本发明涉及中药提取技术领域，更具体地，涉及一种毛冬青总皂苷的提取纯化方法。
背景技术：
毛冬青为冬青科植物毛冬青的干燥根，主产于我国南方，临床用于治疗心血管疾病，疗效确切，毛冬青根中主要含有三萜皂苷类、黄酮类、酚类成分等。毛冬青药材在我国南方应用比较广泛，除以制剂形式流通市场，还作为一种保健茶被人们广泛应用。到目前为止，在毛冬青中已超过30个单一皂苷成分被分离和鉴定，这些成分对抗高血压，血小板聚集，血栓形成，炎症动脉粥样硬化，心肌缺血都有明显作用。
现有有关毛冬青总皂苷纯化方法的报道中，通常采用乙醇热回流法提取，再用正丁醇萃取或大孔树脂吸附法纯化。此类方法消耗溶剂多，操作过程较为繁琐，纯化的成本较高，且纯度偏低。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中，毛冬青总皂苷纯化所存在的纯化步骤繁琐、成本高、纯度偏低的缺陷，提供一种新的毛冬青总皂苷的纯化方法。
本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：
一种毛冬青总皂苷的提取纯化方法，包括以下步骤：
（1）一次除杂：将毛冬青粉碎成粗粉，加入蒸馏水浸泡，浸泡后弃去滤液，水洗粗粉后将其烘干得一次除杂后粗粉；
（2）将一次除杂后粗粉加入85%～95%乙醇，加热回流2～3次，清洗药渣，抽滤后收集全部滤液蒸干后得初提提取物粉末；
（3）向初提提取物粉末加入20%～30%乙醇，超声提取，固液分离后将固形物烘干即得毛冬青总皂苷。
本发明通过前期浸泡，结合乙醇加热回流和二次除杂；这三个步骤作为一个整体，从而实现毛冬青总皂苷的纯化。
前期实验，发明人发现毛冬青总皂苷的水溶性较差，需用高比例的醇进行提取。在实验初期，曾采用直接热回流的方式进行提取，但得到的提取物状态为浸膏状，说明提取物中的糖类等其它杂质较多；然而前期用水浸泡，浸泡后经提取后得到的固形物状态为淡黄色粉末状固体，测得的总皂苷含量也较高，相比较现有的提取纯化方法，节约提取纯化成本，简化了纯化工艺流程和时间成本；另外在回流提取之后用低浓度的醇进行二次纯化，结果表明，提取后可使提取物的纯度提高至少8%以上，效果显著。
优选地，步骤（1）蒸馏水浸泡的时间为24h，浸泡次数为1次～3次。
优选地，步骤（2）所述一次除杂后粗粉与85%～95%乙醇的质量比为1：10～1：15。
优选地，步骤（3）的超声频率为120～180hz，超声次数为1，每次超声时间为10～20min。
作为一种具体的实施方式，本发明上述方法包括以下步骤：
（1）一次除杂：将毛冬青粉碎成粗粉，按料液比1：10加入蒸馏水浸泡，浸泡1次，每次24h，浸泡后弃去滤液（滤液中含有糖、蛋白质和酚酸类物质），将粗粉清洗，60℃下烘干得一次除杂后粗粉；
（2）将一次除杂后粗粉加入85%～90%乙醇（料液比为1：10～1：15），加热回流2次（加热温度为85℃），每次1.0h，抽滤后清洗药渣，收集全部滤液蒸干后得初提提取物粉末；
（3）按料液比1：10(g/ml)向初提提取物粉末加入20%～30%乙醇，超声提取，固液分离后，离心，弃去上清液，适量20%～30%乙醇洗涤固形物，烘干即得毛冬青总皂苷。
本发明还提供上述方法在毛冬青总皂苷提取或者纯化中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种毛冬青总皂苷的提取纯化方法，通过前期浸泡除杂，结合乙醇水加热回流和低浓度乙醇二次除杂，即可获得纯度高于80%的淡黄色粉末状毛冬青总皂苷提取物，该方法相对于现有技术中在乙醇加热回流后再利用正丁醇萃取或大孔树脂吸附纯化的方法具有以下突出的优势：（1）相对于正丁醇萃取工艺，本发明所使用的试剂仅为水和乙醇，更加经济、环保、安全；（2）相对于大孔树脂纯化工艺，本纯化工艺极大的简化了工艺流程、试剂和材料成本，缩短了工艺时间和减轻了工作强度，更加方便、快捷、高效，从而更容易被工业接受和推广应用，进一步满足生产和市场需要。
具体实施方式
下面将结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤、条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若无特别说明，实施例中所用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法和技术，试剂或材料均为通过商业途径得到。
实施例1毛冬青中总皂苷的含量测定
一、溶液的制备
（1）对照品储备液的制备：取毛冬青皂苷b1（自制，纯度>98%）对照品2.00mg，精密称定，置10ml容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，移取摇匀，即得毛冬青皂苷b1对照品储备液。
（2）供试品溶液的制备：取毛冬青药材饮片，打粉并过20目筛，称取毛冬青粉末1.00g，加甲醇20ml，超声（120hz）提取2次，每次30min，过滤，合并滤液至50ml容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀即得。
（3）5%香草醛-冰醋酸溶液的制备：取香草醛0.50g，精密称定，置10ml容量瓶中，冰醋酸溶解并定容至刻度，摇匀即得。
二、总皂苷显色方法和检测波长的确定
显色方法：分别精密移取对照品储备液和毛冬青供试品溶液各0.5ml于10ml具塞试管中，空气吹干，精密加入新鲜配置的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，摇匀。于60℃水浴加热15min，冰浴冷却3min，再加冰醋酸5ml，摇匀。
检测波长的确定：分别取毛冬青对照品储备液和毛冬青供试品溶液各0.5ml，依上述显色方法操作，制备对照品溶液、供试品溶液、未显色供试品溶液（除用1.0ml冰醋酸替代0.2ml5.0%香草醛-冰醋酸溶液和0.8ml高氯酸溶液外，其余按照上述显色方法操作）、阴性对照溶液（除不加入对照品储备液或者毛冬青提取液外，其余按照上述显色方法操作），在400～700nm波长范围内分别扫描显色后对照品溶液、显色后供试品溶液、未显色供试品溶液和阴性对照溶液的吸收光谱图，结果表明，显色后对照品溶液和显色后供试品溶液的紫外吸收光谱图基本相似，在560nm左右有最大吸收；未显色供试品溶液和阴性对照溶液在560nm附近无吸收。故显色方法有效，且阴性溶液无干扰，确定测定毛冬青总皂苷的检测波长为560nm。
三、方法学考察
1、标准曲线及线性范围
精密移取对照品储备液0.2ml、0.4ml、0.8ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml于10ml具塞试管中，按步骤二的显色方法操作，于560nm处测定吸收值。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，计算回归方程。得到的标准曲线为y=0.8778x-0.1493（r=0.9991），线性范围为6.67～66.7µg·ml-1。
2、精密度试验
精密移取供试品溶液0.5ml于10ml具塞试管中，按步骤二的显色方法操作，于560nm处测定吸光度，重复测定6次，计算rsd值，结果见表1。
3、重复性试验
按“供试品溶液的制备”项下方法制备毛冬青提取液6份，分别精密移取步骤一的供试品溶液1ml于10ml具塞试管中，按步骤二的显色方法操作，于560nm处测定吸光度，计算rsd值，结果见表2。
4.稳定性试验
精密移取供试品溶液0.5ml于10ml具塞试管中，按步骤二的显色方法操作，于560nm处每隔10分钟测定其吸光度，记录60min内的吸光度并计算rsd值，结果见表3。
5.加样回收率试验
取已知总皂苷含量的毛冬青粉末0.5g，加入相当含量的对照品，步骤一制备供试品溶液的方法制备毛冬青提取液共6份，按步骤二的显色方法操作，于560nm处测定吸光度，计算总皂苷含量及回收率，结果见表4。
实施例2毛冬青总皂苷纯化方法
毛冬青总皂苷纯化方法包括以下步骤：
（1）一次除杂：取毛冬青原药材适量，将其粉碎成粗粉。精密取粗粉10g，置于100ml烧杯中。精密称取10倍量的蒸馏水浸泡粗粉，浸泡1次，每次24h，保鲜膜封口，并定时搅拌。浸泡完后抽滤，并清洗药渣，60℃干燥得一次除杂后的粉末，同时收集滤液用于测定（按药材质量计算，水浸渍后皂苷的溶出率为0.51±0.025%，水液中提取出的固形物质量分数约为4.5%）；
（2）回流提取：精密称取一次除杂后的粉末4g，按料液比1：10加入85%乙醇，加热回流2次，每次1h，抽滤，并清洗药渣，同时收集全部滤液进行旋蒸，蒸干后即得初提提取物粉末（测得总皂苷的纯度为77.1±5.5%，收率约为4.2%）；
（3）二次除杂：按料液比1：10向初提提取物粉末中加入20%乙醇，超声浸提1次（20min），将剩余固形物烘干得毛冬青总皂苷提取物（纯度为84.1±6.5%），同时收集上清液用于测定（上清液中皂苷比例为0.83%）。
另取市场上流通的毛冬青10种，利用上述方法获得毛冬青总皂苷提取物，计算总皂苷部位、群得率和纯度，结果如表5。
实施例3
实验方法同实施例2，唯一不同的是，步骤（1）中粗粉在10倍量蒸馏水浸泡2次（24h），（按药材质量计算，水浸渍后皂苷的溶出率为0.59±0.037%，水液中提取出的固形物质量分数约为4.8%）。
实施例4
实验方法同实施例2，唯一不同的是，步骤（2）的回流提取是按照1：10加入95%乙醇，最终获得初提提取物粉末，测得总皂苷的纯度为74.1±1.8%，固形物收率约为3.2%。
实施例5
实验方法同实施例2，唯一不同的是，步骤（2）的回流提取是按照1：10加入90%乙醇，最终获得初提提取物粉末，测得总皂苷的纯度为73.3±3.4%，固形物收率约为3.9%。
实施例6
实验方法同实施例2，唯一不同的是，步骤（2）的回流提取是按照1：15加入85%乙醇，最终获得初提提取物粉末，测得总皂苷的纯度78.1±5.2%，固形物收率约为3.6%。
实施例7
实验方法同实施例2，唯一不同的是，步骤（2）的回流提取是按照1：20加入85%乙醇，最终获得初提提取物粉末，测得总皂苷的纯度73.5±3.3%，固形物收率约为3.6%。
实施例8
实验方法同实施例2，唯一不同的是，步骤（2）的回流提取是按料液比1：10加入85%乙醇，加热回流3次，每次1h，抽滤，并清洗药渣，同时收集全部滤液进行旋蒸，蒸干后即得初提提取物粉末测得总皂苷的纯度78.9%，固形物收率为4.2%。
实施例9
实验方法同实施例2，唯一不同的是，步骤（3）的二次除杂是按料液比1：10向初提提取物粉末中加入30%乙醇，超声浸提1次（20min），将剩余固形物烘干得毛冬青总皂苷提取物（纯度为83.3±3.5%），同时收集上清液用于测定（上清液中皂苷比例为1.1%）。
实施例10
实验方法同实施例2，唯一不同的是，步骤（1）中粗粉在10倍量蒸馏水浸泡3次，每次24h，保鲜膜封口，并定时搅拌。浸泡完后抽滤，并清洗药渣，60℃干燥得一次除杂后的粉末，同时收集滤液测定。（按药材质量计算，水浸渍后皂苷的溶出率为0.65±0.057%，水液中提取出的固形物质量分数约为5.1%）。
对比例1
实验方法同实施例2，唯一不同的是，步骤（2）的回流提取是按料液比1：10加入85%乙醇，加热回流1次（1h），抽滤，并清洗药渣，同时收集全部滤液进行旋蒸，蒸干后即得初提提取物粉末测得总皂苷的纯度69.0±5.5%，固形物收率约为3.9%。