一种含千层纸素用于治疗白血病的组合物及其应用的制作方法

本发明属于抗肿瘤药物领域，涉及一种含千层纸素用于治疗白血病的组合物及其应用。

背景技术：

千层纸素(Oroxylin A)是黄芩的活性组分之一，具有明显的抗肿瘤作用，是一个具有广阔应用前景的天然抗肿瘤药物。目前不少文献对千层纸素的抗肿瘤作用及诱导凋亡和周期阻滞进行了系统的研究，发现千层纸素对体外培养的人肝癌细胞HepG2有显著的生长抑制作用，且对ICR小鼠实验性移植瘤S₁₈₀也具有显著的生长抑制作用，抑制率最高可达40％以上，作用于低分化人胃腺癌细胞株BGC-823导致其周期阻滞于G2/M期，提示千层纸素可以诱导肿瘤细胞凋亡，并且可以针对细胞周期检测点调控肿瘤细胞生长。但是目前没有千层纸素对白血病影响的研究报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种含千层纸素的抗白血病组合物。

本发明的另一个目的是提供上述组合物在制备治疗白血病药物中的应用。

全反式维甲酸(ATRA)的治疗对U937和HL-60等非急性早幼粒细胞白血病无效，TNFα可促进U937和HL-60分化，但分化过程中有明显的副作用抑制其分化效果，千层纸素联用TNFα可增敏细胞对TNFα的反应。

本发明的目的是通过下列技术方案实现的：

一种药物组合物，该药物组合物的活性成分包含千层纸素和肿瘤坏死因子。

所述的药物组合物的活性成分含有下列浓度比例的组分：

千层纸素10～50μM：肿瘤坏死因子10～20ng/mL。

所述的药物组合物在制备治疗白血病的药物中的应用。

所述的白血病为急性髓系白血病。

本发明的有益效果：

本发明通过实验证明了千层纸素与TNFα联用能够增强TNFα抑制人白血病细胞株NB4、细胞株U937-MDR以及细胞株HL-60-resistant的活力，也能增强TNFα抑制人AML原代细胞的活力，延长人AML原代细胞接种小鼠的生存期，可用于制备治疗白血病的药物，具有较好的临床应用前景。

附图说明

图1：千层纸素增强TNFα对AML细胞活力的抑制。

图2：千层纸素增强TNFα对AML细胞活力的抑制。

图3：TNFα联用千层纸素延长人AML原代细胞接种小鼠的生存期。

具体实施方式：

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例1

本研究主要是将黄酮类抗肿瘤化合物与抗肿瘤药物肿瘤坏死因子TNFα联合，用于治疗急性髓系白血病(AML)。通过体内外研究发现，千层纸素能够与TNFα联合增效。

1、实验材料

1.1试剂

(1)千层纸素(oroxylin A)购自江苏省肿瘤发生与干预重点实验室(中国药科大学)，使用前用二甲亚砜(DMSO)将药物粉末配制为0.5M的浓度的母液，临用前用细胞培养液配成所需浓度。全反式维甲酸(ATRA)购自美国Sigma公司，溶解于DMSO配制成浓度为20mM的母液。

(2)重组人肿瘤坏死因子α(TNFα)购自Prospec-Tany TechnoGene股份有限公司。使用前先用无菌水将粉末配置成1.0mg/ml浓度的母液，再用0.1％BSA将其稀释为1μg/ml的储备液，-20℃分装保存。临用前用细胞培养液配成所需浓度。

(3)细胞培养试剂

①培养液：RPMI-1640培养基，购自美国GIBCO公司。取RPMI-1640粉末10.39g溶于1000ml灭菌三蒸水中，并加入2.0g NaHCO₃，用1M盐酸调pH值至7.0，圆筒式过滤器过滤除菌、分装，4℃冰箱保存。使用前加入100U/ml的青霉素和100U/ml的链霉素。

②胎牛血清：美国GIBCO公司产品。经56℃水浴灭活30min，分装并保存于-20℃低温冰箱中。

③PBS缓冲液：称取NaCl 8.0g、KCl 0.20g、Na₂HPO₄·H₂O 1.56g、KH₂PO4 2.0g，溶于1000ml三蒸水中，高压灭菌，4℃冰箱保存。

(4)淋巴细胞分离液，南京晶美公司产品。

(5)MTT贮液(5mg/ml溶于PBS)：美国Sigma公司产品。取MTT粉末1.0g溶于20ml PBS溶液中，避光超声溶解。

(6)细胞分化检测相关试剂

人抗鼠CD11b-PE，anti-CD14-FITC抗体购自Miltenyi公司。

牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)购自瑞士Roche公司。

(7)全反式维甲酸(ATRA)购自美国Sigma公司，溶解于DMSO配制成浓度为20mM的母液。

(8)千层纸素(oroxylin A)购自江苏省肿瘤发生与干预重点实验室(中国药科大学)，做成静脉注射剂。

(9)重组人肿瘤坏死因子α(TNFα)(500,000IU/ml)购自上海维科生物医药有限公司。小鼠静脉注射(3,000IU/kg)。

1.2实验仪器

(1)YJ-875型医用净化工作台：苏州净化设备厂生产。

(2)3111型水套式CO2培养箱：美国Thermo electron公司产品。

(3)电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司产品。

(4)ELX800酶联免疫检测仪：美国Bio-tek公司产品。

(5)QIUJING血细胞计数板：中国上海求精生化试剂仪器有限公司产品。

(5)Olympus相机：日本Olympus公司产品。

(6)LD4-2普通离心机：北京医用离心机厂产品。

(7)5417R型台式冷冻高速离心机：德国Eppendorf公司产品。

(8)THZ-312型台式恒温振荡器：上海精宏试验设备有限公司产品。

1.3细胞株

人白血病细胞株NB4购自上海中国科学院细胞所，细胞株U937-MDR和HL-60-resistant由阿尔伯特.爱因斯坦医学院的Robert E.Gallagher教授实验室构建，通过广州吉妮欧生物科技有限公司购买。人AML原代细胞购买于江苏省人民医院血液科。所有细胞均用含100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素和10％胎牛血清的RPMI1640培养液培养。

NB4为急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞株，U937-MDR为U937多药耐药株，HL-60-resisitant为HL-60的全反式维甲酸ATRA耐药株。分化诱导剂全反式维甲酸(ATRA)对NB4有效，作为阳性对照；U937和HL-60都是非急性早幼粒细胞白血病的急性髓系白血病(AML)，都无法响应全反式维甲酸(ATRA)的治疗。

1.4实验动物

品系：NOD/SCID小鼠；

周龄：6-8周；

体重：18-22g；

饲养条件：颗粒饲料；SPF空调房间，温度18-24℃，相对湿度70％。

购自中国科学院上海实验动物中心。

2、实验方法

2.1淋巴细胞分离液分离人白血病细胞

人外周血中各种细胞的密度不同，人红细胞密度为1.093，粒细胞为1.092，淋巴细胞为1.074±0.001。密度梯度离心法的原理主要根据各类血细胞比重的差异，利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心，使一定比重的血细胞按相应的密度梯度分布于不同的独立带，从而达到分离的目的。将无菌的10ml离心管中加入2ml淋巴细胞分离液。将2ml肝素抗凝管(或枸橼酸钠)中的静脉血与等量无血清培养基充分混匀后，用移液器沿管壁缓慢滴加于分层液面上，注意保持清楚的界面。2000rpm离心20min。离心后管内分为三层在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾狭窄带。单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。用毛细管或吸头插到云雾层，吸取单个核细胞。然后置于另一离心管中。加入5倍体积的无血清培养基液洗涤，上下颠倒数次混匀，1500rpm离心15min。弃上清，再重复洗涤细胞1次。末次离心后，弃上清，尽可能将上清吸净。加入1ml含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。细胞分离好后立即使用。离心示意图如下：

2.2MTT实验

活细胞内的线粒体脱氢酶能将MTT还原为蓝紫色的结晶甲臜，其溶解液颜色的深浅与细胞的活力大小呈正比。将实验所需处于对数生长期的细胞按一定的浓度接种于96孔酶标板内。细胞接种浓度一般在0.5～2×10⁴个/孔，每孔内体积为50μl。并加入50μl终浓度20μM的千层纸素预处理24h。接着加入100μl不同终浓度(10，20ng/mL)的TNFα继续置于孵箱内培养至96h后，每孔加入20μl MTT溶液。继续孵育4h后将每孔的上清液吸净。每孔加入100μl DMSO，放于微型振荡器上振动5min使结晶溶解。待结晶完全溶解后将其放于酶标仪上检测，检测波长为570nm。将检测后的吸光值整理后按下面的公式计算药物对细胞的生长抑制率。

2.3流式表面抗原检测

随着细胞发生分化，细胞膜表面蛋白抗原也相应发生改变，这些与分化有关的蛋白称为分化抗原。可以通过检测细胞表面分化抗原来较为精确地判断细胞是否发生分化。其中，CD11b是髓系分化成熟的标志抗原。TNFα联用千层纸素或ATRA作用于人细胞系及人AML原代细胞孵育96h后收集细胞并计数，将各组细胞调至同一密度(5×10⁵个/ml)，用含0.5％BSA的PBS缓冲液封闭细胞表面的非特异性结合位点，离心后重悬，加入抗体，使PE标记的CD11b及FITC标记的CD14抗体与待测细胞表面的CD抗原结合，再用免疫荧光流式细胞计量术(FCM)计数荧光标记的阳性细胞，与未加抗体的经同样处理方式处理的细胞作对照，并作同型对照。

2.3人AML原代细胞NOD/SCID小鼠模型建立方法

(1)取AML病人新鲜血液样本，用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，无血清培养基RPMI 1640重悬待用。

(2)动物辐照。将NOD/SCID小鼠进行X射线辐照，辐照量为2.4Gy。

(3)辐照后24小时内进行接种，将原代细胞离心后重悬为最终密度为1×10⁷个/ml，用空针抽吸，每次抽吸前将细胞混匀，以0.1ml(1×10⁶个)接种于NOD/SCID小鼠尾静脉。

(4)试验设空白组，阴性对照组，单药组和联用组。空白组，阴性对照组给生理盐水，单药组给予80mg/kg的千层纸素或3,000IU/kg的TNFα(按人临床使用剂量与小鼠进行换算)，千层纸素腹腔注射隔天给药，TNFα尾静脉注射给药，每周周三到周六给药，给共给药30天。

(5)给药期间，观察各组小鼠的生存状态。记录小鼠死亡情况。

(6)整理结果，出具报告。

3、实验结果

(1)TNFα联用千层纸素对AML细胞株细胞活力的影响

通过MTT测定不同浓度的TNFα(10，20ng/mL)和20μM千层纸素各自单用或两者联用4天后，NB4，U937-MDR和HL-60-resistant细胞活力的变化。实验结果显示(图1A)，与单独用药组相比，TNFα联用千层纸素显著地抑制三种细胞的活力。同样，在人AML原代细胞中，TNFα联用千层纸素也能够显著抑制细胞活力(图1B)。

(2)TNFα联用千层纸素对AML细胞株分化相关表面抗原的影响

如图2所示，与单独用药组相比，TNFα联用千层纸素给药后，NB4，U937-MDR和HL-60-resistant细胞表面CD11b和CD14两种表面抗原均明显增加，差异均有统计学意义。说明，TNFα联用千层纸素能够诱导这三种白血病细胞向成熟的方向变化，且具有单核系分化特征。同时，TNFα联用千层纸素给药后，人原代AML细胞表面CD11b和CD14两种表面抗原也发生明显增加，分化能力显著提高。

(3)TNFα联用千层纸素在体内对人AML细胞接种NOD/SCID小鼠模型的影响

如图3所示，与阴性对照组相比，TNFα联用千层纸素能够显著延长接种人AML原代细胞的NOD/SCID小鼠的生存期。