桂皮醛在制备用于靶向治疗耐药曲霉菌感染药物中的应用的制作方法

本发明涉及一种活性成分制备药物中的应用，更具体的说，是涉及桂皮醛在制备用于靶向治疗耐药曲霉菌感染药物中的应用，属于医药
技术领域：
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背景技术：
：侵袭性耐药真菌感染是指真菌侵入人体组织、血液，并在其中生长繁殖，引致组织损害、器官功能障碍、炎症反应的病理改变及病理生理过程。近年来，随着器官移植及各种导管技术的不断推广和开展、抗菌药物的不合理使用，以及使用呼吸机辅助通气、静脉营养支持治疗的危重症患者数目不断增加，加之人类疾病谱的改变和人口结构的老龄化，医院内侵袭性耐药真菌感染的发病率明显上升。侵袭性耐药真菌感染是严重危及ICU重症患者的并发症，目前治疗药物较少，多系化学合成，如氟康唑、伊曲康唑、两性霉素B、卡泊芬净、米卡芬净、伏立康唑等。上述药物虽然有一定的抗菌作用，但由于近年来，耐药菌株不断增多，尤其是对唑类药物耐药，如氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、酮康唑、氟胞嘧啶等，临床治疗仍然比较棘手、预后较差。许多血液病、肿瘤、肺部感染、免疫力低下及艾滋病患者最后死于严重的侵袭性耐药真菌感染。一旦感染侵袭性耐药曲霉菌(烟曲霉菌、黄曲霉菌)病情将会更加严重，病死率极高。目前，侵袭性耐药真菌感染已越来越成为医院住院患者尤其是免疫缺陷患者继发感染后死亡的重要因素之一，已成为国内外医学界广泛的重视和急需解决的问题。因此，临床迫切需要获得一种新型、高效、低毒、安全、价廉的靶向治疗侵袭性耐药真菌感染的药物。技术实现要素：有鉴于此，为克服现有技术之缺陷，本发明开始着手研究、开发能够有效治疗侵袭性耐药真菌感染的药物。桂皮醛是樟科植物肉桂挥发油(占80-90％)的主要成分，是药典(2015)法定药材。国家药食同源药材目录(2015版)，桂皮为药食同源药材，是国家食品安全标准、食品添加剂使用标准(GB2076－2011)规定允许使用的食品天然香料，广泛应用于食品中。桂皮醛具有解热、解表、发散、镇痛以及抗真菌、抗肿瘤、抗病毒等多种药理作用。专利ZL03106981.9公开了一种用于深部真菌感染的中药组合物，其中包括桂皮醛、藿香油和/或丁香油，用于抗深部真菌，该专利指出经过反复实验，筛选出具有良好协同作用的桂皮醛与藿香油和/或丁香油组合物，使用其不但具有良好的抗深部真菌的作用，同时还具有广谱抗菌作用。专利ZL201410319040.2公开了一种用于制备抗曲霉菌药物的中药组合物，该组合物包括桂皮醛、广藿香酮，用于抗曲霉菌，该专利同时指出，在藿香油的众多组分中筛选出了广藿香酮，其抑菌活性较高，并与桂皮醛有良好的协同增效作用，二者适于配伍后使用，并且较桂皮醛与藿香油配伍后的抑菌活性有显著的提高，且安全性良好。上述两篇专利所公开的药物组合物治疗的曲霉菌均是临床株。在合理用药情况下，临床株曲霉菌对唑类药(如氟康唑、伊曲康唑)、丙烯胺类(如特比萘芬、奈替芬)比较敏感，但侵袭性耐药曲霉菌对上述药物却表现出不敏感。正是由于存在此种情况，才导致感染侵袭性耐药曲霉菌后，乏药可治，进而成为医药界焦点。由于专利ZL201410319040.2公开的抗曲霉菌组合物(桂皮醛与广藿香酮)具有协同增效作用，治疗效果均优于单用桂皮醛或单用广藿香酮，因此，发明人在上述专利的教导与启示下，使用专利ZL201410319040.2公开的抗曲霉菌组合物(桂皮醛与广藿香酮)展开了对侵袭性耐药曲霉菌感染的研究。然而，出乎意料的是，桂皮醛与广藿香酮联合使用并未能达到良好的、预期的治疗结果。经对中药进行大量的筛选、有效成分的提取、体外抗菌活性实验、毒理、药理、抗真菌机制的研究、动物模型的建立、药物配方的研制和制备等，意外的发现了单独使用桂皮醛却取得了意想不到的治疗结果，遂作出本发明。本发明在现有技术教导与启示的基础上，反其道而行之，首次提出不使用桂皮醛与广藿香酮联合用药，而是单独使用桂皮醛用于治疗侵袭性耐药曲霉菌感染。因此，本发明解决现有技术问题的技术方案如下所述。桂皮醛在制备用于靶向治疗耐药曲霉菌感染药物中的应用，所述耐药曲霉菌为侵袭性耐药曲霉菌。进一步的，上述应用，所述侵袭性耐药曲霉菌为烟曲霉菌或黄曲霉菌。为实现上述应用，本发明的第一种方式是，所述用于治疗耐药曲霉菌感染药物，其由以下重量份的组分制备而成：桂皮醛40～80、吐温-800.1～2、生理盐水溶液900～1000。本发明的第二种方式是，所述用于治疗耐药曲霉菌感染药物，其由以下重量份的组分制备而成：桂皮醛40～80、吐温-800.1～2、β-环糊精8～15。本发明的第三种方式是，所述用于治疗耐药曲霉菌感染药物，其由桂皮醛单体包合物和/或药学上可接受的载体制备而成。针对该第三种方式，进一步的，所述桂皮醛单体包合物由以下重量份的组分制备而成：桂皮醛10～60、羟丙基-β-环糊精20～80。所述羟丙基-β-环糊精为2-羟丙基-β-环糊精。针对该第三种方式，所述桂皮醛单体包合物由以下步骤制备：1)将2-羟丙基-β-环糊精加入到80℃去离子蒸馏水中，搅拌溶解，然后降温至20℃，制备得到水溶液，备用；其中，2-羟丙基-β-环糊精与去离子蒸馏水的重量mg/体积mL比为1：10；2)搅拌下，向步骤1)所得水溶液中缓慢滴加用乙酸乙酯溶解的桂皮醛，滴加完毕后，升温至70℃，并继续搅拌1小时，然后置冰箱冷藏24小时，得冷藏液，备用；其中，桂皮醛与乙酸乙酯的体积mL比为1：6；3)将步骤2)所得的冷藏液过滤，固体物用少量蒸馏水洗涤后，低温5℃真空干燥24小时，研碎，过筛80目，再用乙酸乙酯洗涤三次后晾干，即得白色疏松状桂皮醛单体包合物。本发明结合对抗真菌作用历经十几年的实验研究，经对中药进行大量的筛选、有效成分的提取、体外抗菌活性实验、毒理、药理、抗真菌机制的研究、动物模型的建立、药物配方的研制和制备等，意外的发现了单独使用桂皮醛可以有效治疗侵袭性耐药曲霉菌。这种发现突破了现有技术的教导与启示，是本领域技术人员不经过创造性劳动就得不出来的，具有突出的实质性特点和显著的进步。为了进一步研究桂皮醛治疗侵袭性耐药曲霉菌的体内疗效、安全性及药物在体内作用的靶位机制。本发明采用了组织真菌学、组织病理学、组织生物化学、组织电镜学的方法，研制出桂皮醛制剂(包括口服剂、注射剂)。为临床呼吸科、血液科、急诊ICU、肿瘤科、器官移植等科室的真菌感染提供一种高效、低毒及靶向治疗侵袭性耐药曲霉菌感染的新型抗菌药物，为研发中药治疗侵袭性耐药曲霉菌感染提供体内药效学及作用机制及理论实验依据，为科技成果转化创造条件。附图说明图1菌丝胞壁胞膜完整内容物饱满图2胞壁、胞膜、胞核完整，层次清晰图3菌丝胞壁大部分溶解消失，但胞膜完整，胞内内容物消失，水肿图4胞壁外层溶解消失，但胞膜完整，胞内内容物消失，水肿图5胞壁外层溶解脱落，变薄，但胞膜完整，仍有胞核内容物图6胞壁部分脱落变薄，外层不完整，但胞膜完整清晰，仍有胞核具体实施方式为了使本领域技术人员能够更好地理解本发明，下面结合实施例，对本发明的技术方案进一步阐述。需要说明的是，以下描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，本领域普通技术人员基于本发明实施例，在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他实施例，都属于本发明保护的范围。对比试验例1桂皮醛与广藿香酮联合使用与桂皮醛单独使用的对比对比实施例1为专利ZL201410319040.2公开的实施例1。实施例1为对比实施例1去掉广藿香酮，其他保持不变。受试侵袭性耐药曲霉菌临床株来自河北医科大学第二医院真菌室，痰标本直接镜检可见大量较粗且成45度分枝分隔的菌丝体，经沙煲氏培养、察氏培养，经鉴定与及药敏试验为侵袭性耐药烟曲霉菌、黄曲霉菌，结果见表1。表1抗真菌药对侵袭性耐药曲霉菌MICmgml-1值侵袭性耐药曲霉菌株n氟康唑伊曲康唑两性霉素B伏立康唑酮康唑氟胞嘧啶烟曲霉菌3016-648-161-81-46464黄曲霉菌308-324-168-324-166464依据专利ZL201410319040.2公开的实验例1所述方法测定对比实施例1与实施例1分别治疗侵袭性耐药曲霉菌的效果，结果见表2。表2桂皮醛与广藿香酮联合使用与桂皮醛单独使用的MIC值由表2数据可知，桂皮醛单独使用对侵袭性耐药烟曲霉菌的MIC均值为0.0097mgml-1，对侵袭性耐药黄曲霉菌的MIC均值为0.0195mgml-1。桂皮醛单独使用比桂皮醛与广藿香酮联合使用抗侵袭性耐药曲霉菌作用显著增强，此结果确实超出预期。为进一步发挥桂皮醛单独使用的临床效果，本发明提出将桂皮醛使用羟丙基-β-环糊精包含，得桂皮醛单体包合物。该桂皮醛单体包合物可通过药学
技术领域：
常规技术进一步制成口服、注射剂型。所述桂皮醛单体包合物由以下重量份的组分制备而成：桂皮醛10～60、羟丙基-β-环糊精20～80。所述羟丙基-β-环糊精为2-羟丙基-β-环糊精。实施例2本发明所述的桂皮醛单体包合物组成：桂皮醛1.25g(50重量份)2-羟丙基-β-环糊精1.25g(50重量份)制备方法：1)将2-羟丙基-β-环糊精加入到80℃去离子蒸馏水中，搅拌溶解，然后降温至20℃，制备得到水溶液，备用；其中，2-羟丙基-β-环糊精与去离子蒸馏水的重量mg/体积mL比为1：10；2)搅拌下，向步骤1)所得水溶液中缓慢滴加用乙酸乙酯溶解的桂皮醛，滴加完毕后，升温至70℃，并继续搅拌1小时，然后置冰箱冷藏24小时，得冷藏液，备用；其中，桂皮醛与乙酸乙酯的体积mL比为1：6；3)将步骤2)所得的冷藏液过滤，固体物用少量蒸馏水洗涤后，低温5℃真空干燥24小时，研碎，过筛80目，再用乙酸乙酯洗涤三次后晾干，即得白色疏松状桂皮醛单体包合物。实施例3本发明所述的桂皮醛单体包合物组成：桂皮醛1g(10重量份)2-羟丙基-β-环糊精2g(20重量份)制备方法：同实施例2。实施例4本发明所述的桂皮醛单体包合物组成：桂皮醛6g(60重量份)2-羟丙基-β-环糊精8g(80重量份)制备方法：同实施例2。对比实施例2桂皮醛单体包合物MIC值同理，依据专利ZL201410319040.2公开的实验例1所述方法测定对比实施例1与实施例2分别治疗侵袭性耐药曲霉菌的效果。受试侵袭性耐药曲霉菌临床株来自河北医科大学第二医院真菌室，痰标本直接镜检可见大量较粗且成45度分枝分隔的菌丝体，经沙煲氏培养、察氏培养，经鉴定为烟曲霉菌、黄曲霉菌，结果见表3。表3桂皮醛与广藿香酮联合使用与桂皮醛单体包合物的MIC值————桂皮醛与广藿香酮联合使用桂皮醛单体包合物侵袭性耐药曲霉菌株nMIC/mgml-1MIC/mgml-1烟曲霉菌100.01950.0048黄曲霉菌100.07810.0097由表3数据可知，桂皮醛单体包合物对侵袭性耐药烟曲霉菌的MIC均值为0.0048mgml-1，对侵袭性耐药黄曲霉菌的MIC均值为0.0097mgml-1。桂皮醛单体包合物比桂皮醛普通方式使用、桂皮醛与广藿香酮联合使用抗侵袭性耐药曲霉菌作用都显著增强，此结果又进一步超出预期。研究例1实施例2桂皮醛单体包合物治疗ICR小鼠肺侵袭性耐药烟曲霉菌感染体内药效学及作用靶位机制的实验研究一、研究步骤1、侵袭性耐药烟曲霉菌实验小鼠分组：460只ICR小鼠随机分为免疫抑制组40只，模型组90只，实施例2桂皮醛单体包合物治疗组90只(口服药物治疗组、预防组、注射药物组)，对照组90只(伏立康唑口服对照组、口服生理盐水对照组、注射生理盐水对照组)，安全用药组120只(口服桂皮醛组、注射桂皮醛组)，质控组30只。2、烟曲霉菌悬液制备将烟曲霉制备成1x107(108)cfu/ml菌悬液50ul滴注到10％水合氯醛麻醉的免疫抑制ICR小鼠两侧鼻腔内，于第48-72h取小鼠肺脏组织置于37℃孵育箱内5天，其生长的菌株为增强毒力的实验菌株，将菌株用2-HP-β-CD去离子水制备成1x107(108)cfu/ml浓度的菌悬液备用。再将菌悬液用2-HP-β-CD去离子水稀释10倍，取100ul接种于葡萄糖蛋白胨琼脂平板内，37℃培养，计数，确定菌株的存活率。3、免疫抑制ICR小鼠模型的建立(40只)正常对照组41％去离子水腹腔注射0.25ml连续2次10只；免疫抑制组、模型组、桂皮醛单体包合物口服药物组、桂皮醛单体包合物注射药物组、伏立康唑口服对照组、安全用药组、1％去离子水对照组及质控组，于第一、二天或第三天，每只小鼠腹腔对照组，连续2天腹腔注射1％去离子水0.25ml。4、免疫抑制ICR小鼠侵袭性耐药烟曲霉菌感染模型的建立第四天用10％水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射待麻醉后，对模型组桂皮醛口服药物、桂皮醛注射药物组、伏立康唑口服对照组、对照组鼻腔滴注1x107cfu/ml的菌悬液50ul，建立免疫抑制小鼠肺及侵袭性耐药烟曲霉菌的模型。5、桂皮醛单体包合物治疗免疫抑制ICR小鼠侵袭性耐药烟曲霉菌感染免疫抑制的第五天(灌菌的第二天)对桂皮醛单体包合物口服组、桂皮醛注射组、伏立康唑口服对照组、安全用药组、1％去离子水对照组，分别给予桂皮醛单体包合物口服、桂皮醛单体包合物注射、伏立康唑口服。连续用药21天，进行治疗免疫抑制小鼠肺感染侵袭性耐药烟曲霉菌的疗效观察。桂皮醛单体包合物口服预防组，注射免疫抑制剂的第二天，开始口服桂皮醛单体包合物240mg/kg。口服药物：每只小鼠灌胃0.5ml，每日1次，连续21天。注射药物：每只小鼠腹腔注射0.25ml，每日1次，连续21天。安全用药组：每只小鼠灌胃0.5ml，每日1次，连续28天。二、研究结果1、桂皮醛单体包合物对免疫抑制ICR小鼠肺侵袭性耐药烟曲霉菌感染组织真菌学、病理学、生物化学疗效结果。结果如下。(1)桂皮醛单体包合物对免疫抑制ICR小鼠肺侵袭性耐药烟曲霉菌感染组织真菌学疗效结果，见表4。表4口服桂皮醛对免疫抑制ICR小鼠肺侵袭性耐药烟曲霉菌感染的组织真菌学影响(2)桂皮醛单体包合物对免疫抑制ICR小鼠肺侵袭性耐药烟曲霉菌感染组织病理学疗效结果，见表5。表5口服桂皮醛对免疫抑制ICR小鼠肺侵袭性耐药烟曲霉菌感染的组织病理学影响分组n炎症反应真菌阳性反应治愈有效效率(％)治疗药物组3010680预防用药组307487伏立康唑组30212130生理盐水组30000模型组3030300口服桂皮醛单体包合物治疗组：肺组织10例有炎性细胞浸润，6例有少量断裂菌丝及孢子，有24例病理治愈，治愈率80％。口服桂皮醛单体包合物预防用药组：肺组织7例有炎性细胞浸润，4例有少量断裂菌丝及孢子，有26例病理治愈，治愈率87％。治疗药物组PAS：桂皮醛制剂(治疗、预防)组，7-10天，肺组织内真菌减少，被破坏的肺泡逐渐恢复桂皮醛单体包合物治疗7-10天，肺组织内真菌减少，被破坏的肺泡逐渐恢复。桂皮醛单体包合物治疗14-21天，肺组织内真菌消失，被破坏的肺泡逐渐恢复正常。桂皮醛单体包合物治疗21-28天，肺组织内真菌消失，被破坏的肺泡恢复正常。(3)桂皮醛单体包合物对免疫抑制ICR小鼠肺侵袭性耐药烟曲霉菌感染组织1,3-β-D-葡聚糖影响的疗效及作用靶位结果桂皮醛单体包合物对免疫抑制ICR小鼠肺组织中侵袭性耐药烟曲霉菌1,3-β-D-葡聚糖影响模型的建立烟曲霉菌感染小鼠死亡后取肺组织做1,3-β-D-葡聚糖的测定，结果如下，见表6。表6肺组织做1,3-β-D-葡聚糖的测定结果分组nmg/mL均值mg/ml免疫抑制剂+烟曲霉I304027->5000>5000免疫抑制剂+烟曲霉II304080->5000>5000免疫抑制剂+生理盐水3045-<108<100肺组织1,3-β-D-葡聚糖含量，免疫抑制剂+烟曲霉I及免疫抑制剂+烟曲霉II与免疫抑制剂+生理盐水组相比，均有显著性差异。免疫抑制剂+烟曲霉I及免疫抑制剂+烟曲霉II，两组无明显差异。桂皮醛单体包合物对免疫抑制ICR小鼠肺组织中侵袭性耐药烟曲霉菌1,3-β-D-葡聚糖影响的结果，见表7。表7桂皮醛单体包合物对免疫抑制小鼠肺侵袭性耐药烟曲霉菌感染的β-(1,3)-D葡聚糖检测的结果(mg/ml)分组nβ-(1,3)-D葡聚糖检测结果均值口服桂皮醛治疗组30246.09-2566.291360.89口服桂皮醛预防组治疗30698.22-2160.641562.54口服伏立康唑对照组305279.08-4856.365685.94模型组304875.19-7783.455930.36去离子水对照组3052.49-98.8081.58(4)桂皮醛制剂对免疫抑制ICR小鼠肺组织中侵袭性耐药烟曲霉菌胞壁超微结构作用靶位影响机制的结果体内电镜结果：侵袭性耐药烟曲霉菌在肺组织内细胞壁结构模型：菌丝隔膜清晰，胞壁层次清晰完整，胞膜、胞核及内容物完整，见图1-2。桂皮醛单体包合物治疗肺侵袭性耐药烟曲霉菌感染机理：用药14天，提前用药5天，对细胞壁结构影响，菌丝胞壁变薄，外三四层脱落消失，细胞内及细胞周围水肿，但胞膜完整，胞核及内容物完全消失，说明桂皮醛在体内直接作用在曲霉菌外三四层胞壁，细胞死亡，见图3-4。桂皮醛单体包合物治疗肺侵袭性耐药烟曲霉菌感染机理：用药12天(未提前用药)对细胞壁结构影响，菌丝水肿变形，菌丝及孢子的胞壁外层溶解、消失、变薄，但胞膜完整清晰，仍有部分胞核及内容物，说明桂皮醛在体内直接作用在曲霉菌外三四层胞壁，但菌丝尚未完全破坏，见图5-6。通过研究，桂皮醛单体包合物治疗免疫抑制ICR小鼠侵袭性耐药烟曲霉菌感染的组织真菌学、病理学、生物化学的疗效，如下。1、组织真菌学疗效桂皮醛单体包合物口服剂，药物治疗组240mg/kg，预防治疗组240mg/k，对侵袭性耐药烟曲霉菌肺感染组织真菌学的疗效，均达到80-87％。2、组织病理学疗效桂皮醛单体包合物口服剂，桂皮醛单体包合物240mg/kg，对侵袭性耐药烟曲霉菌感染组织病理学疗效，均达到80-87％。3、组织生物化学疗效桂皮醛单体包合物口服剂，治疗组240mg/kg为78％，预防组为240mg/kg81％，伏立康唑对照组240mg/kg仅为30％。4、组织电镜机理及药效(1)电镜机理：桂皮醛单体包合物在体内直接作用在侵袭性耐药烟曲霉菌外三四层细胞壁(β-(1,3)-D葡聚糖层)，使孢子、菌丝胞壁严重缺损、片状脱落、溶解、变薄，表面粗糙、残缺不整。但细胞膜无损、清晰、完整，菌丝隔膜、细胞核、细胞器及内容物较完整。说明药物在体内直接作用在真菌细胞壁的β-(1,3)-D葡聚糖层。而人类细胞没有细胞壁，对人类不易产生毒副作用的理论依据。(2)电镜的药效，当药物破坏细胞壁后穿过细胞膜进入菌体，使胞内外物质交换受阻，破坏了细胞对营养物质的吸收及生物合成，导致线粒体、溶酶体等细胞器水肿、溶解、变性、坏死而起到强大的杀菌作用。以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3