根表铁膜/微生物膜生成模拟装置及方法与流程

本发明属于植株培育领域，具体涉及一种根表铁膜/微生物膜生成模拟装置及根表铁膜/微生物膜生成模拟方法。

背景技术：

湿地植物根系长期处于淹水状态，因此，许多湿地植物(如：水稻、宽叶香蒲等)具有发达的氧气运输系统，可以将氧气运输至根表，在根表形成微氧化状态，这种现象被称为根际泌氧(rol)。由于湿地植物根际泌氧现象的存在，湿地植物根表附近的亚铁离子易被氧化为铁氧化物的形式，形成根表铁膜。根表铁膜主要由铁氧化物胶膜形成，该胶膜是一种两性胶体，能够通过吸附、氧化-还原和共沉淀等作用影响多种元素在土壤中的化学行为和生物有效性，从而减少根系对毒害离子的吸收，维持正常生长。因此，水生植物被广泛应用于处理自然和人工湿地中的矿藏污染、污水等。这些植物既能快速指示受污染的环境，又可通过植物修复作用吸收污染物，净化环境。

较之其他环境(例如生物膜反应器、自然水体)中的生物膜，根表微生物膜迄今得到的关注相对较少，但仍有研究表明大多数根际细菌如假单胞菌、枯草杆菌、伯克霍尔德菌属植物促生菌、自生固氮菌以及氨氧化细菌等可在植物根表形成微生物膜，且在湿地植物宽叶香蒲及芦苇根表也观察到微生物膜的存在。常见的根表微生物膜厚度约15～100μm，在研究中通常被作为均一的整体来考虑，湿地植物根系泌氧可能造成的生物膜好氧、厌氧分区，尚未见研究报道。

铁硫氧化/根表微生物膜和根表铁膜长期以来都被作为独立对象进行研究，但也有研究认为二者不可割裂，因为湿地植物根表微生物的胞外聚合物有助于fe3+聚集吸附形成铁膜，同时利于微生物团聚并吸附于根表形成生物膜，所以根表微生物膜和铁膜在结构上必然相互交叉。据此，进一步提出湿地植物根表微生物膜中铁硫氧化/还原微生物借助微生物膜与铁膜在结构上的相互交叉，在功能上实现协同互补，并通过重金属一个假想的湿地植物根表微生物膜结构应为：硫氧化细菌、铁氧化细菌及铁氧化物(针铁矿、水铁矿等组成铁膜的主要物质)分布在微生物膜内层(好氧层)，铁还原细菌、硫酸盐还原细菌等分布在外层(厌氧层)。在这一假想结构中，根表铁膜的形成消耗并阻隔rol分子氧向生物膜外层输送，硫酸盐还原形成的金属硫化物(ms)沉淀于外层则阻断fes2向内层输送，并最终止于后者。

现有研究大都是直接对植物的根表铁膜/微生物膜进行分析，很少有研究利用模型对根表铁膜/微生物膜进行模拟，由于植物根际土壤情况复杂、干扰因素众多、植物根直径较小、铁膜厚度小，众多影响因素不可控性极大，导致根表铁膜/微生物膜的内部构造研究进展缓慢。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供一种根表铁膜/微生物膜生成模拟装置及方法，利用简单的装置，对根表铁膜/微生物膜进行模拟生成，弥补真实植物根系情况复杂、可研究根表铁膜/微生物膜表面积小、复杂因素难以控制的不足。

为解决上述问题，一方面，本发明在于提供一种根表铁膜/微生物膜生成模拟装置，包括膜生成装置、与膜生成装置匹配的密封装置、氧气装置；所述氧气装置通过密封装置中部开设的通孔设置在膜生成装置内。

进一步地，所述膜生成装置包括顶空血清瓶；所述密封装置包括与顶空血清瓶匹配的瓶盖；所述氧气装置包括硅胶管和硅胶管底部塞入的橡胶塞。

更进一步地，所述瓶盖中部开设有硅胶管通过的通孔，所述硅胶管穿过瓶盖通孔设置在顶空血清瓶中，且硅胶管底部被橡胶塞堵住。

进一步地，所述硅胶管底部与橡胶塞之间的缝隙用凡士林密封。

进一步地，所述硅胶管与瓶盖通孔之间的缝隙通过玻璃胶密封。

进一步地，所述硅胶管底部离顶空血清瓶底部的距离为顶空血清瓶内高的1/20～1/10，优选为1/10。本装置所采用的硅胶管内径6mm，外径9mm，长200mm。所有实验器材均酸洗后高温高压灭菌。硅胶管与瓶盖接口及瓶盖与瓶身接口处密封，通过向装置中充入氮气等惰性气体确保瓶内处于无氧状态。

另一方面，本发明提供一种根表铁膜/微生物膜生成模拟方法，具体步骤如下：

取尾矿库湿地植物根表附近的泥水混合物置于本发明所述的模拟装置的膜生成装置即顶空血清瓶中，密封顶空血清瓶开口后于室温中避光静置在硅胶管表面生成铁膜/微生物膜。

进一步地，所述泥水混合物的体积比为泥：水＝1:2。

进一步地，所述膜生成装置即顶空血清瓶中在装入泥水混合物前，在厌氧箱中放置48h，用氮气将装置内的氧气除尽，使其处于无氧状态。

进一步地，所述模拟装置用锡纸包裹做避光处理后，常温常压下，氧气由氧气装置(即硅胶管)上口扩散进入膜生成装置(即顶空血清瓶)，氧气扩散速率为9.8～12μm/h。

进一步地，所述静置的时间为1～2个月，所述铁膜/微生物膜的厚度为15～100μm。优选时间为1个月、2个月。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供一种根表铁膜/微生物膜生成模拟装置及方法，利用装置中硅胶管表面规则且规整面积比植物根多，更便于观察根表铁膜微生物膜的结构。运用本发明提供的装置生成的铁膜厚度在15～100μm，完全可比拟自然状态形成的铁膜厚度，且较自然状态下形成的铁膜更加均匀。通过检测分析观察铁膜内外层的金属存在状态和微生物种类及分布情况，以此探究铁膜内外层氧化还原情况。

本发明利用极其简单的设备，对根表铁膜/微生物膜进行模拟生成，弥补真实植物根系情况复杂、可研究根表铁膜/微生物膜表面积小、复杂因素难以控制的不足。

本发明利用极其简单的设备，其中硅胶管具有透气不透水的物理特性，利用硅胶管模拟湿地植物根系，硅胶管的透气性能模拟湿地植物根系泌氧，经过一段时间的培养在硅胶管表面形成铁膜。硅胶管根系泌氧速率与植物根系相当，长时间培养后可以形成结构完整的铁膜/微生物膜，且管表面光滑，便于将铁膜/微生物膜分离、分析。

本发明公开的装置具有制作简单、能重复使用、且制备价格低廉，样品前处理简单、设备便携适合现场收集制备。

附图说明

图1(a)为本发明提供的装置的结构示意图；

图1(b)为本发明提供的装置生成根表铁膜/微生物膜原理的示意图。

图2为本发明提供的装置生成的根表铁膜/微生物膜的示意图。

图3为本发明提供的装置生成的根表铁膜/微生物膜的根表微生物群落结构分析图。

图4为本发明提供的装置生成的根表铁膜/微生物膜的根表微生物膜结构显微成像图。

图5为本发明提供的装置生成的根表铁膜/微生物膜的根表微生物膜结构微观分析图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1

根表铁膜/微生物膜生成模拟装置，包括顶空血清瓶3、瓶盖2、硅胶管1、橡胶塞；所述瓶盖中部开设有硅胶管1通过的通孔，所述硅胶管1与瓶盖通孔之间的缝隙通过玻璃胶密封；所述硅胶管1底部伸入顶空血清瓶3底部，且硅胶管1底部被橡胶塞堵住并用凡士林密封。

在尾矿库湿地采集湿地植物根表附近的泥水混合物，采集的样品应尽量接近湿地植物根部，以确保实验所用泥水混合物中微生物种类、数量充足，且污染物种类含量与自然状态可比。采集后迅速密封处理(保持厌氧状态防止金属离子氧化)，4℃低温保存(降低微生物活性)。

将所有组件高温高压灭菌后，按图1(a)组装好实验仪器，在厌氧箱中放置48h，利用惰性气体n2气将瓶内的氧气除尽；硅胶管与瓶盖接口处用玻璃胶密封，用橡胶塞将硅胶管下口塞住，用凡士林密封，上述过程于厌氧箱中完成。

将野外采集的尾矿泥水混合物按体积比泥：水＝1:2在无氧条件下装入250ml血清瓶内，立刻盖紧盖子，并用parafilm封口膜经瓶口处密封，确保瓶内处于无氧状态。将装置用锡纸包裹做避光处理后置于常温常压条件下，氧气以扩散方式通过硅胶管进入装置，氧气通量约为9.8μm/h，与自然根系泌氧情况可比。将实验装置于室温下静置1-2个月，形成铁膜/微生物膜(具体过程如图1(b)所示)，铁膜厚度在15～100μm，完全可比拟自然状态形成的铁膜厚度，且较自然状态下形成的铁膜/微生物膜更加均匀。观察铁膜内外层的金属存在状态和微生物种类及分布情况，以此探究铁膜内外层氧化还原情况。

静置两个月后，硅胶管表层形成明显红褐色膜状物质，接近水-土界面处红褐色尤为明显，如图2所示。

实施例2

将实施例1附着有铁膜的硅胶管进行冷冻切片，切片样品用环氧树脂包裹后于-80℃储存。分别进行分析，分析方法如下：

1.根表微生物群落结构分析。将根段样品提取dna，用细菌通用引物扩增16srrnav3v4可变区。pcr产物纯化并进行illumina高通量测序(miseq平台)，经降噪音和去除chimera处理，应用blast(basiclocalalignmentsearchtool)比对16srrna数据库获得生物学分类信息，经最近共同祖先法(leastcommonancestors，lca)注释后，分析不同形成阶段根表微生物膜中优势菌群及铁硫氧化/还原细菌微生物群落结构和丰度，所得群落分体图如图3所示。图3所示为分离后三组根表铁膜样品的16srna测序的初步分析结果，反映出了根表铁膜中微生物的种类和丰度。图中可以看出三组样品中1(s1～i1)、3(s3～i3)两组群落变化趋势相似，第2组(s2～i2)与前两组有差异，导致这一差异的原因可能是取样位置不同。

2.根表微生物膜结构显微成像观察。对样品进行固定、切片和喷金等预处理，使用环境扫描电子显微镜(environmentscanningelectronmicroscopy,esem)高真空模式观察根表微生物膜的结构及膜上微生物的形态，结果如图4所示。图4中所示为去离子水冲洗去除表土后用sem电镜在260放大倍数下观察到的硅胶管表面根表铁膜的附着情况。

3.根表微生物膜结构微观分析。使用x射线光电子能谱分析(x-rayphotoelectronspectroscopy,xps)检测根表金属离子(fe(2p)、s(2p))元素形态分析，初步确定了各元素的结合形态，结果如图5所示。图5中数据表示根表铁膜内铁元素存在+2价、+3价等多种价态形态，硫元素则主要以正6价存在。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。