本发明属于植物提取技术领域，具体涉及一种杜仲叶有效部位、制备方法及其在制备保护由酒精引起脑神经损伤的食品、保健品以及药物中的新应用。
背景技术：
乙醇滥用是世界范围内严重危害人类健康的问题，引起脑损害、认知缺陷、运动协调功能丧失及相应的心理功能改变。中枢神经系统是乙醇的主要作用靶点，其基因毒性是乙醇中毒性疾病的重要机制之一。目前，已经证明乙醇急性及长期服用对小鼠不同脑区脑细胞DNA不同程度的损伤, 进而造成脑神经细胞坏死和凋亡、炎症等病理变化，最终导致各种脑部疾病，其中对小脑和大脑皮层基因毒性最强。而脑组织对于基因毒性引起的DNA损伤修复能力低，所以，DNA修复系统缺陷导致DNA损伤的积累，最终导致神经变性即神经毒性。因此，寻找新型、有效预防和治疗酒精引起脑损伤的功能性食品、保健品或药物具有重要意义。
杜仲叶（Eucommia folium）为杜仲科杜仲( Eucommia ulmoids Oliv.）的干燥叶，味微辛，温。归肝、肾经。补肝肾，强筋骨，用于肝肾不足，头晕目眩，腰膝酸痛，筋骨痿软。在我国已有2000多年的用药历史，是一种传统的中药材。2005年开始收载于《中国药典》中。大量研究表明：杜仲叶与杜仲皮化学成分，特别是有效成分基本一致，具有相似功效，并且资源更加丰富。其有效成分主要为木脂素类、苯丙素类、酚类、黄酮类、环烯醚萜类、有机酸等成分。现代药理研究发现杜仲叶具有降血压、保肝利尿、强筋骨、抗肿瘤、抗氧化、镇静安胎、抗衰老等功效，目前并无文献有关于杜仲叶保护酒精引起脑神经损伤的报道。
技术实现要素：
本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种杜仲叶有效部位、制备方法及其在制备保护由酒精引起脑神经损伤的食品、保健品以及药物中的新应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种杜仲叶有效部位的制备方法，其包括如下步骤：将粉碎后的杜仲叶用30－80%乙醇超声或散式提取，提取液浓缩后用大孔吸附树脂吸附，然后依次用水洗、20－60%乙醇梯度洗脱，合并梯度洗脱收集的洗脱液，浓缩、干燥后即得到杜仲叶有效部位。
具体的，超声或散式提取2－3次，每次超声或散式提取时每1 g 杜仲叶添加30－80%乙醇8－15mL。
具体的，超声提取时每次20－40min为宜，散式提取时每次3－10min为宜。
大孔吸附树脂选用常规型号即可，大孔吸附树脂型号如可以为HPD100、HPD600、HPD400、D101、AB-8、ADS-17或DM130等。
采用任一上述方法制备得到的杜仲叶有效部位。
上述杜仲叶有效部位在制备预防和治疗由酒精引起的脑神经损伤药物、食品或保健品中的应用。
上述杜仲叶有效部位在制备保护与增强脑组织抗氧化功能药物、食品或保健品中的应用。
本发明从杜仲叶中提取得到杜仲叶有效部位，并采用腹腔注射酒精诱导急性酒精脑神经DNA损伤小鼠模型，首次研究杜仲叶对酒精诱导急性脑神经DNA损伤小鼠的影响。研究证实了杜仲叶有效部位可以拮抗小鼠小脑、大脑皮层的DNA损伤，其对酒精诱导的小鼠急性脑神经损伤具有一定的保护作用；可降低小脑、大脑皮层部位的中MDA、NO、8-OhdG的含量；能不同程度地提高小脑、大脑皮层部位的T-SOD、GSH-PX酶、NQO1、CHAT酶活力，说明杜仲叶有效部位在加强急性酒精神经损伤小鼠机体的抗氧化功能，保护机体免受自由基的进一步伤害，同时改善酒精引起的学习记忆障碍。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。
实施例1
一种杜仲叶有效部位的制备方法，其包括如下步骤：将500 g干燥的杜仲叶粉碎后，分别用4000 mL 40%（v/v，下同）乙醇超声提取2次，第一次超声提取20min，第二次超声提取30 min，过滤，合并两次滤液，减压浓缩，经HPD100大孔吸附树脂吸附，然后依次用水洗至流出液无颜色（弃掉），再依次用6倍柱体积20%乙醇、6倍柱体积50%乙醇梯度洗脱，合并梯度洗脱收集的洗脱液，减压浓缩回收溶剂、干燥得98.8 g提取物，即为杜仲叶有效部位。
以没食子酸作为对照品，采用分光光度法测得杜仲叶有效部位中总酚酸含量为：71%。
实施例2
一种杜仲叶有效部位的制备方法，其包括如下步骤：将200 g干燥的杜仲叶粉碎后，分别用1800 mL 60%（v/v，下同）乙醇散式提取2次，第一次散式提取3 min，第二次散式提取5 min，过滤，合并两次滤液，减压浓缩，经HPD600大孔吸附树脂吸附，然后依次用水洗至流出液无颜色（弃掉），再依次用6倍柱体积25%乙醇、6倍柱体积55%乙醇梯度洗脱，合并梯度洗脱收集的洗脱液，减压浓缩回收溶剂、干燥得35.2 g提取物，即为杜仲叶有效部位。
以没食子酸作为对照品，采用分光光度法测得杜仲叶提取物中总酚酸含量为：69%。
实施例3
一种杜仲叶有效部位的制备方法，其包括如下步骤：将100 g干燥的杜仲叶粉碎后，分别用1000 mL 70%（v/v，下同）乙醇超声提取2次，第一次超声提取20 min，第二次超声提取40 min，过滤，合并两次滤液，减压浓缩，经D101大孔吸附树脂吸附，然后依次用水洗至流出液无颜色（弃掉），再依次用6倍柱体积30%乙醇、6倍柱体积60%乙醇梯度洗脱，合并梯度洗脱收集的洗脱液，减压浓缩回收溶剂、干燥得10.5g提取物，即为杜仲叶有效部位。
以没食子酸作为对照品，采用分光光度法测得杜仲叶提取物中总酚酸含量为：73%。
效果实验一：杜仲叶有效部位对酒精诱导的小鼠急性脑神经DNA损伤的影响。
实验原料：实施例1制得的杜仲叶有效部位作为实验原料。
实验动物：昆明种小鼠，体重 22±2 g，SPF级，由河南省实验动物中心提供，生产批号：SCXK（豫）2010-0002。
实验试剂：氯化钠，天津市德恩化学试剂有限公司；氯化钾，天津市德恩化学试剂有限公司；低熔点琼脂糖，郑州博远泰隆科贸有限公司进口分装；正常熔点琼脂糖，郑州博远泰隆科贸有限公司美国原装进口；乙二胺四乙酸二钠，天津欧博凯化工有限公司；氢氧化钠，天津市光复科技发展有限公司；磷酸氢二钠，天津市致远化学试剂有限公司；盐酸，开封东大化工有限公司；溴化乙锭，郑州博远泰隆科贸有限公司进口分装；Triton X-100，AMRESCO solarbio；二甲基亚砜，Amresco solarbio公司；磷酸二氢钾，天津市光复科技发展有限公司；TRIS，Sigma solarbio；硫酸二甲酯，成都格雷西亚化学技术有限公司；无水乙醇，安徽安特食品股份有限公司。
实验仪器：多功能水浴锅，郑州长城科技工贸有限公司。JY200C型电泳仪，北京君意东方电泳设备有限公司。AB135-S型梅特勒-托利多B-S系列天平。JY-SP7型水平电泳槽，北京君意东方电泳设备有限公司。FV10型OLYMPUS荧光显微镜，日本。载玻片与盖玻片，江苏海门帆一实验器材厂。Multiskan Go1510酶标仪，Thermo Scientific。LRH-150恒温孵育箱，上海一恒科学仪器有限公司。TGL-16G台式离心机，上海安亭科学仪器厂。涡流混合器，Thermolyne。
实验方法：雄性小鼠20只，分为5组，每组4只。即：空白组、模型组（乙醇6.0g/kg）、阳性组（维生素E 50mg/kg+乙醇6.0g/kg）、杜仲叶低剂量组（100mg/kg+乙醇6.0g/kg）、杜仲叶高剂量组（400mg/kg+乙醇6.0g/kg）。杜仲叶有效部位用0.5%CMC-Na（羧甲基纤维素钠）双蒸水溶解。阳性组灌胃给予维生素E 50mg/kg；杜仲叶低和高剂量组分别灌胃给予杜仲叶有效部位100mg/kg和400mg/kg，连续灌胃三天；空白组及模型组灌胃给予等体积0.5%CMC-Na双蒸水，连续灌胃三天。最后一次给药后半小时，模型组、阳性组、杜仲叶低和高剂量组腹腔注射乙醇6.0g/kg，空白组腹腔注射等容积的生理盐水。乙醇临用前用生理盐水配制成20%乙醇水溶液。给予乙醇四小时后断头取脑分离小脑和大脑皮层，迅速移至冰冷的器皿中，制备细胞混合液，凝胶制片，细胞裂解，DNA碱解旋，电泳，中和，固定，染色，阅片，CASP彗星分析软件分析，以尾矩为测量指标进行评价，用SPSS 17.0版本软件分析给药组与对照组之间的差异性水平，采用单因素方差分析来判断总体显著性差异，结果见表1。
表1. 杜仲叶提取物抗酒精引起的小鼠小脑和大脑皮层DNA损伤活性(mean±S.E.M, n=4)
表1结果表明：杜仲叶有效部位高、低剂量组均具有显著拮抗酒精引起的小鼠小脑和大脑皮层的神经元DNA损伤。
效果实验二：杜仲叶提取物的抗氧化试验。
实验动物：成年昆明小鼠，雄性，体重22 ± 2 g，140只，分为5组，每组28只。即：空白组、模型组（乙醇6.0g/kg）、阳性组（维生素E 50mg/kg+乙醇6.0g/kg）、杜仲叶低剂量组（100mg/kg+乙醇6.0g/kg）、杜仲叶高剂量组（400mg/kg+乙醇6.0g/kg）。
主要试剂盒：一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、醌氧化还原酶1(NQO1)、乙酰胆碱转移酶（ChAT），以上试剂均为南京建成生物工程研究所生产；8-羟基-2-脱氧鸟嘌呤核苷(8-OHdG)试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司。
主要仪器：UV-2000 型紫外可见分光光度计 (尤尼可上海仪器有限公司) ；Multiskan Go1510 酶标仪 (Thermo Scientific)；LRH-150 恒温培养箱 (上海一恒科技有限公司)；TGL- 16G台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。
实验方法：给药方法同上所述。实验操作按照试剂盒说明书进行，测定小鼠小脑和大脑皮层中NO、MDA、8-OHdG的含量，以及SOD、GSH-PX、CHAT、NQO1活力，结果见表2和表3。
表2 杜仲叶有效部位对酒精引起小鼠脑神经DNA损伤的小脑和大脑皮层NO、MDA、SOD、GSH-PX酶的影响(mean±S.E.M, n=4)
表2的结果显示：给药组与模型组比较，杜仲叶有效部位高、低剂量组均能显著降低酒精急性给药后小鼠小脑和大脑皮层NO、MDA含量；并且均能显著提高神经DNA损伤小鼠小脑和大脑皮层的SOD酶和GSH-PX酶活性。表明，杜仲叶有效部位对小鼠脑组织氧化性DNA损伤均有保护作用，通过增强小鼠机体的抗氧化功能，保护脑组织被自由基的进一步伤害。
表3 杜仲叶有效部位对酒精引起小鼠脑神经DNA损伤的小脑和大脑皮层ChAT、8-OhdG和NQO1酶的影响(mean±S.E.M, n=4)
表3的结果显示：杜仲叶给药组脑区中NQO1水平升高，较模型组有显著性差异。杜仲叶灌胃给予的高、低剂量组发现脑区DNA的氧化损伤标记物8-OHdG含量降低，与模型组比较具有显著性差异，说明灌胃给予杜仲叶后，酒精引起的小鼠脑组织DNA氧化性损伤减少。乙酰胆碱是中枢胆碱能神经系统重要的神经递质，在脑组织内分布广泛，与学习、记忆功能密切相关，ChAT是合成乙酰胆碱的关键酶，是衡量胆碱能神经元功能的主要标志。由实验结果可看出，模型组的脑区ChAT活性显著降低，灌胃给予杜仲叶高、低剂量后发现ChAT活性显著增加，且与模型组比较具有显著性差异，表明杜仲叶有效部位能缓解酒精引起的学习记忆障碍。