本发明属于疫苗制备领域，具体涉及一种一种显著提高免疫能力的肺癌干细胞疫苗的制备方法。
背景技术：
：肿瘤疫苗即是利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体的特异性细胞免疫和体液免疫反应，以调节机体免疫功能，达到治疗肿瘤的目的。治疗性肿瘤疫苗可通过主动免疫诱导全身特异性抗肿瘤效应。根据其制备方法不同，疫苗主要分为：细胞疫苗、多肽疫苗和蛋白质疫苗、核酸疫苗、抗独特型抗体疫苗等。肿瘤干细胞疫苗是最近兴起的研究方法，在肝癌、卵巢癌等方面已获得了相应的研究进展。由于肿瘤干细胞的免疫原性非常的弱，开展肿瘤干细胞疫苗的主要任务之一便是提高其免疫原性。不过，对于不同的肿瘤干细胞而言，提高免疫原性所依赖的原理和方法尚未形成共识，许多研究之间还存在矛盾之处。一般而言，聚酐对于免疫原性的稳定性具有着很好的效果，可增强免疫应答。不过在本发明的前期研究中，发明人发现其并不能发挥此效果。同样，甘露聚糖或者甘露聚糖肽虽也是常用的抗肿瘤佐剂（如“Oligomannose-coatedliposomesasatherapeuticantigen-deliveryandanadjuvantvehicleforinductionofinvivotumorimmunit”），其同样难以制备成肺癌疫苗。因此，本领域亟需一种适用于肺癌干细胞疫苗的制备方法。技术实现要素：针对现有技术的缺点，本发明的目的之一在于提供一种显著提高免疫能力的肺癌干细胞疫苗的制备方法，该方法包括如下步骤：（1）将复苏后的肺癌干细胞于DMEM全培养基中培养，DMEM全培养基中含8%的FBS，培养温度为37℃，湿度为85%，CO2的浓度为0.5%，培养3-4天，之后对所培养的细胞进行1:3的分盘，再用同样的培养基在同样的培养条件下培养3天，细胞呈现纺锤体或近似纺锤体；（2）对步骤（1）所得物利用60Co进行辐照处理，剂量为3-4Gy；（3）选取CD133阳性干细胞，培养后进行灭活处理，利用生理盐水重悬干细胞，使得细胞浓度为1×105-1×106个/ml；（4）按照体积比4:1.5:2的比例，将步骤（3）所得物、壳聚糖生理盐水溶液和昆布多糖生理盐水溶液混合，混合后，壳聚糖浓度为2%，昆布多糖的浓度为2.5%。利用60Co进行辐照，能够使得阳性干细胞的比例大幅增加，利于疫苗的制备。一般而言，利用辐照会产生一些难以预料的后果，但是采用低剂量（3-4Gy）的60Co辐照时，并没有发现其它不理的后果，而是大幅增加了阳性干细胞的比例。初步的研究发现，在本发明的辐照剂量下，CD133阳性干细胞的比例可达到70-90%左右，而不进行辐照，所得的CD133阳性干细胞仅为40%左右。不过，辐照剂量与CD133干细胞比例之间并非呈线性关系，更为重要的是，即使采用同样的辐照剂量进行多次实验，不同实验之间所得CD133阳性干细胞比例在30-50%范围内呈具有统计学差异的无规律随机分布。关于该现象的机理，还需要进行深入的研究。另外，本发明还发现利用甘露聚糖作为佐剂无法实现满意的疫苗功能，可能是甘露聚糖并不能增强免疫应答。本发明能够获得较好的效果的原因可能在于对肺癌干细胞的处理过程增加了其免疫原性，可能是辐照、培养方式、佐剂的选择或者其结合使然。这方面需要后续进行相关单因素和条件筛选实验来验证。不过，可以肯定的是，在所有条件不变的情况下，将佐剂替换为在肿瘤干细胞疫苗中常用的甘露聚糖或者甘露聚糖肽确实不能获得满意的效果。步骤（2）中，辐照剂量为3Gy。虽然该剂量并不能进一步稳定的增加CD133阳性干细胞的比例，但出于保守考虑，取本发明所发现的辐照剂量的最低值，可能是一种合理的选择。步骤（3）中，细胞浓度为5×105个/ml。步骤（3）中，所述的灭活为：对干细胞进行多次冻融处理。本发明的另一个目的在于提供上述方法制备得到的疫苗。本发明的另一个目的在于提供所述疫苗在制备治疗肺癌药物方面的用途。本发明的有益效果：本发明所得疫苗对于肺癌具有显著的疗效，可显著的增强免疫能力，并控制肿瘤的生长。具体实施方式下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述
发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。实施例（1）将复苏后的肺癌干细胞于DMEM全培养基中培养，DMEM全培养基中含8%的FBS，培养温度为37℃，湿度为85%，CO2的浓度为0.5%，培养3-4天，之后对所培养的细胞进行1:3的分盘，再用同样的培养基在同样的培养条件下培养3天，细胞呈现纺锤体或近似纺锤体；（2）对步骤（1）所得物利用60Co进行辐照处理，剂量为3Gy；（3）选取CD133阳性干细胞，培养后进行多次冻融处理，将其灭活，然后利用生理盐水重悬干细胞，使得细胞浓度为5×105个/ml；（4）按照体积比4:1.5:2的比例，将步骤（3）所得物、壳聚糖生理盐水溶液和昆布多糖生理盐水溶液混合，混合后，壳聚糖浓度为2%，昆布多糖的浓度为2.5%。对比实施例除佐剂为甘露聚糖肽和脂肪乳之外，其余与实施例一致。实验例对植入肺癌肿瘤的10只昆明鼠注射实施例所得疫苗作为实验组1，另取10只昆明鼠注射对比实施例所得物作为实验组2，另取10只昆明鼠注射生理盐水作为对照组。实验组和对照组的注射量均为200ul,15天后进行外周淋巴细胞数目、淋巴细胞功能和肿瘤体积检测。结果如表1、表2和表3所示。表1注：*P＜0.01表2实验组1实验组2对照组IFN-γ（pg/ml）1.69±0.110.81±0.130.74±0.20TNF（pg/ml）1.57±0.260.76±0.150.69±0.12IL-4（pg/ml）2.95±0.112.01±0.151.88±0.24注：*P＜0.01表3实验组1实验组2对照组肿瘤体积变化（%）-30±2+15±3+80±5注：“+”表示肿瘤体积增加，“-”表示肿瘤体积减少，*P＜0.01。当前第1页1 2 3