二者的两相胶体分散体，其中固体的量大于被称为“溶胶(sol.)”的两相胶体分散体中的固体的量。如此，“凝胶”具有液体的一些特性(即，形状是有弹性的且可变形的)和固体的一些特性(即，形状足够离散以在二维表面上维持三维)。

“水凝胶”意指可以吸收水以形成弹性凝胶的遇水膨胀的(water-swellable)聚合物基质，其中“基质”是通过共价交联或非共价交联保持在一起的三维大分子网络。当放置在水性环境中时，干燥的水凝胶通过获取其中的液体而膨胀至交联度所允许的程度。

本发明的组合物包含胶原。第一组分的胶原选自由I型、II型、III型和IV型胶原组成的组。在一个实施方案中，用作组合物的第一组分的胶原是I型胶原。本领域普通技术人员将理解，在组合物和方法中使用的胶原可以包括多于一种类型的胶原。

本发明的组合物还包含环糊精。第二组分的环糊精选自由α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精组成的组。在一个实施方案中，用作组合物的第二组分的环糊精是α-环糊精。本领域普通技术人员将理解，在组合物和方法中使用的环糊精可以包括多于一种类型的环糊精。

根据一个或更多个实施方案，在本发明的组合物和方法中使用的环糊精具有能够被另一个官能团或部分化学取代的多个羟基。此类官能团或部分包括但不限于，疏水基团、亲水基团、肽、羟基、C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、C₁-C₆羟基烷基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆烷氧基C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷基氨基、二-C₁-C₆烷基氨基、C₁-C₆二烷基氨基C₁-C₆烷基、C₁-C₆硫代烷基、C₂-C₆硫代烯基、C₂-C₆硫代炔基、C₆-C₂₂芳氧基、C₂-C₆酰氧基、C₂-C₆硫代酰基、C₁-C₆酰胺基、C₁-C₆磺酰胺基、C₁-C₆羧基及其衍生物，并且还可以包括膦酸盐/酯(phosphonate)和砜类。

如本文使用的，本发明的玻璃化组合物在使用前被水合。

本发明的玻璃质凝胶组合物是光学上透明的并且适合于多种用途。在一个实施方案中，玻璃质凝胶组合物具有在550nm的约96％的光学透明度。

将理解，本发明的玻璃质凝胶组合物可以被模制或形成适合于用作替代组织或组织填充物的任何特定形状。本发明提供了形成支架等的离体聚合技术，所述支架等可以被模制以采取组织缺损所需要的形状、通过刺激天然细胞修复促进组织形成，并且可以通过微创注射(minimally invasive injection)被潜在地植入。

在一个或更多个实施方案中，本发明的玻璃质凝胶组合物可以被塑形，用于用作受试者的人工角膜。

根据另一个实施方案，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含具有第一组分和第二组分的玻璃化基质凝胶，其中所述第一组分包含胶原，并且其中所述第二组分包含环糊精，并且所述组合物还包含至少一种生物活性剂。

本文中“活性剂”和“生物活性剂”可互换使用以指引起期望的药理作用和/或生理作用的化学品或生物化合物，其中所述作用可以是预防性的或治疗性的。该术语还包括本文具体提及的那些活性剂的药学上可接受的、药理上有活性的衍生物，包括但不限于盐、酯、酰胺、前药、活性代谢物、类似物等。当术语“活性剂”、“药理活性剂”和“药物”被使用时，那么，应理解本发明包括该活性剂本身以及药学上可接受的、药理学上有活性的盐、酯、酰胺、前药、代谢物、类似物等。

当提及治疗剂、染料或其他物质和聚合的组合物诸如本发明的组合物使用时，“掺入的(incorporated)”、“包封的(encapsulated)”和“包埋的(emtrapped)”是本领域公知的。在某些实施方案中，这些术语包括将此类剂掺入、配制或以其他方式包括在组合物中，所述组合物允许此类剂在期望的应用中缓释。所述术语可构思治疗剂或其他物质藉以被掺入基质中的任何方式，包括例如分布在整个基质中、附加到基质表面(通过嵌入或其他结合相互作用)、包封在基质内部等。术语“共掺入”或“共包封”指治疗剂或其他物质和至少一种其他治疗剂或其他物质被掺入主题组合物中。

在本发明的一个方面中，可以制备包含玻璃质凝胶组合物和一种或更多种生物活性剂的组合物。生物活性剂可以随着组合物的预期目的而广泛变化。术语“活性”是本领域公知的并且指的是为在受试者中局部或全身起作用的生物、生理、或药理活性物质的任何部分。生物活性剂(可以被称为“药物”)的实例在公知的参考文献诸如Merck Index、Physicians’Desk Reference和The Pharmacological Basis of Therapeutics中描述，并且它们包括但不限于药物；维生素；矿物质补充剂；用于治疗、预防、诊断、治愈或减轻疾病或疾患(illness)的物质；影响身体结构或功能的物质；或前药，所述前药在将它们置于生理环境中后变为生物活性的或更有活性的。可以使用多种形式的生物活性剂，所述多种形式的生物活性剂在施用至受试者之后能够由玻璃质凝胶组合物释放到例如邻近组织或体液中。在一些实施方案中，生物活性剂可以被用于例如治疗、改善、抑制或预防与例如眼睛相关的疾病或症状。

生物活性剂的非限制性实例包括以下：肾上腺素能阻断剂、同化剂、雄激素类固醇、抗过敏物质、抗胆碱能药和拟交感神经药、抗高血压剂、抗感染剂、抗炎剂诸如类固醇、非类固醇抗炎剂(NSAIDS)、退热剂和止痛剂、抗组胺剂、生物制品(biological)、减充血剂、诊断剂、雌激素、离子交换树脂、抗有丝分裂剂、溶粘液剂(mucolytic agent)、生长因子、神经肌肉药物、营养物质、外周血管扩张剂、促孕剂、前列腺素、维生素、抗原物质和前药。

在本发明的组合物中使用的NSAIDS的实例可以包括甲灭酸(mefenamic acid)、阿司匹林、二氟尼柳(Diflunisal)、双水杨酸酯(Salsalate)、布洛芬(Ibuprofen)、萘普生(Naproxen)、非诺洛芬(Fenoprofen)、酮洛芬(Ketoprofen)、右旋酮洛芬(Dexketoprofen)、氟比洛芬(Flurbiprofen)、噁丙嗪(Oxaprozin)、洛索洛芬(Loxoprofen)、吲哚美辛(Indomethacin)、舒林酸(Sulindac)、依托度酸(Etodolac)、酮咯酸(Ketorolac)、双氯芬酸(Diclofenac)、萘丁美酮(Nabumetone)、吡罗昔康(Piroxicam)、美洛昔康(Meloxicam)、替诺昔康(Tenoxicam)、屈噁昔康(Droxicam)、氯诺昔康(Lornoxicam)、伊索昔康(Isoxicam)、甲氯芬那酸(Meclofenamic acid)、氟灭酸(Flufenamic acid)、邻甲氯灭酸(Tolfenamic acid)、塞来昔布(Celecoxib)、罗非昔布(Rofecoxib)、伐地昔布(Valdecoxib)、帕瑞昔布(Parecoxib)、氯美昔布(Lumiracoxib)、依托昔布(Etoricoxib)、Firocoxib、磺酰苯胺类(Sulphonanilides)、尼美舒利(Nimesulide)、尼氟灭酸(Niflumic acid)和利克飞龙(Licofelone)。

可以使用不同形式的生物活性剂。这些包括但不限于，诸如以下的形式：不带电荷的分子、分子复合物、盐、醚、酯、酰胺、前药形式等，其当被植入、注射或以其他方式置于受试者中时被生物活化。

玻璃质凝胶组合物将以符合良好的医疗实践的方式配制、计量(dosed)和施用。在此情况下考虑的因素包括待被治疗的特定紊乱、待被治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、紊乱的原因、剂的递送部位、施用方法、施用的时间表和医疗从业者已知的其他因素。待被施用的玻璃质凝胶组合物的“治疗有效量”将根据此类考虑因素决定，并且可以是预防、改善或治疗目的紊乱所必需的最小量。如本文使用的，术语“有效量”是指疗法(例如，预防剂或治疗剂)的量的等效短语，其足以降低疾病的严重度和/或持续时间、改善其一个或更多个症状、阻止疾病的发展或引起疾病消退，或其足以引起阻止疾病或其一个或更多个症状的发展、复发、发作或进展、或增强或提高可用于治疗疾病的另一个疗法(例如，另一种治疗剂)的预防和/或治疗作用。

在一个实施方案中，修复受损的组织可以在任何标准外科手术程序(包括开放式外科手术和腹腔镜技术)环境中进行，以允许接近并修复组织。接近受损的组织之后，使本发明的玻璃质凝胶组合物(如果需要，和任何外科手术上可接受的贴片或植入物一起)接触受损的组织而放置。

根据又一个实施方案，本发明提供了一种用于制造玻璃化基质凝胶的方法，所述玻璃化基质凝胶具有第一组分和第二组分，其中所述第一组分包含胶原，并且其中所述第二组分包含环糊精，所述方法包括：a)获得胶原的水性溶液；b)获得环糊精的水性溶液；c)将a)和b)的溶液合并；和d)使c)的合并的溶液脱水持续足以允许所述溶液玻璃化的一段时间。

如本文使用的，胶原的水性溶液是溶解于适合缓冲液的任何胶原溶液。胶原的浓度是可变的，然而，具有在1mg/ml至约10mg/ml范围内的浓度的胶原溶液可根据本发明的方法被使用。在一个实施方案中，水性溶液中的胶原浓度为约5mg/ml。

如本文使用的，环糊精的水性溶液是溶解于适合缓冲液中的任何环糊精溶液。环糊精的浓度是可变的，然而，具有在2.5mg/ml至约10mg/ml的范围内的浓度的环糊精溶液可根据本发明的方法被使用。

根据本发明的方法，本发明的组合物的脱水和玻璃化包括在约5℃至40℃的温度、在约30％至50％之间的相对湿度并且持续约3天至约28天的时间干燥包含胶原溶液和环糊精的溶液。在一个实施方案中，本发明的组合物的玻璃化包括在39℃的温度持续约7天加热包含胶原溶液和环糊精的溶液。在另一个实施方案中，本发明的组合物的玻璃化包括在39℃的温度持续约14天加热包含胶原溶液和环糊精的溶液。

术语“载体”指治疗剂借助其而通过本发明的玻璃质凝胶组合物提供的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类生理学载体可以是无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物和合成来源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物被静脉内施用时，水是适合的载体。盐水溶液和水性右旋糖和甘油溶液也可被用作液体载体，特别是用于可注射溶液。适合的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩(chalk)、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如果需要，组合物还可以包含少量润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。

缓冲液、酸和碱可以被掺入组合物中以调节pH。还可以包括增加从组合物中释放的剂的扩散距离的剂。

缓冲剂辅助维持pH在接近生理条件的范围内。缓冲液优选地以从约2mM至约50mM的范围的浓度存在。用于根据本发明使用的适合缓冲剂包括有机酸和无机酸二者以及其盐，诸如柠檬酸盐缓冲液(例如，柠檬酸单钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸单钠混合物等)、琥珀酸盐缓冲液(例如，琥珀酸-琥珀酸单钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸盐缓冲液(例如，酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、富马酸盐缓冲液(例如，富马酸-富马酸单钠混合物、富马酸-富马酸二钠混合物、富马酸单钠-富马酸二钠混合物等)、葡萄糖酸盐缓冲液(例如，葡萄糖酸-葡萄糖酸钠混合物、葡萄糖酸-氢氧化钠混合物、葡萄糖酸-葡萄糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲液(例如，草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐缓冲液(例如，乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)和乙酸盐缓冲液(例如，乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。可以使用磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液、三甲基胺盐诸如Tris、HEPES和其他此类已知的缓冲液。

防腐剂可以被添加以阻碍微生物生长，并且可以以从0.2％-1％(w/v)范围的量被添加。用于根据本发明使用的适合防腐剂包括苯酚、苯甲醇、间甲酚、十八烷基二甲基苄基氯化铵、苄烷铵卤化物(例如，氯化物、溴化物和碘化物)、六甲氯铵、对羟基苯甲酸烷基酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。

存在等渗剂(isotonicifier)以确保本发明的液体组合物的生理等渗性并且包括多元糖醇，优选地三元或更高级的糖醇，诸如甘油、赤藓醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇。考虑到其他成分的相对量，多元醇可以以按重量计约0.1％至约25％之间、优选地1％至5％之间的量存在。

待被用于体内施用的制剂必须是无菌的。这可以通过例如通过无菌滤膜的过滤实现。例如，本发明的制剂可以通过过滤灭菌。

根据一个或更多个实施方案，提供了包含本发明的组合物的眼用制剂，其中所述制剂适用于施用至受试者的眼睛。眼用制剂可以具有5.5和7之间的pH。在一些实施方案中，眼用制剂是水性制剂。在一些实施方案中，眼用制剂呈单一剂量单位的形式。在一些实施方案中，眼用制剂不包含防腐剂。眼用制剂可以还包含一种或更多种另外的治疗剂，诸如抗氧化剂。眼用制剂可以还包含一种或更多种眼泪代替物。在一些实施方案中，眼泪代替物中的至少一种包含眼用润滑剂(例如，羟丙基甲基纤维素)。

多种眼泪代替物是本领域已知的，并且包括但不限于：单体多元醇，诸如甘油、丙二醇和乙二醇；聚合的多元醇诸如聚乙二醇；纤维素酯如羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和羟丙基纤维素；右旋糖酐类诸如右旋糖酐70；水溶性蛋白诸如明胶；乙烯基聚合物，诸如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚维酮；以及卡波姆，诸如卡波姆934P、卡波姆941、卡波姆940和卡波姆974P。许多此类眼泪代替物是可商购的，包括但不限于纤维素酯诸如BionTeargenTearsTears NaturalTears Naturale和以及聚乙烯醇类诸如AkwaMoistureMurine和Visine眼泪代替物还可以包括石蜡，诸如可商购的软膏。被用作眼泪代替物的其他可商购的软膏包括LubrifreshMoisture Eyes和Refresh还可以存在防腐剂和其他添加剂，诸如，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。

实施例

按照三步顺序制备掺入了不同环糊精的基于I型胶原的膜：凝胶化、玻璃化和再水合。测试并比较了3种环糊精，即α-CD、β-CD和γ-CD。

CD溶液的制备：用此处描述的过程制备含有不同CD(例如α、β和官能团、COOH、叔丁基、SH、NH₂)的全部溶液：例如，加入含有20nM HEPES的dH₂O中的β-CD溶液(2.5mg/mL)(在50ml falcon管中，1mL HEPES、49mL H₂O和125mgβ-CD)并彻底涡旋以完全溶解。然后，使用氢氧化钠(2N)溶液将此溶液的pH升高至11，过滤通过0.22μm针筒过滤器并保存在1℃-4℃。

β-CD胶原凝胶的制备：用此处描述的方法制备胶原和CD的多种凝胶：例如，将等体积的β-CD溶液(2.5mg/mL且如以上制备的)和胶原乙酸溶液(5mg/mL)混合到一起并在制备时一直保持在4℃或更低的温度。特别注意防止由于混合形成气泡。然后，将混合物转移至凝胶模具并在37℃、100％RH培养箱保持2小时。

玻璃化和β-CD胶原的后处理：在37℃孵育2小时后，将凝胶转移至5℃(40％RH)玻璃化室18小时。之后，将凝胶转移至40℃玻璃化室(40％RH)一周。一周后，将脱水的β-CD胶原膜(玻璃质凝胶)在dH₂O中再水合30分钟。如果需要，在37℃使用于dH₂O中的0.1％EDAC和0.1％NHS使玻璃质凝胶交联30分钟，用dH₂O洗涤玻璃质凝胶至少5次以去除痕量的EDAC和NHS。亲水官能团诱导如在图1B中示出的薄层结构。

按照之前描述的方法(Biomaterials 34(2013)9365-9372)制备两种胶原膜，即胶原玻璃质凝胶和交联的玻璃质凝胶，作为对照。与常规玻璃质凝胶相比，交联的玻璃质凝胶在凝胶化过程之前，通过在胶原介质混合物中添加额外的0.6％1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和0.6％N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)来制造。使用差示扫描量热法(DSC,Perkin Elmer,Waltham,MA)评价胶原和CD之间的特异性相互作用。使用Synergy 2酶标仪(BioTek,Winooski,VT)测量CD-col膜的吸光度。使用Electroforce 3200测试仪器(Bose,Eden Prairie,MN)用10-0尼龙缝线测试膜缝合性。

使用依序的(sequential)胶原酶(2型,Worthington Biochemical Corp.,Lakewood,NJ)消化从全层角膜(full-thickness cornea)分离角膜细胞。收集经消化的细胞并在1400rpm离心10分钟。将细胞沉淀物重悬并在一般组织培养板(TCP)或在CV覆盖的板上在37℃和5％CO₂下培养。使用无血清培养基或基于血清的培养基。无血清培养基由DMEM/F-12、1％10U/mL青霉素-链霉素和0.5％1.25mg/mL两性霉素B(Life Technologies,Carlsbad,CA)组成。基于血清的培养基包含DMEM/F-12、10％FBS、1％10U/mL青霉素-链霉素和0.5％1.25mg/mL两性霉素B。使用无血清培养基将细胞以5000细胞/cm²的浓度铺板，而使用基于血清的培养基则将细胞以1000细胞/cm²的浓度铺板。在成像和基因表达分析之前，将角膜细胞在无血清培养基中培养超过3周，或在基于血清的培养基中培养6天。通过用LIVE/生存力/细胞毒性试剂盒(Life Technologies)染色来检查角膜细胞的形态。通过将玻璃化的膜浸泡在0.1％吲哚美辛滴眼液中一段时间将吲哚美辛包封于玻璃质凝胶中。使用高效液相色谱(HPLC)测量吲哚美辛从玻璃质凝胶中的洗脱。使用乙腈:水为51:49(v/v)的流动相、C18柱和设定在318nm的UV/VIS检测器测试释放溶液。

实施例1

所有3种环糊精，特别是α-CD，表现出与I型胶原三螺旋的强相互作用，导致透明的且机械强度高的CD-col膜的形成。如在图1A中示出的，常规玻璃质凝胶在热流中在55℃表现出大且宽的吸热峰，这表明胶原膜以40.8J/g的焓经历热变性。相比之下，在交联的玻璃质凝胶的对照样品中没发现可辨别的峰，表明由于交联反应胶原膜的变性特征。与常规玻璃质凝胶相比，在胶原膜中添加α-CD产生升高的变性温度，表明增强的热稳定性。在α-CD-col中仅观察到单个较窄的峰，这意味着基质具有均匀结构。如果我们假设，所有焓来自胶原三螺旋的热转化，α-CD-col的变性焓为来自常规玻璃质凝胶的变性焓的70.1％，表明降低的胶原纤维发生。在β-CD-col和γ-CD-col中也观察到相似的结果。

实施例2

与传统胶原膜相比，CD-col膜示出了极大提高的透明度(图2)，其可以用降低的胶原纤维发生来解释。

开发了具有用于角膜再生的最佳光学性质和最佳机械性质的I型胶原-CD膜。CD代表具有内部疏水核和外部亲水环的6至8个葡萄糖分子的环。全部3种环糊精，特别是α-CD，表现出与胶原三螺旋的强烈相互作用，导致机械强度高的胶原-CD膜的形成。胶原-CD膜示出了比传统胶原膜显著更高的透明度，其可以通过与传统胶原膜(～80nm)相比，胶原-CD膜中大大降低的胶原原纤维直径(～20nm)解释。另外，与显示随机原纤维组织的传统胶原膜不同，可能是由于CD对胶原三螺旋的重新组织，胶原-CD膜在一些区域中展示了排列的原纤维。另外，发现胶原-CD膜可以从滴眼液中吸附眼用药物吲哚美辛，然后缓慢释放药物最高达5小时。

在I型胶原膜中掺入环糊精调节了胶原原纤维发生(fibrillogenesis)和排列，并改善膜的光学、机械和药物释放性质。

实施例3

本发明的组合物展示了优越的机械性能。当它们的厚度与人角膜的厚度相当时(即～500μm)，它们变得足够强韧以用于缝合。如在图3中示出的，将尼龙缝线拉动穿过具有520μm的厚度的α-CD-col膜中的孔。在缝线的压力下，厚膜中的孔仅拉伸，而不是如在具有170μm的厚度的薄膜中观察到的撕裂膜(图4)。

实施例4

胶原纳米结构限定了细胞应答。在具有低和高的胶原密度的玻璃质凝胶组合物上培养牛角膜细胞的原代培养物。如在图5中示出的，当与常规玻璃质凝胶对照相比时，本发明的组合物的胶原密度允许角膜细胞在培养物中具有更大的突起面积。此外，角膜细胞的细胞突起的总数目随着本发明的玻璃质凝胶组合物的胶原密度的增加而显著增加(图5)。

实施例5

角膜细胞基因表达取决于原纤维结构。在对照玻璃质凝胶上或用本发明的玻璃质凝胶组合物培养角膜细胞，其中玻璃质凝胶在5℃或39℃温度脱水。在基于血清的培养基中生长6天后，收获细胞并分析角膜蛋白(keratocan)、醛脱氢酶(ALDH)和双糖链蛋白聚糖(biglycan)的基因表达。通过以下分析这些基因的表达：使用TRIzol试剂(Life Technologies)从培养的角膜细胞分离总RNA，使用SuperScript II第一链合成试剂盒(Life Technologies)逆转录成cDNA，并随后在StepOnePlus实时PCR系统(AppliedLife Technologies)上使用实时PCR反应测试cDNA。如在图6中示出的，当与对照相比时，当细胞在于高温下脱水的玻璃质凝胶组合物上生长时，角膜蛋白和ALDH的基因表达极大提高。在低温和高温两种情况下，双糖链蛋白聚糖的表达在玻璃质凝胶组合物中当与对照相比时降低。

实施例6

本发明的玻璃质凝胶组合物可以被用于递送生物活性剂。如上所述制备玻璃质凝胶组合物，并在使玻璃质凝胶水合后，使用2滴持续10分钟或在1mL滴眼液中浸泡过夜将乙醇中的商购可得的0.1％吲哚美辛的滴眼液制剂的溶液添加至组合物，并使用HPLC测试释放动力学。发现玻璃质凝胶组合物经过5小时的时期从玻璃质凝胶组合物释放吲哚美辛。

开发了本发明的I型胶原-CD组合物，所述I型胶原-CD组合物具有用于角膜再生的优化的光学和机械性能。不限于任何特定理论，这些性能可能是由于环糊精掺入的胶原组合物中经调节的胶原原纤维发生(图7)。本发明的这些组合物具有被用作用于角膜修复和治疗的治疗性眼贴的极大潜力。本文公开的组合物和方法也可以用于来源于形成原纤维的胶原的其它结缔组织诸如软骨、皮肤以及血管的再生。

实施例7

研究了胶原和环糊精的相互作用对胶原原纤维组织的作用。将于酸性溶液中的I型胶原和不同组成的环糊精溶液合并。然后此溶液可以被缓冲以升高pH来形成凝胶。然后在1周的时期使这些凝胶玻璃化，之后将CD-Col的干燥片再水合。进行多种样品表征以符合临床上此类植入物的要求。

如下所述制备材料：使用合适的缓冲液中的I型胶原和环糊精溶液形成水凝胶。在受控的温度和相对湿度下，在1周的时期进行玻璃化过程。将环糊精胶原玻璃质凝胶植入物再水合。

样品需要以下临床性质/试验：透光性；透射电镜显微术；机械测试；体外生物相容性研究；初步体内研究。

这些制备的环糊精/胶原材料，即使在500微米的厚度也是透明的，特别是当与不含环糊精的传统玻璃质凝胶相比时。此外，观察到根据环糊精的类型和官能团，见到透明度的变化。这些植入物的大多数示出了与人角膜相当的透明度，即在可见光范围高于90％。有趣的是，还观察到，用足够的力量，可以将这些厚片一层一层地分成更薄的片(参见图13)。这促使我们在TEM下使这些可视化，以了解这些层来自何处。观察到多种超微结构。特别吸引人的是具有COOH官能团的CD，其显示出与天然角膜基质的片层(lamellae)相似的自组装片层。它们不仅自组装成片层，如可以在横截面中观察到的，而是每个片层中的胶原展示纤维排列，并且相邻片层中的纤维彼此正交(参见图15)。进行机械测试以确定具有各种CD组分的植入物的强度，并且也观察到CD类型之间的广泛区别。有趣的是，注意到β-CD胶原植入物具有最高的杨氏模量，并且如可以在下图观察到的——含CD的全部植入物展示了非常高的断裂应变——这表明这些材料是高度可延伸的，一种被观察到直接转化成抗断裂性的性质，或在此情形中，缝合性(参见图16)。为了确定植入物是生物相容的，检验角膜细胞和上皮细胞二者与植入物的体外细胞培养。如可以观察到的，植入物在这些表面上生长没有问题(图17)。另外，尽管有些非常规，还在皮下检验了生物相容性。如果皮下植入物不引起任何不良免疫反应，可以说，最可能地，这些植入物对免疫豁免的角膜(immune privileged cornea)也将不具有副作用(图18)。另外，这些植入物在特殊的模具中制成以适应眼的弯曲度。如可以在右侧观察到的，植入物良好地位于角膜表面。

通过将这些角膜植入到兔眼睛进行试验研究。普通中断缝合(regular interrupt suture)能够良好固定材料(图19)。结论是，CD分子充当人工伴侣蛋白，其指导胶原原纤维模拟天然角膜的组织的装配。CD胶原植入物是生物相容的并且具有角膜仿生性质。CD官能化调节超微结构和宏观性质。由于高透明度、容易缝合和仿生的超微结构，CD胶原植入物示出了作为角膜代替物的潜力。

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