靶向性凝固因子及其使用方法
【专利摘要】提供了靶向性凝固因子，其包含与至少一个特异性结合血细胞上的膜蛋白质的域连接的凝固因子。所公开的靶向性凝固因子提高凝固因子的效率，并延长其作用的持续时间，并且如此是用于治疗血液学疾病诸如血友病A的改善。
【专利说明】靶向性凝固因子及其使用方法
[0001] 此案是申请日为2009年5月15日、中国申请号为200980126328. 5、发明名称为 "靶向性凝固因子及其使用方法"的发明申请的分案申请。
[0002] 本申请要求2008年5月16日提交的美国临时申请流水号61/053, 932的权益，通 过提及而将其内容完整收入本文。 发明领域
[0003] 本申请涉及具有升高的功效的靶向性凝固因子。本发明进一步提供了治疗凝固因 子缺乏病症患者的方法，其通过将凝固因子选择性靶向至其作用的生物学位置，诸如通过 将凝血因子VIII (FVIII)靶向至红细胞和血小板来进行。还提供了药物组合物，其包含依 照本发明的靶向性凝固因子。
[0004] 发明背景
[0005] 生物学药物的效率常常受到其在患者中的作用持续时间限制，尤其在疾病需要药 物的持续调控时。因此，药动学特性的增强对于治疗剂在临床上的成功通常比药物效力的 优化更重要。一种保护药物免于各种清除机制以延长半衰期的办法是添加靶向域，其促进 药物结合至循环中的长寿命蛋白质诸如基质蛋白或细胞（诸如血细胞或内皮细胞）表面。 例如，已经显示了治疗性肽或蛋白质定位于血细胞表面通过阻止正常的清除机制来延长其 循环半衰期（Chen等，Bloodl05 (10) :3902-3909, 2005)。可以使用极其多种分子作为靶向 域。
[0006] 在另一个例子中，在连接蝶（tick)抗凝蛋白的Kunitz型蛋白酶抑制剂（KPI)域 与阴离子磷脂、磷脂酰-L-丝氨酸（PS)结合蛋白、膜联蛋白V(ANV)时，显示了融合蛋白 (ANV-KPI)比非融合对应物更具活性，而且拥有更高的体内抗凝血活性（Chen等，2005)。由 于ANV对PS和磷脂酰乙醇胺（PE)具有强亲和力，假设融合蛋白ANV-KPI能特异性靶向至血 栓形成（thrombogenesis)位置处存在的富含PS/PE的阴离子膜结合的凝固酶复合物。类似 地，Dong等报告了融合血纤蛋白选择性吸血蝠 （Desmodus rotundus)唾液PAa l(dsPAa 1) 与尿激酶（uPA)/抗P-选择蛋白抗体（HuSZ51)以生成完全功能性的融合蛋白，在体外测定 法中具有与非融合对应物相似的抗凝血活性。此外，显示了融合蛋白HuSZ51-dsPAa 1结合 凝血酶激活的人和犬血小板（Dong等，Thromb. Haemost. 92:956-965, 2004)。
[0007] 已经在靶向抗凝血剂中进行了其它努力以阻止凝块和降低与血栓性疾病 有关的死亡率（参见例如 W094/09034)。Stoll 等（Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 27:1206-1212, 2007)表明了新近的开发，其中经由抗LIBS单链抗体（scFv抗LIBS)将 凝血因子Xa(FXa)抑制剂，即蜱抗凝血肽（TAP)靶向至GPIIb/IIIa(即一种在血小板表面 上丰富表达的糖蛋白）上的配体诱导的结合位点。显示了融合蛋白s CFvauBS-TAP即使在 非靶向性对应物失效（fail)的低浓度也拥有有效的抗凝活性。
[0008] 上述靶向性抗凝血剂是设计用于靶向特定细胞的融合蛋白。依照Stoll等，靶向 性抗凝血剂应当是具有在与抗体融合时得到保留的高度有力的凝固抑制活性的小分子。不 讨论抗凝血剂自其靶定位置中的融合蛋白的释放。
[0009] 本发明聚焦于用于治疗血液学疾病诸如血友病的靶向性治疗性蛋白质。例如，用 FVIII浓缩物或重组FVIII对血友病A患者的当前治疗受到这些因子的高成本和其相对较 短的作用持续时间的限制。目前，通过在需要时静脉内施用FVIII或者作为一周数次施用 的预防性疗法来治疗血友病A患者。对于预防性处理，一周三次施用FVIII。不幸地，此频 率对于许多患者而言是成本昂贵的（cost prohibitive)。由于其在人中的短半衰期，必须 频繁施用FVIII。尽管其在全长蛋白质上大于300kD的较大大小，FVIII具有仅约11-18(平 均14)小时的人中半衰期（Gruppo等，Haemophila9:251_260, 2003)。对于那些能负担得起 所推荐的频繁剂量给药的人，然而频繁地静脉内注射蛋白质是非常不方便的。对于患者而 言会更方便的是，若可以开发出具有较长的半衰期，因此需要频率较少的施用的FVIII产 品。此外，若半衰期得到延长，则可以降低治疗成本，这是因为那样可需要较少的剂量。因 此，想要具有更有效形式的FVIII，其能降低有效剂量或者具有延长的作用持续时间以显著 改善血友病患者的治疗选项。
[0010] 还有，靶向性FVIII的持续血浆浓度可以通过降低FVIII的谷至峰水平，如此消除 需要在早期时间点时引入超生理学水平的蛋白质，从而降低不利副作用的程度。因此，想要 具有如下的FVIII形式，其具有持续不变的持续时间和比目前销售的形式更长的半衰期。
[0011] 目前疗法的别的缺点是约25-30%的患者形成抑制FVIII活性的抗体（Saenko 等，Haem〇philia8:1-11，2002)。抗体形成阻止FVIII作为代替疗法使用，迫使这组患者寻 找甚至更昂贵的用高剂量重组凝血因子VIIa(FVIIa)的治疗和免疫耐受性疗法。因此，较 小免疫原性的FVIII代替产品是想要的。
[0012] 一种为血友病患者改善治疗的办法牵涉基因疗法。通过在血小板中指导FVIII 表达来将FVIII异位靶向至血小板在治疗血友病A中可以具有治疗效果（Shi等，J. Clin. Invest. 116(7):1974-1982, 2006)。
[0013] 本发明的目标是提供靶向性凝固因子，其与非靶向性蛋白质相比具有延长的作用 持续时间、更大的功效、更少的副作用、和更小的免疫原性。
[0014] 本发明的另一个目标是降低与治疗性蛋白质施用有关的副作用，其通过让蛋白质 靶向至期望作用的特定位置，并且由此降低蛋白质暴露于可导致不想要副作用的其它潜在 生物学活性位点来实现。
[0015] 本发明的进一步的目标是获得别的优点，其通过设计靶向性治疗性凝固因子来实 现，其中治疗性蛋白质在紧邻其体内作用位置处自靶向域释放。可以达到高局部浓度的非 融合、激活的蛋白质。如此，增强蛋白质的治疗功效。
[0016] 本发明还涉及
[〇〇17] 1. 一种靶向性凝固因子，其包含与至少一个特异性结合血细胞上的膜蛋白质的域 连接的凝固因子。
[0018] 2.项1的靶向性凝固因子，其中所述凝固因子是功能性FVIII多肽或FIX。
[0019] 3.项1的靶向性凝固因子，其中所述域是抗体片段、肽、肽模拟物、或小分子。
[0020] 4.项1的靶向性凝固因子，其中所述血细胞是血小板，而所述膜蛋白质是GPIIb/ Ilia。
[0021] 5.项4的靶向性凝固因子，其中所述凝固因子是功能性FVIII多肽。
[0022] 6.项4的靶向性凝固因子，其中所述域是RGD肽或抗GPIIb/IIIa抗体的单链片 段。
[0023] 7.项1的靶向性凝固因子，其中所述凝固因子是功能性FVIII多肽，而所述域是与 所述FVIII的B域连接的抗体片段、肽、肽模拟物、或小分子。
[0024] 8.项7的靶向性凝固因子，其中所述血细胞是血小板，而所述域是R⑶肽或抗 GPIIb/IIIa抗体的单链片段。
[0025] 9. -种药物组合物，其包含治疗有效量的项1的靶向性凝固因子和药学可接受赋 形剂或载体。
[0026] 10. -种用于治疗血液学疾病的方法，包括对有所需要的患者施用有效量的项1 的靶向性凝固因子。
[0027] 11. -种用于将凝固因子靶向至血细胞表面的方法，包括连接所述凝固因子与至 少一种结合血细胞上的膜蛋白质的域。
[0028] 12.项11的方法，其中所述凝固因子是功能性FVIII多肽或FIX。
[0029] 13.项11的方法，其中所述血细胞是血小板或红细胞。
[0030] 14.项11的方法，其中所述域是抗体片段、肽、肽模拟物、或小分子。
[0031] 15.项11的方法，其中所述血细胞是血小板，而所述膜蛋白质是GPIIb/IIIa。
[0032] 16.项15的方法，其中所述凝固因子是功能性FVIII多肽。
[0033] 17.项15的方法，其中所述域是RGD肽或抗GPIIb/IIIa抗体的单链片段。
[0034] 18.项11的方法，其中所述凝固因子是FVIII，而所述域是与所述FVIII的B域连 接的抗体片段、肽、肽模拟物、或小分子。
[0035] 19.项18的方法，其中所述血细胞是血小板，而所述域是R⑶肽或抗GPIIb/IIIa 抗体的单链片段。
[0036] 20.项11的方法，其中进一步从所述血细胞的表面释放所述凝固因子。
[0037] 发明概述
[0038] 依照本发明的靶向性凝固因子包含与至少一个特异性结合血细胞上的膜蛋白质 的域连接的凝固因子。还提供了包含新公开的靶向性凝固因子的药物组合物和使用靶向性 凝固因子来治疗血液学疾病的方法。本发明进一步提供了一种通过使用新公开的靶向性凝 固因子来将凝固因子靶向至血细胞表面以提高用凝固因子治疗血液学疾病的效率的方法。
[0039] 附图简述
[0040] 图1:全长？￥111("全长？￥111)和8域缺失型？￥111(^111-800-了0"）（其中 将靶向域（"TD"）插入B域中，并除去大部分的B域）的示意图。
[0041] 图2 :经由B域半胱氨酸连接FVIII的经修饰的环肽Integrilin，即"BHRF-1"(A) 和"BHRF-3"⑶的结构。
[0042] 图3 :BHRF-1和BFRH-3对固定化GPIIa/IIIb的结合亲和力。
[0043] 图4 :对固定化GPIIa/IIIb的BHRF-1-FVIII结合测定法。
[0044] 图5 :与FVIII比较的BHRF-l-FVIII的体外凝固活性。
[0045] 图6 :BHRF-1-FVIII对人血小板的体外结合。
[0046] 图7 :BHRF-1-FVIII对小鼠血小板的体外结合。
[0047] 发明详述
[0048] 本发明涉及将凝固因子靶向至其作用的一个或多个位置，诸如血细胞。在一个实 施方案中，提供了靶向性凝固因子，其经由连接所述因子与至少一个结合血细胞上的膜蛋 白质的域来特异性靶向至血细胞。用于将凝固因子靶向至血细胞的域可以不限于对血细胞 表面上的膜蛋白质具有高亲和力的抗体片段、抗体、肽、受体配体、碳水化合物、或小分子。 例如，血细胞是红细胞或血小板。
[0049] 如本文中所使用的，"凝固因子"指牵涉凝固级联并主要具有促凝血活性的蛋白 质。凝固因子是本领域中公知的，并且包括但不限于凝固因子I、II、V、VI、VII、VIII、IX、 父、乂1、乂11、和乂111，及蛋白5。凝固因子可以从血浆浓缩或者可以重组生成。若重组生成， 凝固因子可以具有与天然结构不同的氨基酸结构，只要维持足够的促凝血活性，使得变体 是治疗有用的。在一个实施方案中，凝固因子是功能性FVIII多肽诸如但不限于来自血浆 的FVIII浓缩物或重组生成的FVIII，或凝血因子IX(FIX)。
[0050] 如本文中所使用的，"功能性FVIII多肽"意为能够在体内或在体外改正例如以血 友病A表征的人FVIII缺乏的功能性多肽或多肽组合。FVIII在自然状态中具有多种降解 或加工形式。这些是以蛋白水解方式自前体，即单链蛋白质衍生的。功能性FVIII多肽包 括此类单链蛋白质，而且还提供了这些各种降解产物，它们具有改正人FVIII缺乏的生物 学活性。可能存在等位变异。功能性FVIII多肽包括产生FVIII衍生物的所有此类等位 变异、糖基化型式、修饰和片段，只要它们含有人FVIII的功能区段和本质的、特征性的人 FVIII功能活性。可以容易地通过本文中所描述的直接体外测试来鉴定那些拥有必要功能 活性的FVIII衍生物。此外，功能性FVIII多肽能够在存在凝血因子IXa(FIXa)、钙、和磷 脂的情况中催化凝血因子X(FX)转化为FXa，以及改正自血友病A受累个体衍生的血浆中 的凝固缺陷。从人FVIII氨基酸序列的公开序列和关于其功能区的公开信息看，可以经由 对DNA的限制酶切割或对人FVIII蛋白的蛋白水解或其它降解衍生的片段对于本领域技术 人员会是显而易见的。功能性FVIII多肽内明确包括但不限于全长人FVIII (例如SEQ ID NO: 1 和 SEQ ID NO: 2)和 B 域缺失型凝血因子 VIII (例如 SEQ ID NO: 3 和 SEQ ID NO:4)， 而且具有如W02006/053299中所披露的氨基酸序列。
[0051] FVIII的"促凝血活性"指FVIII在凝固级联中的活性。FVIII自身不引起凝固，但 是在凝固级联中发挥至关重要的作用。FVIII在凝固中的作用是要被激活为FVIIIa，其是一 种用于固有 FX 激活的催化性辅因子（Thompson, Semin. Thromb. Hemost. 29:11-22, 2003)。 FVIII是由凝血酶或FXa以蛋白水解方式激活的，所述凝血酶或FXa将其与冯维勒布兰德因 子（von Willebrand factor，vWf)解离，并激活其在级联中的促凝血功能。在其活性形式 中，FVIIIa在血液凝固的固有途径中发挥FX激活酶复合物的辅因子的功能，并且其在血友 病A患者中是降低的或非功能性的。
[0052] "FIX"指凝固因子IX，其又称为人凝固因子IX，或血浆促凝血酶原激酶成分。
[0053] 如本文中所使用的，术语"靶向性凝固因子"指与至少一个特异性结合血细胞上的 膜蛋白质的域偶联的凝固因子。靶向性凝固因子应当有力地结合血细胞，例如以小于ΙΟηΜ 的半最大结合。结合对于靶定的血细胞应当是特异性的，例如经由结合靶定细胞上选择性 表达的膜蛋白质来实现。如本文中所使用的，"域"或"靶向域"指对靶细胞上的膜蛋白质具 有高亲和力的模块。适合于本发明的域包括但不限于对血细胞表面上的膜蛋白质具有高亲 和力的抗体、抗体片段诸如单链抗体（svFv)或FAB片段、抗体模拟物、和肽或小分子。在一 方面，使用单链抗体片段或肽，因为其编码序列可以与FVIII编码序列连接，而且可以使用 重组技术来生成融合蛋白。
[0054] 可以以化学法或通过重组表达融合蛋白来将凝固因子与所述域偶联。可以通过将 凝固因子上存在的化学模块与靶向域连接在一起来实现化学连接，包括使用诸如氨基、羧 基、巯基、羟基基团、和碳水化合物基团等模块的化学连接。可以使用多种同和异双功能接 头，它们具有活化的，或者可以活化以连接附着这些模块的基团。接头分子上的一些有用的 反应基团包括马来酰亚胺、N-羟基-琥珀酰胺酯和酰肼。可以使用许多不同化学组成和长 度的不同间隔物来分开这些反应基团，包括例如聚乙二醇（PEG)、脂肪族基团、亚烃基基团、 环亚烷基基团、融合的或连接的芳基基团、长度为1至20个氨基酸或氨基酸类似物的肽和 /或肽基模拟物。例如，可以以如下方式连接所述域与凝固因子，使得在体内功能形式的凝 固因子会自其靶向域释放或者在凝固因子在身体中的生物学活性位置处或附近发生释放。
[0055] 因而，在本发明的一个实施方案中，提供了靶向性凝固因子，其中可以切割或降解 将凝固因子附着至用于将凝固因子靶向至血细胞的域的连接，由此自偶联物释放凝固因 子。
[0056] 可以通过将靶向域连接至凝固因子上在其激活过程期间除去的位点，或者通过使 用以受控方式被血液中的酶降解的接头来实现凝固因子自其偶联物形式（即自靶向性凝 固因子）的释放。例如，可以使用对一般的血液蛋白酶或水解酶易感的糖聚合物或肽。多种 此类技术是本领域中已知的，而且已经用于制备前药。可以将接头进一步工程化改造成在 最需要凝固因子的位置诸如经由外伤触发的炎症或血液凝固的位置处特异性切割。例如， 接头可以对仅在想要的作用位置处所生成的特定蛋白酶，诸如通过炎症过程释放或者通过 血液凝固级联生成的蛋白酶易感。治疗性蛋白质的此选择性释放可以降低副作用的潜力， 并且提高蛋白质在其作用位置的效率。
[〇〇57] 依照本发明，可以靶向血细胞上的多种膜蛋白质。为了特异性且有效地将凝固因 子靶向至血细胞，然而，优选的是，靶定的膜蛋白质丰富地存在于血细胞表面上。例如，发现 糖蛋白GPIIb/IIIa是血小板表面上最丰富表达的分子之一。
[0058] 因而，在一个实施方案中，经由特异性结合血小板膜蛋白质诸如糖蛋白GPIIb/ Ilia的域将凝固因子靶向至血小板。此类将凝固因子靶向至GPIIb/IIIa的域的例子包括 但不限于含有RGD的肽和模拟物（线性肽、蛇毒肽、和环肽）诸如含有RGD模拟序列（即高 精氨酸、甘氨酸天冬氨酸）的Integrilin9、非肽RGD模拟物、和抗GPIIb/IIIa抗体。若使 用抗体作为靶向域，则可以使用抗体的单链片段，诸如svFv或FAB片段。
[0059] 靶向 FVIII 和 FIX
[0060] 将FVIII和FIX靶向至血细胞诸如血小板或红细胞的表面可以用来减缓这些凝 固因子的清除。将FVIII靶向至血小板细胞的表面是特别感兴趣的。FVIII是FIX介导的 FX激活中的一种重要的辅因子，所述FIX介导的FX激活主要在凝块位置处积累的激活的 血小板细胞表面上发生。血小板激活触发这些凝固因子结合其表面以形成促进FXa生成的 复合物。血小板具有约9天的平均循环寿命。比较而言，血浆中的FVIII (大部分结合冯维 勒布兰德氏因子）展现出约14小时的半衰期。如此，FVIII对血小板的结合具有极大地延 长分子的循环时间的潜力。经由依照本发明的靶向域将FVIII靶向至血小板细胞表面提高 FVIII作用的效率，而且预期延长FVIII的半衰期。
[0061] 在GPIIb/IIIa外，血小板上的其它蛋白质也可以充当靶向性FVIII的受体，诸如 GPla和膜联蛋白V。糖蛋白GPIIb/IIIa是优选的，因为它是血小板表面上最丰富表达的分 子之一。血液中的GPIIb/IIIa浓度估计为约75nM，这基于其在血小板上的表面密度得到。 这表示超过治疗性应用FVIII后达到的FVIII最大浓度（C max约0. 7nM) 100倍。因此，将 FVIII靶向至血小板会占据血小板上可用GPIIb/IIIa位点的大约1 %或更小。预期此低水 平的占据不会改变血小板功能，这要求封闭很大分数（即大于50-60%)的GPIIb/IIIa分 子。高浓度的GPIIb/IIIa还会驱动靶向性FVIII对血小板表面的平衡结合。
[0062] 不以任何方式限制本发明，认为将FVIII靶向至GPIIb/IIIa还可以具有如下的益 处，即一些凝固因子可以通过经由血小板的开放管内系统（openintracanicular system) 胞吞和再循环GPIIb/IIIa而内在化。这种FVIII可以在alpha颗粒中停止（end up)，并在 血小板激活后再释放，在其为凝固所需要时提供FVIII源。可以保护靶向至血小板的结合 的或内在化的FVIII免于存在于许多患者中的抑制剂（例如FVIII抗体）。如此，靶向性 FVIII可以为重要的这组患者提供治疗选项。
[0063] 对于促进凝固的靶向性FVIII，该分子必须能够被加工为功能形式（FVIIIa)，并 自其GPIIb/IIIa结合位点释放。在一个实施方案中，这通过连接GPIIb/IIIa靶向域与 FVIII的B域来实现。在促凝血环境中通过凝血酶或FXa介导的蛋白酶解来除去B域，生成 成熟的FVIIIa分子。如此，激活后，FVIIIa会自GPIIb/IIIa释放，而且可用于形成FX激 活复合物。
[0064] 可以通过使用本文中所描述的交联方法来共价结合靶向域与FVIII上的反应基 团（包括氨基、巯基、羧基基团和羰基基团），从而实现FVIII与靶向域之间的连接。还可以 将靶向域与主要存在于FVIII分子的B域上的碳水化合物偶联。例如，用高碘酸盐轻度氧化 FVIII在碳水化合物链上生成醛，其然后能与胺或酰肼起反应，接着任选地进行还原以形成 更稳定的连接。
[0065] 可以经由用三（2-羧乙基）膦（TCEP)的轻度还原在重组FVIII的B域上选择性生 成游离的半胱氨酸，这容许B域与靶向域的特异性连接，所述靶向域与游离的半胱氨酸起 反应，诸如含有硫醇、三氟甲烧磺酸基（triflate)、三氟乙基磺酸基（tresylate)、氮丙陡 (aziridine)、环氧乙烧、S-批陡基、或马来酰亚胺模块的域。此外，可以修饰FVIII以用半 胱氨酸替换氨基酸残基，从而为附着至靶向域提供特定位置。若使用B域缺失型FVIII，则 可以使用多种B域缺失型FVIII半胱氨酸突变蛋白（诸如那些披露于W02006/053299的） 来经由表面半胱氨酸残基处的化学结合连接FVIII与靶向域。可以进行修饰以用半胱氨 酸替换氨基酸残基的氨基酸残基的例子包括但不限于81、129、377、378、468、487、491、504、 556、570、1648、1795、1796、1803、1804、1808、1810、1864、1911、2091、2118、和 2284(氨基酸 残基以其在全长FVIII序列中的位置指明）。
[0066] 也可以使用重组技术将凝固因子与靶向域偶联。可以用包含FVIII和靶向域的融 合蛋白的载体转染宿主细胞。在一个实施方案中，可以将靶向域插入FVIII的B域中，并删 除大部分B域，其中仅在羧基和氨基端处留下B域的部分以容许对B域的生物学加工，从而 将其自全长分子删除。如图1中所显示的，规定B域的剩余部分，其容许在生理学条件下生 物学加工并除去B域。
[〇〇67] 宿主细胞系可以是本领域技术人员已知为可用于生成凝固因子的任何细胞，对于 FVIII诸如但不限于CH0细胞、HEK细胞、BHK细胞、和HKB11细胞（人胚肾细胞系HEK293 和人Burkitt B细胞淋巴瘤系2B8的杂合物）。
[0068] 许多域可以以化学法连接至FVIII，或者与FVIII -起重组表达，从而将FVIII靶 向至血小板表面上的GPIIb/IIIa。此类域的例子包括但不限于针对GPIIb/IIIa的抗体、靶 向GPIIb/IIIa的RGD肽、肽模拟物、或小分子模拟物。抗体诸如靶向GPIIb/IIIa的单链抗 体（svFv)或FAB片段特别可用作祀向域。
[0069] 已经显示了可以在不丧失FVIII功能的情况中除去FVIII的B域。另外，还已 经显示了各种B域截短形式的FVIII和B域与其它蛋白质域的融合物可以产生功能活性 FVIII。在一方面，本发明牵涉可以进行工程化改造以插入、替换、或部分替换FVIII的B 域而不阻断分子产生活性FVIII的正常加工的靶向域。例如，使用重组DNA技术，可以生 成FVIII分子，其中将单链抗体片段融合至FVIII B域的C端。或者，也可以使用svFv 片段来替换整个或部分的FVIII B域。这可以经由在B域编码序列后以符合读码框方式 插入编码svFv片段的DNA序列，或者替换一些或整个B域编码序列来实现。此策略会保 存FVIII的正常蛋白水解激活所要求的凝血酶切割位点。多种有效定位至血小板的针 对 GPIIb/IIIa 的抗体是已知的（参见例如 Schwarz 等，Circ. Res. 99(1) :25-33, 2006 ; Jacobin 等，Clin. Immunol. 108(3):199-210, 2003 ;Christopoulos 等，Blood Coagul. Fibrinolysis4 (5) : 729-37, 1993 ;及 Chung 等，FASEB J. 18 (2) : 361-363, 2004)。
[0070] 同样地，含有RGD或RGD模拟物的肽也是对于靶向FVIII有用的配体，因为许多此 类肽已经描述为具有对GPIIb/IIIa的高结合亲和力。这些包括线性肽、蛇毒肽、和环肽。也 可以使用非肽RGD模拟物。与抗体片段类似，可以以化学法将RGD肽与FVIII偶联。或者， 可以使用重组DNA技术将RGD序列插入B域编码序列中或者用于完全或部分替换FVIII的 B域编码序列并表达。
[0071] 可以使用类似的方法来制备靶向性FIX。例如，可以将靶向域连接至FIX分子的激 活域（氨基酸残基191-226或145-180,这取决于偏爱，即+/-信号序列），其在将FIX激活 为FIXa中以蛋白水解方式除去。域可以使用与氨基酸侧链基团诸如激活域中的巯基、胺、 和羧基基团反应性的交联剂来化学连接，或者经由碳水化合物链来连接，如上文针对FVIII 所讨论的。也可以使用重组技术（其中将靶向域的氨基酸序列插入FIX激活肽中），或者替 换激活肽序列的一部分来生成融合分子。插入的靶向域序列可以编码单链抗体，或者其它 血小板结合肽序列，诸如R⑶结合肽。
[0072] 药物组合物和用途
[0073] 本发明还涉及包含治疗有效量的本发明的靶向性凝固因子和药学可接受赋形剂 或载体的药物组合物。"药学可接受赋形剂或载体"是可以添加至活性成分以帮助配制或稳 定制剂，而且不对患者引起显著不利毒物学效果的物质。此类赋形剂或载体的例子是本领 域技术人员公知的，包括水、糖诸如麦芽糖或蔗糖、清蛋白、盐等。其它赋形剂或载体记载于 例如 Remington, s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. , Easton, Pa.,第 20 版，2000)。此类组合物会含有有效量的靶向性凝固因子以及合适量的赋形剂或载体以制备 适合于对有所需要的患者有效施用的药学可接受组合物。
[0074] 例如，可以以可随出血事件的严重性而变化的剂量对罹患血友病A的受试者胃肠 内施用偶联物。静脉内施用的平均剂量范围为对于手术前适应症为每千克40个单位、对于 微小出血为每千克15至20个单位、和对于维持剂量为8小时期间里施用的每千克20至40 个单位。
[0075] 在一个实施方案中，本发明涉及一种用于治疗血液学疾病的方法，包括对有所需 要的患者施用治疗有效量的上述靶向性凝固因子。
[0076] 如本文中所使用的，"治疗有效量"指在血流或靶组织中提供想要水平的靶向性因 子（或自靶向性形式释放的相应的非偶联因子）所需要的靶向性凝固因子量。精确量会取 决于许多因素，包括但不限于治疗性组合物的成分和物理特征、预期的患者群体、个体患者 考虑因素等，而且本领域技术人员可以容易地确定。
[0077] 如本文中所使用的，"患者"指接受医学护理和/或治疗的人或动物个体。
[0078] 本文中所描述的多肽、材料、组合物、和方法意图是本发明的代表性例子，并且要 理解的是，本发明的范围不受例子范围的限制。本领域技术人员会认可，本发明可以用所公 开多肽、材料、组合物和方法的变型实施，并且认为此类变型在本发明的范围内。
[0079] 呈现以下实施例来例示本文中所描述的发明，但是不应以任何方式解释为限制本 发明的范围。 实施例
[0080] 为了本发明可以得到更好的理解，列出了以下实施例。这些实施例仅出于例示目 的，并且不要以任何方式解释为限制本发明的范围。通过提及而完整收录本文中所提及的 所有出版物。
[0081] 实施例1 :对GPIIb/IIIa结合具有高亲和力的经修饰的RGD肽
[0082] 已经描述了环肽有力地且选择性地结合GPIIb/IIIa。使用一种此类肽，即 Integrilin作为祀向域以与FVIII连接，因为已经显示了 Integrilin能选择性结合 GPIIb/IIIa。通过在马来酰亚胺模块中添加能选择性与蛋白质中游离的半胱氨酸残基 偶联的短PEG接头末端来修饰Integri 1 in。经修饰的Integri 1 in称作仅具有接头的 BHRF-1 (图2A)，和具有接头和荧光素（FITC)的BHRF-3(图2B)。如图3中所显示的，经修 饰的Integrilin保留对GPIIb/IIIa的亲和力，因为它们有力地阻断血纤蛋白原（Fbn)结 合固定化的GPIIa/IIIb。
[0083] 使用固相结合测定法来测量肽对GPIIb-IIIa的结合，其中测量测试化合 物竞争血纤蛋白原结合。如下实施测定法。以O.mL/孔Uyg/mU缓冲液A(20mM Tris ρΗ7· 5、0· 15M NaCl、和 ImM 各种 MgCl2、CaCl2、和 MnCl2)中稀释的）将纯化的 GPIIb-IIIa(Innovative Research，Novi，MI)包被至 96 孔 Immulon-B 板上。于 4°C温育过 夜后，用缓冲液8(50禮1^8?!17.5、0.1]\1似(：1、和各111111%(：1 2、〇3(：12、和]\111(：12)中的3.5% BSA将平板于30°C封闭1小时。用缓冲液B清洗3次后，将稀释的肽或蛋白质溶液与0. 1 % BSA/缓冲液B中的3. 5nM生物素化的血纤蛋白原组合，并添加至孔，于30°C温育2小时。 清洗（3次，缓冲液B)后，于30°C添加1:4000链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶（HRP) (Pierce Chemical Co.，Rockford, IL)达1小时。最终的清洗步骤（3次，缓冲液B)后，用 Ultra TMB(3, 3'，5, 5'-四苯基联苯胺）（Pierce Chemical Co.，Rockford, IL)将平板显影 5分钟，用等体积的2M硫酸停止。于450nm读取平板吸光度，并使用4参数Logistic拟合 来测定IC 5(I值。
[0084] 然后，经由位于FVIII的B域中的半胱氨酸（Cys)残基来将经修饰的Integrilin 肽（BHRF1)与 FVIII 偶联。
[0085] 实施例2 :偶联GPIIb/IIIa结合肽与FVIII
[0086] 全长FVIII的多肽序列是本领域中已知的（参见例如SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、 和如W02006/053299中所披露的）。
[0087] FVIII的浓缩和游离巯基基团的脱帽
[0088] 可以在蛋白质表达过程中通过培养基中存在的半胱氨酸来为位于重组FVIII的B 域中的Cys残基加帽，但是它容易如下通过还原剂诸如TCEP的处理来除去。将FVIII (20mL) 融化，并在于2000x g (约3153rpm)在低温（cold)中旋转25分钟的两个·Αη--(：〇η?-15筒 (Millipore，Billerica，MA)中浓缩。2. 8mL保留物的浓度是约0. 8-0. 9mg/mL，其通过使用 Nano'Drop? 分光光度计（ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)的 A280 得到。然后使用 10mL Zeba脱盐筒来交换缓冲液，所述10mL Zeba脱盐筒用50mM Tris、150mM NaCl、2.5mM 〇8(：12和10(^口1117\￥6611方>-80(聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯）预平衡。获得具有0.8811^/ mL浓度的2. 8mL蛋白质溶液。然后将TCEP添加至终浓度0. 68mM，并于4°C将混合物温和地 颠转约3小时。通过两次连续的Zeba筒旋转来除去TCEP，并容许FVIII再次氧化至少30 分钟，之后添加肽。除去TCEP后，FVIII浓度测量为0· 768mg/mL( "KG-R"）。
[0089] R⑶靶向肽的偶联
[0090] 为 了将经修饰的 Integrilin 肽 BHRF-1 偶联至 FVIII，将 0· 294mg 肽（M. W. 1225) 添加至48yL干的二甲亚砜（DMS0)以制备5mM储备溶液。然后将此储备溶液（34.4UL) 添加至2. 8mL KG-R。80分钟后，通过添加等摩尔量的半胱氨酸来淬灭反应。然后针对起始 Tris缓冲液（2升）广泛透析反应混合物。BHRF-1-FVIII的终浓度是0. 74mg/mL，而产量是 2mg。也使用类似的方法来制备BHRF-3-FVIII。
[0091] 如图3中所显示的，经修饰的Integrilin肽，S卩BHRF-1和BHRF-3保留对GPIIb/ Ilia的亲和力，因为它们有力地阻断血纤蛋白原（Fbn)结合固定化的GPIIa/IIIb。与 BHRF-1偶联的FVIII (FVIII-BHRF-1)显示在抑制血纤蛋白原结合固定化的GPIIb/IIIa上 的高效力（IC5Q = 0· 043+/-0. 05nM(N = 3))。这甚至比亲本BHRF-1肽更有力。表1中显 示了结果。
[0092] 表 1
【权利要求】
1. 一种靶向性凝固因子，其包含与至少一个特异性结合血细胞上的膜蛋白质的域连接 的凝固因子。
2. 权利要求1的靶向性凝固因子，其中所述凝固因子是功能性FVIII多肽或FIX;和/ 或其中所述域是抗体片段、肽、肽模拟物、或小分子；和/或其中所述血细胞是血小板，而所 述膜蛋白质是GPIIb/IIIa ;和或其中所述凝固因子是功能性FVIII多肽；和/或其中所述 域是RGD肽或抗GPIIb/IIIa抗体的单链片段。
3. 权利要求1的靶向性凝固因子，其中所述凝固因子是功能性FVIII多肽，而所述域是 与所述FVIII的B域连接的抗体片段、肽、肽模拟物、或小分子。
4. 权利要求3的靶向性凝固因子，其中所述血细胞是血小板，而所述域是R⑶肽或抗 GPIIb/IIIa抗体的单链片段。
5. -种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1的靶向性凝固因子和药学可接受 赋形剂或载体。
6. -种用于治疗血液学疾病的方法，包括对有所需要的患者施用有效量的权利要求1 的靶向性凝固因子。
7. -种用于将凝固因子靶向至血细胞表面的方法，包括连接所述凝固因子与至少一种 结合血细胞上的膜蛋白质的域。
8. 权利要求7的方法，其中所述凝固因子是功能性FVIII多肽或FIX ;和/或其中所述 血细胞是血小板或红细胞；和/或其中所述域是抗体片段、肽、肽模拟物、或小分子；和/或 其中所述血细胞是血小板，而所述膜蛋白质是GPIIb/IIIa ;和/或其中所述凝固因子是功 能性FVIII多肽；和/或其中所述域是RGD肽或抗GPIIb/IIIa抗体的单链片段，和/或其 中进一步从所述血细胞的表面释放所述凝固因子。
9. 权利要求7的方法，其中所述凝固因子是FVIII，而所述域是与所述FVIII的B域连 接的抗体片段、肽、肽模拟物、或小分子。
10. 权利要求9的方法，其中所述血细胞是血小板，而所述域是R⑶肽或抗GPIIb/IIIa 抗体的单链片段。
【文档编号】C07K19/00GK104059155SQ201410228024
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2009年5月15日 优先权日:2008年5月16日
【发明者】理查德.费尔德曼, 吉-扬.金, 蒋海英, 柯克.麦克莱恩, 潘峻亮, 格伦.皮尔斯, 伍国鸿, 赵晓燕 申请人:拜耳医药保健有限公司