专利名称：治疗过表达原癌基因neu/erbB2恶性肿瘤的重组腺病毒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗过表达原癌基因neu/erbB2肿瘤的共表达人源性单抗和Mda-7的重组腺病毒构建，其所在的技术领域与生命科学和生物医药技术有关。
背景技术：
·研究表明原癌基因neu/erbB2是多种恶性肿瘤的一个重要标记基因，其产物又称为恶蛋白，约30％的乳腺癌患者和其它肿瘤部份患者，如卵巢癌、肺癌和胃癌，该基因neu/erbB2都处于高表达状态，是这些肿瘤恶化和远处转移的重要原因之一。国外巳成功开发针对此原癌基因neu/erbB2的人源化单克隆抗体。经美国FDA批准上市和多年临床应用，表明此治疗性人源化单抗对高表达原癌基因neu/erbB2的恶性乳腺癌具有很好的治疗效果，取得满意临床效果(Carter P，et alPNAS，1992，4285-4289；Stebbing.J.，et alCancer Treat.Reviews 2000；26287-290)。但是，尽管抗原癌基因neu/erbB2的人源化单克隆抗体已成功用于过表达原癌基因neu/erbB2恶性乳腺癌冶疗，但临床研究表明大多数初期用此抗体有效的转移性乳腺癌患者在一年内将对此抗体治疗产生抗性、15％的患者仍将复发。因此，在冶疗neu/erbB2阳性的乳腺癌时，综合使用其他药物或治疗途径以增强此抗体的疗效，并克服其产生的抗性，是目前正在探索的一种冶疗方法(Tseng PH，et alMol Pharmacol.2006 Nov；70(5)1534-41；Nahta R，et alBreast Cancer Res.2006；8(6)215)。
另一方面，研究也表明应用neu/erbB2的人源化单克隆抗体的单链可变区，既可保留抗体的特异性抗原结合能力，又能增加治疗性抗体的肿瘤渗透性、在肿瘤组织以及血液中滞留时间(Gregory P，et alCancerResearch 1993，534026-4034；Adams GP，et alBrit.J Cancer(1998)77(9)1405-1412)，这为应用单克隆抗体的单链可变区或Fab片段作为治疗性药物奠定了坚实基础。
最近一种经聚乙稀二醇化的肿瘤坏死因子抗体Fab片段巳证实能有效控制类风湿病和慢性结肠炎，并经美国FDA批准建入临床应用。
近年来新发现并应用于临床验证的黑色素细胞分化相关基因(英文名melanoma differentiation associated(mda)genes)，又称白细胞介素-24(缩写IL-24、下同)，属于白细胞介素-10家族的一员。Mda-7/IL-24基因是一个结构上保守的基因，其表达产物是由206个氨基酸组成的一种糖蛋白。能诱导白细胞介素-6、干扰素-γ、肿瘤坏死因子-a、白细胞介素-1β、白细胞介素-12和集落细胞刺激因子表达(Devanand Sarkar，et alPNAS，2005.105(39)14034-14039)，因而具有多重抗肿瘤效应。多种肿瘤动物模型实验研究证明该基因具有区分正常细胞和癌细胞的能力、能诱导肿瘤细胞凋亡功能以及抑制肿瘤血管形成和肿瘤生长、调节机体免疫反应的能力、并使肿瘤细胞对化学药、生物制剂和放射线治疗更为敏感和协同冶疗作用，而更重要的是对正常细胞没有明显毒性作用。Mda-7被认为是一种特异性肿瘤凋亡因子，具有双重作用的细胞因子，其正常生理功能可能与免疫系统的有关，而其过表达则致特异性肿瘤细胞凋亡(Fisher PB，et alCancerBiol Ther.2003 Jul-Aug；2(4 Suppl 1)S23-37；Fisher PBet alCurr GeneTher.2006 Feb；6(1)73-91；Gupta P，et alPharmacol Ther.2006Sep；111(3)596-628.Epub 2006 Feb 7)。目前在国外临床验证疗效令人满意。在晚期腺癌患者的临床I期和II期验证中表明是安全的和耐受良好的，一次瘤内注射可致大多数肿瘤细胞凋亡。
国外临床研究证明治疗恶性乳腺癌的人源化单抗结合应用Mda-7/IL-24的治疗效果显著优于单用人源化单抗、或结合化疗的效果，甚至远处转移的肿瘤都消失(Bocangel D，et alCancer Gene Ther.2006Oct；13(10)958-68)。
基于上述的研究和临床研究，构建一种共表达neu/erbB2原癌基因人源化单抗可变区和Mda-7/IL-24的重组腺病毒，以便更有效的治疗过表达原癌基因neu/erbB2肿瘤将是可行的。
发明内容
本发明的目的是构建构建一种共表达neu/erbB2原癌基因人源化单抗可变区和Mda-7/IL-24的重组腺病毒以及利用其表达产物治疗如本说明书中所描述的过表达原癌基因neu/erbB2肿瘤，如卵巢癌、肺癌和胃癌等。本发明的共表达neu/erbB2原癌基因人源化单抗可变区和Mda-7/IL-24的重组腺病毒的表达结构，其主要特征为1).应用的抗neu/erbB2原癌基因的抗体为其人源化单抗可变区；2).人源化单抗可变区的N-末端连接着人白细胞介素-2N-末端的20个氨基酸构成的分泌肽；3).Mda-7/IL-24为206个氨基酸组成全长基因片段，其中第72位氨基酸Ala转换为Val；4).人源化单抗可变区片段和Mda-7/IL-24基因通过内部核糖体结合位点(IRES)片段相连接；5).Mda-7/IL-24基因共表达人源化单抗可变区和Mda-7/IL-24的表达盒由CMV启动子、人源化单抗可变区片段、内部核糖体结合位点(IRES)片段、Mda-7/IL-24基因和SV40多聚腺嘌呤序列构成；
附图1原癌基因neu/erbB2人源化单抗scFv克隆第一道为DNA分子量标记物，第二泳道为的EcoR1酶切结果，箭头所指为原癌基因neu/erbB2人源化单抗scFv片段。
附图2SDS-PAGE凝胶分析。原癌基因neu/erbB2人源化单抗scFv基因在原核细胞内的表达。第一道为末诱导菌体总蛋白；第二道和第三道分别为1小时和第三小时诱导菌体总蛋白，箭头所指为scFv表达产物。
附图3Mda-7基因的克隆及酶切电泳分析经RT-PCR反应，克隆Mda-7基因于T-Easy载体。此为EcoR1酶切消化结果，第一、第二泳道为DNA分子量标记物，第三泳道为Mda-7的EcoR1酶切结果，产生二个片段。箭头所指为Mda-7基因。
附图4由CMV启动子驱动的表达盒构成图谱此表达盒图谱显示由位于N-未端的CMV启动子、原癌基因neu/erbB2人源化单抗scFv、IRES、Mda-7和SV40多聚腺嘌呤组成，并以不同内切酶位点相连接。
附图5表达由CMV启动子驱动的表达盒的重组腺病毒结构图结构图中两瑞分别为腺病毒的左臂和右臂，表达盒由CMV启动子、原癌基因neu/erbB2人源化单抗scFv、内部核糖体结合位点(IRES，下同)、Mda-7基因和SV40多聚腺苷酸组成。
具体实施例方式
以下的实施例是为了举例说明本发明的内容，而不是以任何方式限制本发明的范围。本发明所用的腺病毒载体为Stratagene公司产品，包括腺病毒穿载体PaDeasy-1。穿梭质粒pShuttle和pShuttle-IRES。
实施例一原癌基因neu/erbB2人源化单抗scFv(下同)基因的克隆过程如下(包括人单克隆抗体的轻链可变区与重链可变区之间连接；新型scFv基因表达质粒的克隆)1).人源化单克隆抗体轻链可变区与重链可变区的连接a.以人源化单克隆抗体cDNA作为模板，用人工合成的引物进行PCR反应。首先扩增抗体轻链可变区，使轻链可变区5’-N未端增加一个Hind111和Nhe1内切酶切点，并拼接上人白细胞介素-2的由20个氨基酸组成的信号肽，其3’-C末端带有Kpn1内切酶切点。此过程经过二次PCR反应完成，即用引物2和引物3进行第一次PCR反应；第二次以第一次反应产物为模板，应用引物1和引物3进行第二次PCR反应，；PCR引物设计如下引物15’-gtaagcttgctagcatgtacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttgt-3’引物25’-actaagtcttgcacttgtcacaaacagtgatatccagatgaccca-3’引物35’-agctgaacctcacttttgatctccaccttggtaccctgtccg-3’其PCR产物经纯化、加腺嘌呤(A Tailling)处理后连于T-easy载体，转化感受态细菌后扩增T-easy质粒并测序确定。
b.同样，使重链可变区5’-N未端含有轻链可变区3’-C末端部份编码序列，该3’-C末端序列包含一个Kpn1内切酶切点，并在重链可变区5’-N未端和轻链可变区3’-C末端之间通过接头(-G-G-G-G-S-)相连接，其3’-C末端增加一个Not1内切酶切点。
PCR引物设计如下引物35’-acagggtaccaaggtggagatcaaaggtggcggtggctcggaggttcagctgg-3’引物45’-ctagcggccgccctacgaggagacggtgaccagggtt-3’其PCR产物经纯化、加腺嘌呤(A Tailling)处理后连接于T-easy载体。转化感受态细菌后，扩增T-easy质粒并测序确定。
c.人源化单克隆抗体轻链可变区与重链可变区的连接用内切酶Nhe1、Kpn1和Kpn1、Not1分别消化上述A和B的T-easy载体，从0.8％琼脂糖上分离、纯化抗体轻链Nhe1-Kpn1片段和重链Kpn1和Not1片段，进行拼接，并转化感受态细菌后，抽取质粒DNA，测序确定。
2).经测序正确后，应用内切酶Nhe1和Not1消化含上述scFv的T-easy载体，获得的片段经纯化处理后，与用内切酶Nhe1和Not1预先消化、纯化后的表达质粒pPET45B进行拼接，形成含人源化单克隆抗体可变区scFv表达质粒pPET45B-scFv。最后转化感受态细菌、质粒扩增后，经测序和酶切证实。
实施例二、Mda-7 DNA片段的人工合成及其克隆根椐巳知基因序列，按常规技术人工合成Mda-7的编码DNA片段，在其5’-末端增加Smal1，在3’-未端增加Xba1酶切位点，并以下述引物进行PCR扩增。
引物15’-agcgggccctatgaattttcaacagaggctgcaaagcctgtgg-3’引物25’-cgacagatctatcagagcttgtagaatttctgcatcc-3’PCR扩增产物经tailing加上腺嘌呤后，连接至T-easy载体，转化细菌后，扩增、抽提、纯化，经DNA测序确定。
实施例三、由CMV启动子、scFv、内部核糖体结合点(IRES)和Mda-7组成的表达盒的构建。本实施例所用的Stratagene公司产品为pShuttle-IRES，以此载体为骨架构建表达盒。通过多次不同的内切酶消化、连接反应、感受态细菌转化和测序证实，完成此表达盒构建。即以5’-末端为Nhe1和3’-末端为Not1内切酶位点的scFv片段，拼接于IRES的上游；以5’-末端为Sma1内切酶位点和3’-末端为Xba1内切酶位点的Mda-7基因片段拼接于SV40多聚腺嘌呤的上游，而位于IRES的下游；至此，此表达盒构建才告完成。
实施例四、构建含此表达盒的腺病毒穿梭质粒1).以内切酶Sal1消化上述含表达盒的pIRES质粒DNA，将产生Sal1一个DNA片段，由此，该表达盒将包含上述整个表达盒和SV40的多聚腺嘌呤DNA序列。消化后，经1.2％琼脂糖电泳分离、纯化所需DNA片段备用。
2).以内切酶Sal1消化pShuttle穿梭载体质粒DNA，经1.2％琼脂糖电泳分离、纯化线性化的pShuttle载体DNA备用。
3).将上述线性化的pShuttle载体DNA片段和消化表达盒产生的Sal1DNA片段，在连接酶作用下进行拼接反应，并转化感受态细菌，培养扩增。
4).筛选细菌转化子，培养扩增，抽取重组质粒DNA，最后再经酶切消化和DNA测序证实。
实施例五、共表达scFv和Mda-7基因的重组腺病毒1).制备线性化含scFv和Mda-7基因表达盒的重组穿梭质粒pShuttle-scFv-Mda-7取适量上述重组穿梭质粒DNA，经核苷酸内切酶Pme1消化、电泳分离、纯化Pme1酶切线性化重组穿梭质粒DNA，备用。
2).将上述线性化重组穿梭质粒DNA电击转化已预转化腺病毒载体pAdEasy-1的BJ5183-AD-1细菌，进行同源重组，并以抗生素卡拉霉素进行筛选。含腺病毒载体pAdEasy-1重组体的细菌将为耐卡拉霉素细株。
3).扩增含腺病毒载体pAdEasy-1重组体的、耐卡拉霉素的细株，即扩增重组腺病毒载体pAdEasy-1 DNA。抽提腺病毒载体pAdEasy-1重组体DNA，用内切酶Pac1消化，线性化腺病毒载体pAdEasy-1重组体DNA，并分离纯化备用。
4).按Stratagene公司关于AdEasy XL Adenoviral Vector System说明手册介绍的方法，将上述纯化备用的线性化腺病毒载体pAdEasy-1重组体DNA转染AD-胚胎肾293细胞。
5).转染AD-胚胎肾293细胞7-10天后，备制原代重组腺病毒母液，并优化原代重组腺病毒母液的感染AD-胚胎肾293细胞的条件，扩增重组腺病毒。
6).扩增足量的高滴定度的重组腺病毒，用于研究和动物试验。
序列表Individual Applicant--------------------Street科学城国际企业孵化器A区610房City广州市State广东省Country中国PostalCode510633PhoneNumber020-32290208FaxNumber020-38491559EmailAddressshangwu_w@yahoo.com<110>LastName王<110>FirstName尚武<110>MiddleInitial<110>SuffixApplication Project-------------------<120>Title治疗过表达原癌基因neu/erbB2恶性肿瘤的重组腺病毒<130>AppFileReference<140>CurrentAppNumber1<141>CurrentFilingDate2006-10-26Sequence--------<210>1<211>784<212>DNA<213>neu/erbB2人源化单抗可变区人工序列<400>1gtaagcttgc tagcatgtac aggatgcaac tcctgtcttg cattgcacta agtcttgcac 60ttgtcacaaa cagtgatatc cagatgaccc agtccccgag ctccctgtcc gcctctgtgg120gcgatagggt caccatcacc tgccgtgcca gtcaggatgt gaatactgct gtagcctggt180atcaacagaa accaggaaaa gctccgaaac tactgattta ctcggcatcc ttcctctact240ctggagtccc ttctcgcttc tctggctcaa gatctgggac ggatttcact ctgaccatca300gcagtctgca gccggaagac ttcgcaactt attactgtca gcaacattat actactcctc360ccacgttcgg acagggtacc aaggtggaga tcaaaggtgg cggtggctcg gaggttcagc420tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg tcctgtgcag480cttctggctt caacattaaa gacacctata tacactgggt gcgtcaggcc ccgggtaagg540gcctgaaatg ggttgcaagg atttatccta cgaatggtta tactagatat gccgatagcg600tcaagggccg tttcactata agcgcagaca catccaaaaa cacagcctac ctgcagatga660acagcctgcg tgctgaggac actgccgtct attattgttc tagatgggga ggggacggct720tctatgctat ggactactgg ggtcaaggaa ccctggtcac cgtctcctcg taggcggccg780caga 784
<210>2<211>252<212>PRT<213>neu/erbB2人源化单抗可变区人工序列<400>2Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala1 5 10 15Leu Val Thr Asn Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser20 25 30Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala35 40 45Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro50 55 60Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr65 70 75Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp80 85 90Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr95 100 105Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln110 105 120Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln125 130 135Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu140 145 150Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr155 160 165Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Val170 175 180Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser185 190 195Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr
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Pro Phe Cys Pro Pro Leu Leu Ala Thr Ala Ser Gln Met Gln Met20 25 30Val Val Leu Pro Cys Leu Gly Phe Thr Leu Leu Leu Trp Ser Gln35 40 45Val Ser Gly Ala Gln Gly Gln Glu Phe His Phe Gly Pro Cys Gln50 55 60Val Lys Gly Val Val Pro Gln Lys Leu Trp Glu Val Phe Trp Ala65 70 75Val Lys Asp Thr Met Gln Ala Gln Asp Asn Ile Thr Ser Ala Arg80 85 90Leu Leu Gln Gln Glu Val Leu Gln Asn Val Ser Asp Ala Glu Ser95 100 105Cys Tyr Leu Val His Thr Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Lys Thr Val110 115 120Phe Lys Asn Tyr His Asn Arg Thr Val Glu Val Arg Thr Leu Lys125 130 135Ser Phe Ser Thr Leu Ala Asn Asn Phe Val Leu Ile Val Ser Gln140 145 150Leu Gln Pro Ser Gln Glu Asn Glu Met Phe Ser Ile Arg Asp Ser155 160 165Ala His Arg Arg Phe Leu Leu Phe Arg Arg Ala Phe Lys Gln Leu170 175 180Asp Val Glu Ala Ala Leu Thr Lys Ala Leu Gly Glu Val Asp Ile185 190 195Leu Leu Thr Trp Met Gln Lys Phe Tyr Lys Leu200 20权利要求
1，一种共表达原癌基因neu/erbB2的人源化单克隆抗体单链可变区和Mda-7的重组腺病毒。本发明使用的腺病毒载体为Stratagene公司的产品AdEasy-1载体，为E1和E3区缺失的腺病毒载体。本发明构建的表达盒由CMV动子、原癌基因neu/erbB2的人源化单克隆抗体单链可变区、内部核糖体结合位点(IRES)片段、Mda-7和SV40多聚腺嘌呤组成，其主要特征为a).原癌基因neu/erbB2的人源化单克隆抗体仅由抗体可变区构成；b).原癌基因neu/erbB2的人源化单克隆抗体可变区序列中，轻链可变区和重链可变区通过氨基酸多肽-G-G-G-G-G-S-(GS1)连结，在其N-末端以内切酶Nhe1和C-末端以内切酶Not1片段拼接于pIRES质粒上游；c).人Mda-7的第72位氨基酸由Ala突变成Val，其他氨基酸组成及其排列顺序不变；d).Mda-7基因在其N-末端以内切酶Smal和C-末端以内切酶Xba 1片段拼接于pIRES质粒下游；经重组后，该表达盒位于腺病毒载体的E1缺失区。该重组腺病毒具有共表达neu/erbB2的人源化单克隆抗体单链可变区和Mda-7的作用，因而具有更强细胞凋亡功能、抗癌谱更广的生物功能。
2.根椐权利要求1，一种CMV启动子驱动共表达二种有协同抗癌作用基因的表达盒，其含有下列氨基酸序列a).与人Mda-7的亲本多肽的氨基酸序列基本一致，仅有一个氨基酸的取代，即此肿瘤抑制基因p53的第72氨基酸由Val(V72)代替野生型Mda-7同一位置的Ala(A72)；b).一种以鼠源抗neu/erbB2原癌基因抗体基因为模板，应用基因突变技术，人工改造成的一种抗neu/erbB2原癌基因的人源化单克隆抗体单链可变区片段；c).内部校核糖体结合位点(IRES)源于脑心肌炎病毒；
3.根椐权利要求1和要求2所述重组腺病毒，其特征在于表达盒中驱动共表达原癌基因neu/erbB2的人源化单克隆抗体可变区和Mda-7基因的启动子序列不仅限于CMV启动子，也包括其他病毒启动子以及某些肿瘤特异性启动子，如鼠源肿瘤特异性PEG-3基因启动子，人端粒酶启动子、雌激素和低氧反应启动子、人前列腺癌特异因子启动和肝胎儿甲型球蛋白启动子(AFP，胎甲球蛋白启动子)。
4.根椐权利要求1，表达盒中共表达的原癌基因neu/erbB2的人源化单克隆抗体可变区既可位于IRES的上游，也可位于其下游；Mda-7亦如此。
5.根椐权利要求1和要求3，由CMV启动子驱动共表达的、位于IRES上游的基因既可是本发明的，也可以是有其他有治疗价值的人源化或全人化单克隆抗体可变区；位于IRES下游的基因既可是Mda-7基因，也可以是其他促细胞凋亡基因，如Noxa、p53RFP和P27(Kip1)；免疫调节因子，如IL-2、IL-6、IFN-γ，粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)和TNF-a等；
6.根椐权利要求1，本发明使用的腺病毒载体为Stratagene公司的产品AdEasy-1载体，为E1和E3区缺失的复制缺陷型腺病毒载体。但本发明使用的腺病毒载体不限于此复制缺陷型Ad5型腺病毒，也包括条件性复制的腺病毒载体，如本人申请的另一专利“一种用于临床肿瘤基因治疗的新型腺病毒载体”所叙述的腺病毒载体。该专利叙述的条件性复制腺病毒载体为一种由肿瘤特异性启动子驱动腺病毒复制因子E1A基因仅在肿瘤细胞内表达，因而具有仅能在肿瘤细胞内复制的能力。而且，其纤维蛋白AB环、H1环和/或Shaft进行了突变，具有感染力更强、感染细胞谱更广的特点。此新型重组腺病毒也可仅表达Mda-7基因。
7.根椐权利要求1，此共表达原癌基因neu/erbB2的人源化单克隆抗体可变区和Mda-7的重组腺病毒为一种用于治疗多种过表达原癌基因neu/erbB2恶性癌症疾病的基因治疗药物，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
8.如权利要求7所述的基因治疗药物，其特征在于，权利要求1所述的为共表达原癌基因neu/erbB2基因可变区和Mda-7基因的重组腺病毒，所述的有效抗癌成份为原癌基因neu/erbB2基因可变区和Mda-7基因的表达蛋白质。
全文摘要
本发明叙述了一种构建表达neu/erbB2原癌基因人源化单抗可变区和Mda－7/IL－24的表达盒结构的重组腺病毒的方法及其用途和意义，其表达盒结构主要特征为1)neu/erbB2原癌基因人源化单抗可变区；2)Mda－7/IL－24为206个氨基酸组成全长基因片段，其中第72位氨基酸Ala转换为Val；3)通过内部核糖体结合位点(IRES)将neu/erbB2原癌基因人源化单抗可变区和Mda－7基因连接；3)该重组腺病毒是复制缺陷型的血清A5型腺病毒。该新型腺病毒具有共表达二种抗癌基因，即neu/erbB2原癌基因人源化单抗可变区和Mda－7基因，其产物具有更强细胞凋亡生物功能，但对正常细胞不会造成损伤。因此，在过表达neu/erbB2原癌基因的恶性肿瘤的基因治疗中将具有重要意义。
文档编号C07K16/18GK101054596SQ20071002736
公开日2007年10月17日 申请日期2007年4月3日 优先权日2007年4月3日
发明者王尚武 申请人:王尚武