由甘肃道地药材甘松制成的治疗哮喘的药物及其制备方法与流程
本发明涉及中药领域，具体涉及一种由甘松与甘青铁线莲的活性药物及其制备方法。
背景技术：
哮喘及过敏性哮喘是一种常见病、多发病，属于中医的“喘证”范畴。中医认为，本病的发生是肺脾肾虚、痰饮内伏、痰阻气道、宣降失常所致。哮喘是一种以嗜酸性粒细胞（EOS）、肥大细胞反应为主，淋巴细胞和巨噬细胞浸润为辅的气道炎症性疾病。往往在人的体质下降，免疫功能低下时发病。其发病率高居不下，严重危害人类的身体健康。
西医治疗哮喘的药物只能起到一时缓解作用，疗效仍不能令病人满意，很多药物治疗哮喘可使疼痛缓解，但停药以后又会反复发作，哮喘的治疗往往具有持久性和反复性。感染是肺气肿病因中最值得注意的因素之一，病毒、细菌和支原体是本病急性加重的重要因素；职业性粉尘及化学物质，如烟雾、过敏原、工业废气及室内空气污染等，浓度过大或接触时间过长，均可能产生与吸烟无关的肺气肿；大气中的有害气体如二氧化硫、二氧化氮、氯气等损伤气道粘膜，使纤毛清除功能下降，粘液分泌增加，为细菌感染增加条件；吸烟是引起肺气肿原因中最重要的，吸烟者肺气肿的患病率比不吸烟者高2~8 倍，烟龄越长，吸烟量越大，肺气肿患病率越高。目前，各大医院迫切需要一种治疗哮喘期限短、疗效高、反复率低的药物。
过敏性哮喘（Bronchial asthma）是以肺部多种细胞特别是肥大细胞、嗜酸性粒细胞和T淋巴细胞等浸润和对各种激发因子产生气道高反应为特征的慢性气道炎症疾病，在易感者中此种炎症可引起反复发作的气促、喘息、咳嗽和胸闷等症状，气道对多种刺激因子反应性增高。哮喘的发展由炎症前细胞因子介导，如主要由Th2细胞分泌的IL-4、IL-5和IL-13，此外，由Th1细胞分泌的IFN-γ抑制Th2细胞分化，致敏剂诱发的反应还伴随呼吸道内嗜酸细胞（eosinophil，EOS）的渗出，EOS是哮喘过敏性气道炎症反应的主要效应细胞，与哮喘发病之间存在直接因果关系。已经证实IFN-γ在胞内细菌感染时有一定的保护作用，并参与自身免疫病的发生，在过敏性哮喘中IFN-γ与气道单核细胞及中性粒细胞浸润有关，并能抑制Th2细胞产生IL-4进而抑制IgE的分泌，对哮喘有一定的保护作用。IgE水平增高在过敏性哮喘、变应性鼻炎等特应性疾病（atopic）中最具特征性，是诊断哮喘与气道高反应性的重要参考指标，高水平IgE被认为是在非过敏性哮喘中的危险因素。
甘松，败酱科Valerianaceae甘松属Nardostachys DC.植物，共有3种植物，分别是甘松N. chinensis Bet.、匙叶甘松 N. jatamansi ( D. Don) DC. 和大花甘松 N.grandif lora DC.。甘松属植物均以根及根茎入药，药用历史非常悠久，我国常见甘松和匙叶甘松两种，入药始载于《本草拾遗》，后列入《海南本草》和《开宝本草》，认为其具有理气止痛、开郁醒脾、安神等功效，用于治疗脾胃气滞、脘腹胀痛、霍乱转筋、牙痛、痰眩、癔病癫痫、心悸怔忡、脚气等多种病症，是目前败酱科中唯一被《中国药典》收载的药用植物。
甘松，春、秋二季采挖，除去泥沙和杂质，晒干或阴干。本品略呈圆锥形，多弯曲，长5～18cm。根茎短小，上端有茎、叶残基，呈狭长的膜质片状或纤维状。外层黑棕色，内层棕色或黄色。根单一或数条交结、分枝或并列，直径0.3～1cm。表面棕褐色，皱缩，有细根和须根。质松脆，易折断，断面粗糙，皮部深棕色，常成裂片状，木部黄白色。气特异，味苦而辛，有清凉感。
甘松主要分布于甘肃、四川、云南、西藏等地。味辛、甘，性温。归脾、胃经。理气止痛，开郁醒脾，外用祛湿消肿。用于脘腹胀满，食欲不振，呕吐；外用治牙痛，脚气肿毒。《鸡峰普济方》记载，松香丸治痰眩：半夏曲、天南星各二两，甘松一两，陈橘皮一两半。上为细末，水煮面和为丸，如梧桐子大。每服二十丸，生姜汤下，食后。《本草求真》记载，甘松，虽有类山柰，但山柰气多辛窜，此则甘多于辛，故书载能入脾开郁也。《本草汇言》记载，甘松，醒脾畅胃之药也。
甘青铁线莲，为毛茛科植物甘青铁线莲的全株或茎叶，拉丁名：Clematis tangutica （Maxim.）Korsh.[C.orientalis L.var.tangutica Maxim.；C.tangutica（Maxim.）Korsh.var.obtusiuscula Rehd et Wils.]。甘青铁线莲，落叶藤本。主根粗壮，木质。茎具棱，幼时被长柔毛，后脱落。叶对生，一回羽状复叶；叶柄长2～7.5cm；小叶5～7，叶片浅裂、深裂或全裂，中央裂片较大，侧裂片小，卵状长圆形、狭长圆形或披针形，长3～4cm，宽0.5～1.5cm，先端钝，有短尖头，基部楔形，边缘有不整齐缺刻状锯齿，上面有毛或无毛，下面有疏长毛。花单生，有时为单聚伞花序，有3朵花，腋生；花序梗粗壮，长4.5～20cm，有毛；花两性；萼片4，狭卵形、椭圆状长圆形，长1.5～3.5cm，黄色外面带紫色，斜上展，先端渐尖或急尖，外面边缘被短绒毛，中间被柔毛，内面无毛或近无毛；花瓣无；雄蕊多数，花丝下面稍扁平，被开展的柔毛，花药无毛；心皮多数，密生柔毛。瘦果倒卵形，长约4mm，有长柔毛，宿存花术羽毛状，长达4cm，花期6～9月，果期7～10月。
甘青铁线莲在我国分布于甘肃南部和东部（海拔1800～3700m）、新疆（海拔2160～2700m）、西藏（海拔3150～4900m）、四川西部（海拔1920～3800m）、青海（海拔1370～2700m）。生高原草地或灌丛中。《新华本草纲要》记载：甘青铁线莲有利水、健胃、消积之功，治消化不良，痞块食积，腹泻，并有排脓、除疮等作用。
甘肃中医药大学是甘肃省道地药材的主要研究单位，本申请的发明人在承担国家级科研项目2014地区科学基金项目的研究过程中，对甘肃省的道地药材进行了大量的研究工作，尤其是对甘肃省地道药材的药对配伍使用方面做了深入的研究，甘松与甘青铁线莲均甘肃省道地药材，现有技术中，对甘松和甘青铁线莲的单独研究已有不少的报道，但尚未见对两者配伍研究的报道，发明人在对甘松与甘青铁线莲药对配伍研究的过程中，意外发现，将甘松和甘青铁线莲配伍使用，在特定的制备方法下，对哮喘有特别好的治疗效果。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种甘松与甘青铁线莲的药物。
本发明的另一目的是提供该药物的制备方法。
本发明还提供了该药物的检测方法。
本发明还提供了该药物的制药用途。
本发明的目的是由以下方式实现的：
一种治疗过敏性哮喘的药物，该药物是由以下重量份的原料制成的：甘松1～2重量份，甘青铁线莲1～2重量份。
该药物是优选由以下重量份的原料制成的：甘松2重量份，甘青铁线莲1重量份。
该药物是优选还可以由以下重量份的原料制成的：甘松1重量份，甘青铁线莲2重量份。
该药物是优选还可以由以下重量份的原料制成的：甘松1重量份，甘青铁线莲1重量份。
所述的药物可以制备成片剂、丸剂、散剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、口服液。
所述的药物采用如下方法制备：
（1）取甘松、甘青铁线莲，将其进行水蒸气蒸馏提取，从中提取挥发油，得挥发油提取物Ⅰ，备用；
（2）将甘松、甘青铁线莲水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤，得蒸馏后的水溶液，加热浓缩，得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ，备用；保留水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，备用；
（3）取步骤（2）所得水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小时，合并乙醇提取液，滤过，得乙醇提取液，回收乙醇并浓缩，得乙醇提取浓缩液Ⅳ，备用；保留乙醇提取后的药渣Ⅴ，备用；
（4）将步骤（3）所得乙醇提取后的药渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，得水提取浓缩液Ⅵ；
（5）将步骤（3）所得乙醇提取浓缩液Ⅳ、步骤（4）所得水提取浓缩液Ⅵ、步骤（2）所得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ合并，混匀，干燥，粉碎，再加入步骤（1）所得挥发油提取物Ⅰ，混匀，装入胶囊即得。
所述治疗过敏性哮喘的药物的检测方法，该药物是由以下重量份的原料制成的：甘松1～2重量份，甘青铁线莲1～2重量份；该药物采用如下方法制备：
（1）取甘松、甘青铁线莲，将其进行水蒸气蒸馏提取，从中提取挥发油，得挥发油提取物Ⅰ，备用；
（2）将甘松、甘青铁线莲水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤，得蒸馏后的水溶液，加热浓缩，得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ，备用；保留水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，备用；
（3）取步骤（2）所得水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小时，合并乙醇提取液，滤过，得乙醇提取液，回收乙醇并浓缩，得乙醇提取浓缩液Ⅳ，备用；保留乙醇提取后的药渣Ⅴ，备用；
（4）将步骤（3）所得乙醇提取后的药渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，得水提取浓缩液Ⅵ；
（5）将步骤（3）所得乙醇提取浓缩液Ⅳ、步骤（4）所得水提取浓缩液Ⅵ、步骤（2）所得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ合并，混匀，干燥，粉碎，再加入步骤（1）所得挥发油提取物Ⅰ，混匀，装入胶囊即得；
其检测方法为：采用高效液相色谱法进行甘松根酮的含量测定：
（1）色谱条件：色谱柱：Agilent zorbax-C18；流动相：比例为33:67的乙腈-0.05%磷酸溶液；柱温：30℃；流速：1mL/min；Waters 2420蒸发光散射检测条件：漂移管温度：43℃；雾化器温度：35℃；氮气压力：25Psi；进样量：10μL；
（2）对照品溶液制备：精密称取80℃干燥至恒重的甘松根酮对照品适量，加甲醇溶解制成每1mL含1mg的对照品溶液；
（3）供试品溶液的制备：供试品溶液的制备：取本品10g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，加热水50mL，振摇使溶解，分别用60mL、40mL、40mL、40mL的水饱和的正丁醇振摇提取四次，合并正丁醇液，用氨试液洗涤3次，每次40mL，弃去氨液，回收正丁醇至干，残渣加水10mL使溶解，通过D101大孔吸附树脂柱，以水50mL洗脱，弃去水液；再用40％乙醇50mL洗脱，弃去40％乙醇洗脱液，继用70％乙醇150mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并移至2mL的量瓶内，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
（4）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，进行检测。
所述治疗过敏性哮喘的药物的检测方法，该药物是由以下重量份的原料制成的：甘松1～2重量份，甘青铁线莲1～2重量份；该药物采用如下方法制备：
（1）取甘松、甘青铁线莲，将其进行水蒸气蒸馏提取，从中提取挥发油，得挥发油提取物Ⅰ，备用；
（2）将甘松、甘青铁线莲水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤，得蒸馏后的水溶液，加热浓缩，得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ，备用；保留水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，备用；
（3）取步骤（2）所得水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小时，合并乙醇提取液，滤过，得乙醇提取液，回收乙醇并浓缩，得乙醇提取浓缩液Ⅳ，备用；保留乙醇提取后的药渣Ⅴ，备用；
（4）将步骤（3）所得乙醇提取后的药渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，得水提取浓缩液Ⅵ；
（5）将步骤（3）所得乙醇提取浓缩液Ⅳ、步骤（4）所得水提取浓缩液Ⅵ、步骤（2）所得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ合并，混匀，干燥，粉碎，再加入步骤（1）所得挥发油提取物Ⅰ，混匀，装入胶囊即得。
其检测方法为：采用气相色谱法对甘松薁醇、角鲨烯进行含量测定：
（1）色谱条件：色谱柱：HP-5型毛细管柱；检测器：氢火焰离子化检测器；载气：N2，流量：35mL·mL-1；氢气流量：50mL·mL-1；空气流量：480mL·min-1；分流比：9：1；进样口温度：270℃，检测器温度320℃；程序升温：初始60℃，每分钟10℃升至140℃，每分钟20℃升至280℃，保持6min；内标法；
（2）内标溶液的制备：取环己酮适量，加无水乙醇溶解并稀释制成每1mL含15.0mg的溶液，摇匀，作为内标溶液；
（3）供试品溶液的制备：精密量取本品1.0mL，置10mL容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，再精密量取1.0mL，置10mL容量瓶中，精密加入内标溶液1.0mL，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀；
（4）对照品溶液的制备：精密称取甘松薁醇对照品、角鲨烯对照品适量，加无水乙醇溶解并稀释制成含甘松薁醇0.350mg·mL-1及角鲨烯0.850mg·mL-1的对照品储备溶液，备用；
（5）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各10μL，注入气相色谱仪，进行检测。
一种由甘松、甘青铁线莲制成的药物在制备治疗支气管哮喘药物中的应用，该药物是由以下重量份的原料制成的：甘松1～2重量份，甘青铁线莲1～2重量份。
一种由甘松、甘青铁线莲制成的药物在制备治疗黄褐斑药物中的应用，该药物是由以下重量份的原料制成的：甘松1～2重量份，甘青铁线莲1～2重量份。
实验一：对延缓过敏性哮喘的处方与活性部位的药效学筛选实验研究
1 材料
1.1 药物与试剂
1.1.1 药物甲：
药物处方：甘松500g，甘青铁线莲500g
制备方法：
（1）取甘松500g、甘青铁线莲500g，将其进行水蒸气蒸馏提取，从中提取挥发油，得挥发油提取物Ⅰ，备用；
（2）将甘松、甘青铁线莲水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤，得蒸馏后的水溶液，加热浓缩，得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ，备用；保留水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，备用；
（3）取步骤（2）所得水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小时，合并乙醇提取液，滤过，得乙醇提取液，回收乙醇并浓缩，得乙醇提取浓缩液Ⅳ，备用；保留乙醇提取后的药渣Ⅴ，备用；
（4）将步骤（3）所得乙醇提取后的药渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，得水提取浓缩液Ⅵ；
（5）将步骤（3）所得乙醇提取浓缩液Ⅳ、步骤（4）所得水提取浓缩液Ⅵ、步骤（2）所得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ合并，混匀，干燥，粉碎，再加入步骤（1）所得挥发油提取物Ⅰ，混匀，即得药物甲。
1.1.2 药物乙：
药物处方：甘松500g，甘青铁线莲500g
制备方法：取甘松500g、甘青铁线莲500g，加5倍量水煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，干燥，即得药物乙。；
1.1.3 药物丙：
药物处方：甘青铁线莲1000g
制备方法：
（1）取甘青铁线莲1000g，将其进行水蒸气蒸馏提取，从中提取挥发油，得挥发油提取物Ⅰ，备用；
（2）将甘青铁线莲水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤，得蒸馏后的水溶液，加热浓缩，得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ，备用；保留水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，备用；
（3）取步骤（2）所得水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小时，合并乙醇提取液，滤过，得乙醇提取液，回收乙醇并浓缩，得乙醇提取浓缩液Ⅳ，备用；保留乙醇提取后的药渣Ⅴ，备用；
（4）将步骤（3）所得乙醇提取后的药渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，得水提取浓缩液Ⅵ；
（5）将步骤（3）所得乙醇提取浓缩液Ⅳ、步骤（4）所得水提取浓缩液Ⅵ、步骤（2）所得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ合并，混匀，干燥，粉碎，再加入步骤（1）所得挥发油提取物Ⅰ，混匀，即得药物丙；
1.1.4 药物丁：
药物处方：甘松1000g
制备方法：
（1）取甘松1000g，将其进行水蒸气蒸馏提取，从中提取挥发油，得挥发油提取物Ⅰ，备用；
（2）将甘松水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤，得蒸馏后的水溶液，加热浓缩，得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ，备用；保留水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，备用；
（3）取步骤（2）所得水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小时，合并乙醇提取液，滤过，得乙醇提取液，回收乙醇并浓缩，得乙醇提取浓缩液Ⅳ，备用；保留乙醇提取后的药渣Ⅴ，备用；
（4）将步骤（3）所得乙醇提取后的药渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，得水提取浓缩液Ⅵ；
（5）将步骤（3）所得乙醇提取浓缩液Ⅳ、步骤（4）所得水提取浓缩液Ⅵ、步骤（2）所得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ合并，混匀，干燥，粉碎，再加入步骤（1）所得挥发油提取物Ⅰ，混匀，即得药物丁。
醋酸地塞米松片：规格0.75mg/片，批号：160523421，浙江仙琚制药股份有限公司；卵白蛋白OVA，上海抚生生物科技有限公司；氢氧化铝Al(OH)3，上海跃江钛白化工制品有限公司；其他试剂均为市售分析纯。血清总IgE免疫放射分析测定盒，上海放射免疫分析技术研究有限公司，批号20160510；IL-4、IL-5、IFN-γ放免试剂盒，上海放射免疫分析技术研究有限公司，批号20160314。
1.2 动物
SD大鼠，雄性，体质量180～220 g，甘肃中医药大学医学实验中心提供，动物合格证号：SCXK（甘）2011-0001-0001011；实验设施合格证号：SYXK（甘）2011-0001-0000314；饲养于甘肃中医药大学医学实验中心，动物饲养于标准条件下，12h明暗交替，（22±2）℃，自由摄食饮水。动物在上述环境中适应性饲养1周后开始实验。
1.3 仪器
全自动生化仪，济南格利特科技有限公司；403C压缩空气式雾化器，北京普朗新技术有限公司生产；CKX41SF倒置显微镜，苏州景通仪器显微镜公司；Invitvogcn细胞计数仪，上海微科生物技术有限公司。
方法
2.1 模型建立及给药方法
取84只大鼠随机分成7组，每组12只。分别为：空白对照组，模型对照组，地塞米松组0.65 mg/kg，药物甲组5.0 g/kg、药物乙组5.0 g/kg、药物丙组5.0 g/kg、药物丁组5.0 g/kg；各药物均以0.5%CMC-Na溶液配置，空白对照组与模型对照组给予等量0.5% CMC-Na溶液。
除正常对照组外，其余各组在第1天和第7天每只腹腔内注射抗原混液（OVA 50mg， 氢氧化铝100mg，溶于1mL生理盐水配成混悬液）致敏。第14天开始用1% OVA超声雾化吸入而激发，每两天1次，每次60min，共2周。正常对照组大鼠于第1天和第7天腹腔注射生理盐水1mL，第14天开始用生理盐水超声雾化吸入，每两天1次，每次60min，共2周。地塞米松组和受试药物组大鼠从第14天开始灌胃相应药物，1mL/100g，共2周。正常对照组和哮喘模型组大鼠于第14天灌胃等量0.5% CMC-Na溶液，共2周。
2.2 指标检测
2.2.1 细胞因子测定
末次给药60min后，10%水合氯醛0.35g/kg腹腔注射麻醉，腹主动脉采血，于4 ℃ 3000r/min离心15min分离血清，-70 ℃保存，根据试剂盒说明方法进行IL-4、IL-5和IFN-γ、IgE测定。
2.2.2 支气管肺泡灌洗（BALF）及标本采集
各组大鼠最后一次激发1h后，每只大鼠以10%水合氯醛0.35g/kg腹腔注射麻醉后，腹主动脉取血致死。消毒并打开胸腔，结扎右侧主支气管，用灌胃针插入气管，固定后，行左侧肺肺泡灌洗术。缓慢注入生理盐水5mL停留10s，缓慢回抽，重复3次；回收液约4mL。回收液立即注入EP管，4 ℃1500r/min离心15min，取适量沉淀作细胞涂片，瑞氏-姬姆萨法染色，按形态学标准进行嗜酸性粒细胞（EOS）计数。余下沉淀用4mL生理盐水重新稀释后，进行白细胞总数计数。
2.2.3 肺组织形态学检测
大鼠腹主动脉放血处死后，取右肺中叶置于4%的多聚甲醛溶液中固定24h，常规石蜡包埋切片，HE染色，镜下观察支气管肺组织病理特征。根据病变严重程度进行评分：1分（轻度病变），病变区域约占整个制片区域的12%～25%；2分（中度病变），病变区域约占整个制片区域的25%～50%；3分（重度病变），病变区域约占50%～75%；4分（极重度病变），病变区域＞75%；0.5分（轻微病变）病变区域＜12%；各部位无明显病变为0分（正常）。
统计方法
数据以均数±标准差表示（±s），量反应资料统计方法采用单因素方差分析检验法，统计软件SPSS16.0。
实验结果
4.1 药物对血清IgE、IL-4、IL-5及IFN-γ的影响
结果由表1可见，与正常组比较，模型组血清中抗原特异性IgE水平明显升高，对血清中IL-4、IL-5和IFN-γ的测定表明IL-4、IL-5明显升高，而IFN-γ明显降低，表现为Th2型的细胞因子占优势，差异具有显著意义（P﹤0.01）。
与模型组比较，地塞米松组与药物甲组的IgE、IL-4、IL-5含有量均明显降低，IFN-γ显著升高，差异具有极显著的统计学意义（P﹤0.01）。
与模型组比较，药物乙组的IgE、IL-4、IL-5含有量均明显降低，IFN-γ显著升高，差异具有统计学意义（P﹤0.05）。
与模型组比较，药物丙组和丁组的IgE、IL-4、IL-5含有量也均降低，IFN-γ升高，但差异不具有统计学意义（P＞0.05）。
表1 药物对过敏性哮喘大鼠气道细胞因子的影响（±s，n=12）
注：与正常组比较，#P<0.05，##P <0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01
4.2 BALF中白细胞总数
结果由表2可见，与正常组相比，模型组大鼠BALF中白细胞总数升高，差异显著（P﹤0.01）。与模型组比较，地塞米松组与药物甲组可降低白细胞总数，具有极显著的差异（P﹤0.01）。与模型组比较，药物乙组也可降低白细胞总数，具有显著的差异（P﹤0.05）。与模型组比较，药物丙组和丁组也可降低白细胞总数，但不具有显著的差异（P＞0.05）。
与正常组相比，模型组大鼠BALF中EOS细胞数升高，差异显著（P﹤0.01）；与模型组比较，地塞米松组与药物甲组可降低EOS细胞数，具有极显著的差异（P﹤0.01）。与模型组比较，药物乙组也可降低EOS细胞数，具有显著的差异（P﹤0.05）。与模型组比较，药物丙组和丁组也可降低EOS细胞数，但不具有显著的差异（P＞0.05）
表2药物粒对过敏性哮喘大鼠BALF中细胞总数及EOS的影响（±s，n=12）
#P与正常组比较P<0.05，##P与正常组比较P<0.01
*P与模型组比较P<0.05，**P与模型组比较P<0.01
4.3 肺组织形态学
结果由表3与附图1至附图7可见，正常对照组动物的鼻中隔黏膜组织结构正常，无明显炎细胞浸润；模型组大鼠肺组织肺泡壁和间质充血、有炎细胞浸润，炎细胞类型以嗜酸性粒细胞和单核巨噬细胞为主，肺泡腔内无渗出物。肺组织明显肺气肿，肺泡腔增大，肺泡壁变薄，肺泡有融合现象。支气管分泌增多，可见轻度或中度淡蓝染色的粘液性分泌物。
地塞米松组大鼠肺泡壁有轻度炎细胞浸润，肺泡壁有轻度充血，肺内支气管分泌增多，病变评分与模型组比较，差异极显著（P﹤0.01）。药物甲组肺泡壁有轻度炎细胞浸润，肺内小支气管壁腔内可见极少量粘液性分泌物，病变评分与模型组比较，差异极显著（P﹤0.01）。药物乙组肺泡壁有轻度炎细胞浸润，肺内小支气管壁腔内可见少量粘液性分泌物，病变评分与模型组比较，差异显著（P﹤0.05）。药物丙组和丁组肺泡壁有炎细胞浸润，肺内小支气管壁腔内可见粘液性分泌物，病变评分与模型组比较，差异不显著（P＞0.05）。
表3 药物对过敏性哮喘大鼠肺组织病理评分的影响（±s，n=12）
#P与正常组比较P<0.05，##P与正常组比较P<0.01
*P与模型组比较P<0.05，**P与模型组比较P<0.01
5 结论
本研究通过检测过敏性哮喘大鼠血清IL-4、IL-5、IFN-γ和IgE含有量的变化，BALF中白细胞总数和EOS细胞数变化，反映嗜酸性粒细胞和炎性因子的状况，结果表明，药物甲能降低过敏性哮喘大鼠血清IL-4、IL-5和IgE含有量，升高IFN-γ水平，降低BALF中细胞总数和EOS细胞数，与模型对照组比较有显著差异（P<0.01）。药物甲具有减轻大鼠气道炎性细胞和EOS浸润，改善哮喘气道炎症症状，为预防和治疗过敏性哮喘提供了理论依据。药物乙也具有良好的作用效果，但效果不如药物甲的作用效果优异。药物丙和药物丁也具有一定的作用效果，但不明显。由此可见，本发明药物中两种药味之间的配伍精良，缺一不可，特别是在特定的制备方法下，两种药味之间的组合产生了明显的协同增效作用，产生了一加一大于二的技术效果。
实验二：高效液相色谱法测定药物中甘松根酮含量
本实验采用HPLC-ELSD法检测本发明药物中甘松根酮含量，并进行了方法学考察，结果表明，此方法精密度、重现性良好，回收率实验结果符合要求，测定迅速、准确，为制定该制剂专属性的控制标准提供依据。
仪器与试药
Waters高效液相色谱仪，Waters2420蒸发光散射检测器，Eemper色谱工作站； D101大孔吸附树脂柱（内径1.5cm，长12cm）。
药物：药物处方：甘松500g，甘青铁线莲500g
制备方法：（1）取甘松500g、甘青铁线莲500g，将其进行水蒸气蒸馏提取，从中提取挥发油，得挥发油提取物Ⅰ，备用；
（2）将甘松、甘青铁线莲水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤，得蒸馏后的水溶液，加热浓缩，得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ，备用；保留水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，备用；
（3）取步骤（2）所得水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小时，合并乙醇提取液，滤过，得乙醇提取液，回收乙醇并浓缩，得乙醇提取浓缩液Ⅳ，备用；保留乙醇提取后的药渣Ⅴ，备用；
（4）将步骤（3）所得乙醇提取后的药渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，得水提取浓缩液Ⅵ；
（5）将步骤（3）所得乙醇提取浓缩液Ⅳ、步骤（4）所得水提取浓缩液Ⅵ、步骤（2）所得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ合并，混匀，干燥，粉碎，再加入步骤（1）所得挥发油提取物Ⅰ，混匀，即得药物甲。
甘松根酮对照品（南京广润生物制品有限公司，批号：1402-20141025）；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Agilent zorbax-C18（150×4.6mm，5μm）；流动相：比例为33:67的乙腈-0.05%磷酸溶液；柱温：30℃；流速：1mL/min；Waters 2420蒸发光散射检测条件：漂移管温度：43℃；雾化器温度：35℃；氮气压力：25Psi。
系统适用性实验
在上述条件下，测定样品中甘松根酮的含量，理论板数以甘松根酮峰计算大于3000，分离度、拖尾因子符合规定。
溶液的制备
2.3.1对照品溶液的制备
精密称取80℃干燥至恒重的甘松根酮对照品适量，加甲醇溶解制成每1mL含1mg的对照品溶液。
2.3.2 供试品溶液的制备
取本品10g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，加热水50mL， 振摇使溶解，分别用60mL、40mL、40mL、40mL的水饱和的正丁醇振摇提取四次，合并正丁醇液，用氨试液洗涤3次，每次40mL，弃去氨液，回收正丁醇至干，残渣加水10mL使溶解，通过D101大孔吸附树脂柱（内径1.5cm，长12cm），以水50mL洗脱，弃去水液；再用40％乙醇50mL洗脱，弃去40％乙醇洗脱液，继用70％乙醇150mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并移至2mL的量瓶内，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
2.3.3 阴性供试品溶液的制备
按处方组成，取除甘松外的其余药材和辅料按工艺要求制成缺甘松的阴性样品，同供试品溶液制备方法制得阴性供试品溶液。
空白试验
精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，结果表明，阴性供试品对甘松根酮峰无干扰。如附图8、附图9和附图10所示。
线性关系考察
按“2.3.1” 项下的方法制备甘松根酮对照品溶液（1.000mg/mL），分别精密吸取对照品溶液1μL、2μL、4μL、6μL、8μL、10μL注入液相色谱仪，按照上述色谱条件进行试验，以进样量（μg）的对数为横坐标，以峰面积的对数为纵坐标，绘制标准曲线，得出回归方程及相关系数为：Y = 1.8462X + 6.3245，R=0.9999，结果表明甘松根酮在0.951μg～18.654μg范围内进样量的对数与峰面积的对数呈良好的线性关系。
精密度试验
精密吸取上述对照品溶液10μL，重复进样6次，测定甘松根酮峰面积的积分值，考察进样精密度。经测定RSD为2.10%，表明本法精密度较好。
稳定性试验
取本品（批号：150125），按“2.3.2项下”甘松根酮的供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12h进样5μL注入液相色谱仪，测定其峰面积，考察其稳定性。试验结果得RSD为2.17%，供试品溶液在12h内基本稳定。
重复性试验
取本品（批号：150125）5份，按“2.3.2项下”甘松根酮的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，进行测定，计算含量，结果表明甘松根酮平均含量为1.09mg/g，RSD为2.19%，说明该法测定甘松根酮的含量重现性良好。
加样回收率试验
取本品（批号：150125），称取 5份，每份约5g，精密称定，分别精密加入浓度为0.58mg/mL甘松根酮对照品1mL，按“2.4项下”甘松根酮的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，进行含量测定。经计算平均加样回收率为98.38%，RSD为1.29%，表明该方法回收率良好。
样品含量测定
取10批本发明药物成品，每批2份，按“2.3.2项下”甘松根酮的的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液5μL与10μL、供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，进行测定。结果见下表4。
表4 样品中甘松根酮含量测定结果
根据10批成品中甘松根酮的测量结果，初步拟定为本品每g含甘松根酮不得低于1.20mg。
结论
用本方法对样品进行含量测定，可排除背景干扰，且操作简便、结果准
确、重现性好，可用于本发明药物的检测。
实验三：不同药物中甘松根酮的含量测定
1 待测样品
1.1 药物甲：
药物处方：甘松500g，甘青铁线莲500g
制备方法：
（1）取甘松500g、甘青铁线莲500g，将其进行水蒸气蒸馏提取，从中提取挥发油，得挥发油提取物Ⅰ，备用；
（2）将甘松、甘青铁线莲水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤，得蒸馏后的水溶液，加热浓缩，得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ，备用；保留水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，备用；
（3）取步骤（2）所得水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小时，合并乙醇提取液，滤过，得乙醇提取液，回收乙醇并浓缩，得乙醇提取浓缩液Ⅳ，备用；保留乙醇提取后的药渣Ⅴ，备用；
（4）将步骤（3）所得乙醇提取后的药渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，得水提取浓缩液Ⅵ；
（5）将步骤（3）所得乙醇提取浓缩液Ⅳ、步骤（4）所得水提取浓缩液Ⅵ、步骤（2）所得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ合并，混匀，干燥，粉碎，再加入步骤（1）所得挥发油提取物Ⅰ，混匀，即得药物甲。
1.2 药物乙：
药物处方：甘松500g，甘青铁线莲500g
制备方法：取甘松500g、甘青铁线莲500g，加5倍量水煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，干燥，即得药物乙。；
1.3 药物丙：
药物处方：甘青铁线莲1000g
制备方法：
（1）取甘青铁线莲1000g，将其进行水蒸气蒸馏提取，从中提取挥发油，得挥发油提取物Ⅰ，备用；
（2）将甘青铁线莲水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤，得蒸馏后的水溶液，加热浓缩，得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ，备用；保留水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，备用；
（3）取步骤（2）所得水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小时，合并乙醇提取液，滤过，得乙醇提取液，回收乙醇并浓缩，得乙醇提取浓缩液Ⅳ，备用；保留乙醇提取后的药渣Ⅴ，备用；
（4）将步骤（3）所得乙醇提取后的药渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，得水提取浓缩液Ⅵ；
（5）将步骤（3）所得乙醇提取浓缩液Ⅳ、步骤（4）所得水提取浓缩液Ⅵ、步骤（2）所得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ合并，混匀，干燥，粉碎，再加入步骤（1）所得挥发油提取物Ⅰ，混匀，即得药物丙；
1.4 药物丁：
药物处方：甘松1000g
制备方法：
（1）取甘松1000g，将其进行水蒸气蒸馏提取，从中提取挥发油，得挥发油提取物Ⅰ，备用；
（2）将甘松水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤，得蒸馏后的水溶液，加热浓缩，得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ，备用；保留水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，备用；
（3）取步骤（2）所得水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小时，合并乙醇提取液，滤过，得乙醇提取液，回收乙醇并浓缩，得乙醇提取浓缩液Ⅳ，备用；保留乙醇提取后的药渣Ⅴ，备用；
（4）将步骤（3）所得乙醇提取后的药渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，得水提取浓缩液Ⅵ；
（5）将步骤（3）所得乙醇提取浓缩液Ⅳ、步骤（4）所得水提取浓缩液Ⅵ、步骤（2）所得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ合并，混匀，干燥，粉碎，再加入步骤（1）所得挥发油提取物Ⅰ，混匀，即得药物丁。
2 测定方法
采用本发明实验二提供的高效液相色谱法测定各个药物中的甘松根酮的含量。
3 测定结果
测定结果见表5。
表5 样品含量测定结果
4 讨论与结论
从表5中可以看出，药物甲中的甘松根酮的含量明显高于其他药物，这可能也是药物甲在治疗过敏性哮喘方面的效果优于其他药物的原因。
实验四：气相色谱法同步测定药物中甘松薁醇、角鲨烯的含量
1仪器与试药
Agilent7890N气相色谱仪：FID检测器，A.01.12.1色谱工作站；SGH-300高纯氢气发生器（广州步步宏科学仪器设备有限公司）；色谱柱弹性石英毛细管柱（30m×0.25mm，0.32μm）；梅特勒－托利多十万分之一电子分析天平；甘松薁醇对照品（含量99.9%，上海哈灵生物有限公司）；角鲨烯对照品（含量99.9%，广州卡芬生物科技有限公司）。
药物：处方：甘松500g，甘青铁线莲500g
制备方法：
（1）取甘松500g、甘青铁线莲500g，将其进行水蒸气蒸馏提取，从中提取挥发油，得挥发油提取物Ⅰ，备用；
（2）将甘松、甘青铁线莲水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤，得蒸馏后的水溶液，加热浓缩，得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ，备用；保留水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，备用；
（3）取步骤（2）所得水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小时，合并乙醇提取液，滤过，得乙醇提取液，回收乙醇并浓缩，得乙醇提取浓缩液Ⅳ，备用；保留乙醇提取后的药渣Ⅴ，备用；
（4）将步骤（3）所得乙醇提取后的药渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，得水提取浓缩液Ⅵ；
（5）将步骤（3）所得乙醇提取浓缩液Ⅳ、步骤（4）所得水提取浓缩液Ⅵ、步骤（2）所得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ合并，混匀，干燥，粉碎，再加入步骤（1）所得挥发油提取物Ⅰ，混匀，即得。
试剂：环己酮，无水乙醇均为色谱纯。
2色谱条件
色谱柱：HP-5型毛细管柱（30m×0.25mm，0.32μm）；检测器：氢火焰离子化检测器（FID），载气：N2流量：35mL·mL-1；氢气流量：50mL·mL-1；空气流量：480mL·min-1；分流比：9：1；进样口温度：270℃，检测器温度320℃；程序升温：初始60℃，每分钟10℃升至140℃，每分钟20℃升至280℃，保持6min；内标法。
3试验方法与结果
3.1内标溶液的制备
取环己酮适量，加无水乙醇溶解并稀释制成每1g含15.0mg的溶液，摇匀，作为内标溶液。
3.2供试品溶液的制备
精密量取本品1.0g，置10mL容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，再精密量取1.0mL，置10mL容量瓶中，精密加入内标溶液1.0mL，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀。
3.3对照品储备溶液的制备
精密称取甘松薁醇对照品、角鲨烯对照品适量，加无水乙醇溶解并稀释制成含甘松薁醇0.350mg·mL-1及角鲨烯0.850mg·mL-1的对照品储备溶液，备用；
3.4阴性对照溶液的制备
取按处方中未加甘松薁醇与角鲨烯的空白溶液，按“3.2”项下制备方法，制成阴性对照溶液。
3.5线性关系的考察
分别精密移取0.2、0.5、1.0、1.5、3.5mL对照品储备液于10mL容量瓶中，加内标溶液1.0mL，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，分别取1μL进样，记录色谱图，以甘松薁醇、角鲨烯与内标的峰面积比值为纵坐标（Y），浓度（C）为横坐标（X），分别绘制标准曲线，得回归方程分别为：Y（甘松薁醇）=1.1268X－0.0167，R2=0.9999，甘松薁醇浓度在0.095～2.852mg·mL-1范围内，线性关系良好；Y（角鲨烯）=1.1569X+0.0136，R2=0.9999，角鲨烯浓度在0.098～3.269mg·mL-1范围内，线性关系良好。
3.6精密度试验
取甘松薁醇浓度为0.230mg·mL-1和角鲨烯浓度为0.290mg·mL-1的对照品溶液，重复进样6次，记录峰面积，分别计算2种成分与内标的峰面积比值（A/A内标），甘松薁醇、角鲨烯的RSD分别为0.18%和0.56%（n=6）。
3.7重复性试验
取同一批样品，按样品测定项下的方法重复测定6次，结果甘松薁醇、角鲨烯的RSD分别为0.29%、0.75%（n=6）。
3.8稳定性试验
取同一批样品溶液，分别在室温下放置0、2、4、6、8、12h后测定，结果按甘松薁醇、角鲨烯的RSD分别为0.45%、0.51%，说明样品溶液在12h内测定，结果稳定。
3.9加样回收率试验
取已知含量的样品溶液9份，并加入适当的低、中、高对照品溶液，按样品测定法测定甘松薁醇、角鲨烯含量，分别计算回收率，结果见表6。
表6 回收率测定结果（n=8，%）
结果表明，本方法的回收率较好，甘松薁醇的回收率分别在99.6%～100.8%，角鲨烯的回收率在98.6%～101.6%之间，相对标准偏差分别为0.32%与0.75%，本测定方法能满足药物中甘松薁醇与角鲨烯的含量测定。
3.10耐用性试验
经不同色谱柱考察和溶液稳定性考察，以及柱温，进样口温度和检测器温度考察，表明本方法耐用性良好，适用于药物中两组分的含量测定。
3.11色谱柱的影响
选用3根不同商品规格的色谱柱，测定同一批样品的含量，计算含量值的RSD%分别为1.2、1.5、1.7。结果表明，样品用不同的PEG色谱柱测定含量，甘松薁醇、角鲨烯与内标均可有效分离，说明方法耐用性良好。
3.12柱温的影响
柱温对分离的影响主要为影响主峰的出峰时间，温度越高，主峰出峰时间越短，在第一阶段为90℃时，甘松薁醇主峰甘松薁醇与杂质峰能保证基线分离，第二阶段160℃时角鲨烯主峰与杂质峰能保证基线分离，且各温度下含量的RSD小于2.0%。
3.13进样口温度的影响
进样口温度高于柱温时，甘松薁醇与杂质峰能够保证基线分离，角鲨烯与杂质分离良好，且各温度下含量的RSD小于2.0%。
3.14检测器温度的影响
检测器温度高于进样口温度时，甘松薁醇与杂质峰能够保证基线分离，角鲨烯与杂质分离良好，且各温度下含量的RSD小于2.0%。
3.15样品含量测定结果
经过方法学验证，本含量测定方法操作简便、准确度高、重现性好，能更有效地控制产品。因此应用该方法对10批样品，按照前述方法采用内标法进行含量测定，结果见表7。
表7 样品含量测定结果
4讨论
4.1系统适应性试验
在本试验气相色谱系统下，分别吸取样品测定用混合对照品溶液、供试品溶液与阴性对照溶液各1μL，记录色谱图。2种组分与内标物均能够较好地分离，阴性无干扰。该系统适应性结果见表8。
表8 系统适应性试验
4.2内标物的选择
曾试用过环己酮、萘、联苯、水杨酸甲酯等，因样品挥发性成分多，结果以环己酮的保留时间及分离效果最合适。
4.3柱温的选择
甘松薁醇、环己酮和角鲨烯的沸点相差比较大，柱温低时，角鲨烯的保留时间过长，柱温高时，甘松薁醇与杂质不能有效分离，经采用两段程序升温方式能满足两种成分的同时分析。
4.4本品的含量限度
由10批次产品测定结果，暂定本品的含量限度为：本品每1g含甘松薁醇不得少于0.200mg，含角鲨烯不得少于0.200mg。
本方法对2种成分同时进行分离与检测，方法快速、灵敏，分离度好、专属性好，能有效地控制药品。
实验五：不同药物中甘松薁醇、角鲨烯的含量测定
1 待测样品
1.1 药物甲：
药物处方：甘松500g，甘青铁线莲500g
制备方法：
（1）取甘松500g、甘青铁线莲500g，将其进行水蒸气蒸馏提取，从中提取挥发油，得挥发油提取物Ⅰ，备用；
（2）将甘松、甘青铁线莲水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤，得蒸馏后的水溶液，加热浓缩，得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ，备用；保留水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，备用；
（3）取步骤（2）所得水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小时，合并乙醇提取液，滤过，得乙醇提取液，回收乙醇并浓缩，得乙醇提取浓缩液Ⅳ，备用；保留乙醇提取后的药渣Ⅴ，备用；
（4）将步骤（3）所得乙醇提取后的药渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，得水提取浓缩液Ⅵ；
（5）将步骤（3）所得乙醇提取浓缩液Ⅳ、步骤（4）所得水提取浓缩液Ⅵ、步骤（2）所得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ合并，混匀，干燥，粉碎，再加入步骤（1）所得挥发油提取物Ⅰ，混匀，即得药物甲。
1.2 药物乙：
药物处方：甘松500g，甘青铁线莲500g
制备方法：取甘松500g、甘青铁线莲500g，加5倍量水煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，干燥，即得药物乙。；
1.3 药物丙：
药物处方：甘青铁线莲1000g
制备方法：
（1）取甘青铁线莲1000g，将其进行水蒸气蒸馏提取，从中提取挥发油，得挥发油提取物Ⅰ，备用；
（2）将甘青铁线莲水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤，得蒸馏后的水溶液，加热浓缩，得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ，备用；保留水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，备用；
（3）取步骤（2）所得水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小时，合并乙醇提取液，滤过，得乙醇提取液，回收乙醇并浓缩，得乙醇提取浓缩液Ⅳ，备用；保留乙醇提取后的药渣Ⅴ，备用；
（4）将步骤（3）所得乙醇提取后的药渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，得水提取浓缩液Ⅵ；
（5）将步骤（3）所得乙醇提取浓缩液Ⅳ、步骤（4）所得水提取浓缩液Ⅵ、步骤（2）所得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ合并，混匀，干燥，粉碎，再加入步骤（1）所得挥发油提取物Ⅰ，混匀，即得药物丙；
1.4 药物丁：
药物处方：甘松1000g
制备方法：
（1）取甘松1000g，将其进行水蒸气蒸馏提取，从中提取挥发油，得挥发油提取物Ⅰ，备用；
（2）将甘松水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤，得蒸馏后的水溶液，加热浓缩，得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ，备用；保留水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，备用；
（3）取步骤（2）所得水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小时，合并乙醇提取液，滤过，得乙醇提取液，回收乙醇并浓缩，得乙醇提取浓缩液Ⅳ，备用；保留乙醇提取后的药渣Ⅴ，备用；
（4）将步骤（3）所得乙醇提取后的药渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，得水提取浓缩液Ⅵ；
（5）将步骤（3）所得乙醇提取浓缩液Ⅳ、步骤（4）所得水提取浓缩液Ⅵ、步骤（2）所得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ合并，混匀，干燥，粉碎，再加入步骤（1）所得挥发油提取物Ⅰ，混匀，即得药物丁。
2 测定方法
采用本发明实验四提供的气相色谱法同步测定甘松薁醇、角鲨烯的含量的方法，进行测定。
3 测定结果
测定结果见表9
表9 样品含量测定结果
4 讨论与结论
从表9中可以看出，药物甲中的甘松薁醇、角鲨烯的含量明显高于其他药物，这可能也是药物甲在治疗过敏性哮喘方面的效果优于其他药物的原因。
实验六：安全性评价实验
1 材料
受试药物：
处方：甘松500g，甘青铁线莲500g
制备方法：
（1）取甘松500g、甘青铁线莲500g，将其进行水蒸气蒸馏提取，从中提取挥发油，得挥发油提取物Ⅰ，备用；
（2）将甘松、甘青铁线莲水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤，得蒸馏后的水溶液，加热浓缩，得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ，备用；保留水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，备用；
（3）取步骤（2）所得水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小时，合并乙醇提取液，滤过，得乙醇提取液，回收乙醇并浓缩，得乙醇提取浓缩液Ⅳ，备用；保留乙醇提取后的药渣Ⅴ，备用；
（4）将步骤（3）所得乙醇提取后的药渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，得水提取浓缩液Ⅵ；
（5）将步骤（3）所得乙醇提取浓缩液Ⅳ、步骤（4）所得水提取浓缩液Ⅵ、步骤（2）所得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ合并，混匀，干燥，粉碎，再加入步骤（1）所得挥发油提取物Ⅰ，混匀，即得受试药物。
动物：昆明种小鼠，体重18～20g，Wistar大鼠，体重90～100g，均雌雄各半，甘肃中医药大学医学实验中心提供，动物合格证号：SCXK（甘）2011-0001-0001011；实验设施合格证号：SYXK（甘）2011-0001-0000314；饲养于甘肃中医药大学医学实验中心。
2 方法
2.1 急性毒性实验
预实验测不出LD50，因此测定受试药物的最大给药量。取体重18～20g的小鼠20只，雌雄各半，禁食不禁水15h，以0.4mL/10g的给容积灌胃给予62.5%受试药物浸膏粉水溶液，每隔4h给药1次，共给药2次，两次累计给药剂量为220g生药/kg.观察给药后2h以及7内的小鼠反应。
2.2 慢性毒性实验
将购入的5周龄大鼠，预饲养1周再用于正式实验。大鼠按体重随机分成对照组、受试药物高剂量组（80g生药/kg）、低剂量组（20生药/kg）4组，每组20只，雌雄各半，分笼常规饲养，调室温18～20℃，湿度40%～60%，自由摄食饮水。
将受试药物浸膏粉每日上午灌胃给药，对照组灌胃等容积的蒸馏水，每周称1次体重并记录摄食量，根据体重的变化重新计算给药量。试验期间观察大鼠外观、行为、大便等变化。给药后第14周末，受试药物高剂量组、受试药物低剂量组、空白对照组各随机抽取12只大鼠，皆雌雄各半，颈动脉采血处死，采血前禁食不禁水16h，检测血常规、血液生化指标，进行系统尸解，计算脏器系数，取材做组织学检查。剩余的动物停药正常饲养至18周末，颈动脉采血处死，检测的项目与14周末时相同，对各项检测结果进行组间t检验。结合行为体征、外观形态的观察进行组间对比分析，评价药物毒副反应。
3 结果
3.1 急性毒性实验
给药后，2h内小鼠无呼吸急促，无惊厥，无四肢抽搐无死亡等不良反应。10d的观察内均未见异常行为体征，并且无一例死亡。
3.2 慢性毒性实验
3.2.1 对大鼠行为体征，体重摄食量的影响
给药期间及恢复期对照组和各给药组大鼠被毛平顺、眼睛红亮有神、反应机敏、饮食正常、大便无粘液和稀溏等呈现出健康活泼的状态，体重、摄食量无明显差异，随周龄的增加而增加，增加速度随周龄的增加而减慢。
3.2.2 对大鼠血液生化指标的影响
血常规检测MK-6318K血细胞自动分析仪计数红细胞、血红蛋白、白细胞及白细胞分类、血小板。肝功能指标谷丙转氨酶和谷草转氨酶均采用IFCC推荐法，总胆红素采用对氨基苯磺酸重氮盐法，总蛋白采用双缩脲法，白蛋白采用溴甲酚绿法进行测定。肾功能指标尿素采用Talkes和chubert酶法，肌酐采用苦味酸法进行测定。总胆固醇采用酶法，碱性磷酸酶采用IFCC法，血糖采用葡萄糖氧化酶法进行测定。各实验组各指标给药14周末、恢复期末都在正常范围内，未见明显组间差异。结果见表10～表13。
表10 给药14周末对大鼠血常规的影响（±s）
表11 第14周末对大鼠肝功能的影响（±s）
表12 给药第14周末对大鼠肾功能的影响（±s）
表13 给药14周末对大鼠血糖、胆固醇、碱性磷酸酶的影响（±s）
3.2.3 系统尸解、脏器系数、组织学检查
在14周末及恢复期各组活杀的动物主要脏器肺、心脏、肝、胃、肾脏、前列腺、睾丸、子宫、卵巢、肾上腺、甲状腺、胸腺各脏器色泽、形态、位置关系正常，脏器间无粘连；脏器表面及内膜无瘀血、充血、出血点、水肿、糜烂、溃疡；胸腔、心包腔无积液等病理改变。脏器系数计算结果都在正常范围之内，各组均未见明显差异。
组织学检查：脏器组织用10%甲醛固定、石蜡切片、HE染色、光镜观察。镜下所见：各组均未见异常。组织学所见异常是偶发病变，与受试药无相关性。
4 结论
受试药物毒性较低，安全性高。
实验七：治疗过敏性鼻炎的实验研究
1实验材料
1.1实验动物
SPF级豚鼠，雌雄各半，体质量（210±20）g，由甘肃中医药大学医学实验中心提供，动物合格证号：SCXK（甘）2011-0001-0001011；实验设施合格证号：SYXK（甘）2011-0001-0000314；饲养于甘肃中医药大学医学实验中心。在温度（20±3）℃，相对湿度（45±15）%的环境条件下，自由饮水，固体饲料饲养10天后使用。
1.2受试药品
受试药物：
处方：甘松500g，甘青铁线莲500g
制备方法：
（1）取甘松500g、甘青铁线莲500g，将其进行水蒸气蒸馏提取，从中提取挥发油，得挥发油提取物Ⅰ，备用；
（2）将甘松、甘青铁线莲水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤，得蒸馏后的水溶液，加热浓缩，得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ，备用；保留水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，备用；
（3）取步骤（2）所得水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小时，合并乙醇提取液，滤过，得乙醇提取液，回收乙醇并浓缩，得乙醇提取浓缩液Ⅳ，备用；保留乙醇提取后的药渣Ⅴ，备用；
（4）将步骤（3）所得乙醇提取后的药渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，得水提取浓缩液Ⅵ；
（5）将步骤（3）所得乙醇提取浓缩液Ⅳ、步骤（4）所得水提取浓缩液Ⅵ、步骤（2）所得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ合并，混匀，干燥，粉碎，再加入步骤（1）所得挥发油提取物Ⅰ，混匀，即得受试药物。
辛芩颗粒（四川志远嘉宝药业有限责任公司生产）；
IgEELISA试剂盒（南京金益柏生物科技有限公司生产）；HAELISA试剂盒（上海慧颖生物科技有限公司生产）；OVA抗原试剂（广州优抗多生物技术有限公司生产）；氢氧化铝（山东淄博吉领铝业有限公司生产）；戊巴比妥钠（上海静融生物科技有限公司生产）。
1.3实验仪器
电子天平（上海丙林电子科技有限公司生产）；超声振荡仪（深圳市科工达超声设备有限公司生产）；XT－2000iv全自动血液分析仪（北京倍爱康生物技术股份有限公司生产）；KDC－160HR高速冷冻离心机（郑州宏朗仪器设备有限公司生产）；酶标仪（上海普林斯顿生物科技发展有限公司生产）。
2实验方法
2.1模型的建立
基础致敏：OVA和Al（OH）3以1：30的比例溶于生理盐水，使OVA浓度为0.1%，作为致敏剂。腹腔注射上述溶液1mL，每日1次，连续12天。空白对照组以等量生理盐水溶液代替。局部激发：间隔6日后，以5%OVA生理盐水溶液滴鼻激发，每侧鼻孔滴加50μl，隔日1次，连续5次。空白对照组以等量生理盐水代替。
2.2分组及给药
将SPF级豚鼠随机分成4组，每组12只，分别为空白对照组、辛芩颗粒对照组、模型组、受试药物组。
将AR级豚鼠随机分成4组，每组12只，分别为空白对照组、辛芩颗粒对照组、模型组、受试药物组。于局部激发第3次当日开始给药，受试药物组灌服受试药物6g/kg，辛芩颗粒对照组灌服辛芩颗粒6g/kg，空白对照组与模型组灌服同等容积的生理盐水。每日1次，连续6天。
2.3观测指标
2.3.1行为学观察
末次给药后40min内，记录豚鼠鼻分泌量、喷嚏及搔鼻次数，采用叠加量化计分法进行计分。即鼻痒：无挠鼻为0分，轻度挠鼻为1分，频繁挠鼻为2分，挠鼻不止为3分；喷嚏：30min内无喷嚏为0分，打喷嚏1～3个为1分，4～10个为2分，＞11个为3分；鼻涕：无鼻涕为0分，流至前鼻孔为1分，超出前鼻孔为2分，涕流满面为3分。
2.3.2血清生化指标
末次给药1h，戊巴比妥钠麻醉，肝门静脉采血用于HA和IgE的测定。
2.3统计学处理
所有数据以（±s）表示，组间比较使用t检验。
3结果
3.1对行为学的影响
如表14所示，模型组豚鼠出现大量清涕、频繁喷嚏、剧烈挠鼻等典型AR症状，说明造模成功。辛芩颗粒对照组症状积分明显低于模型组（P＜0.05）。受试药物组症状积分低于模型组，但无显著性差异（P＞0.05）。
表14 对AR豚鼠行为学的影响（±s）
注：与模型组比较，*P＜0.05
3.2对血清HA和IgE的影响
如表15所示，模型组AR豚鼠血清组胺和IgE水平明显高于空白对照组（P＜0.01），辛芩颗粒对照组AR豚鼠血清组胺和IgE水平低于模型组，差异显著（P＜0.05）。受试药物组AR豚鼠血清组胺和IgE也略水平低于模型组，但无显著意义（P＞0.05）。
表15 对血清HA和IgE水平的影响（±s）
注：与模型组比较，*P＜0.05。
3 结论
受试药物对过敏性鼻炎没有明显的治疗作用。
附图说明：
附图1：正常组大鼠大鼠肺组织病理显微图（HE×200）
附图2：模型组大鼠大鼠肺组织病理显微图（HE×200）
附图3：地塞米松组大鼠大鼠肺组织病理显微图（HE×200）
附图4：药物甲组大鼠大鼠肺组织病理显微图（HE×200）
附图5：药物乙组大鼠大鼠肺组织病理显微图（HE×200）
附图6：药物丙组大鼠大鼠肺组织病理显微图（HE×200）
附图7：药物丁组大鼠大鼠肺组织病理显微图（HE×200）
附图8：对照品溶液液相色谱图
附图9：供试品溶液液相色谱图
附图10：阴性供试品溶液液相色谱图
具体实施方式：
实施例1：药物
处方：甘松50g，甘青铁线莲50g
制备方法：
（1）取甘松、甘青铁线莲，将其进行水蒸气蒸馏提取，从中提取挥发油，得挥发油提取物Ⅰ，备用；
（2）将甘松、甘青铁线莲水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤，得蒸馏后的水溶液，加热浓缩，得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ，备用；保留水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，备用；
（3）取步骤（2）所得水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小时，合并乙醇提取液，滤过，得乙醇提取液，回收乙醇并浓缩，得乙醇提取浓缩液Ⅳ，备用；保留乙醇提取后的药渣Ⅴ，备用；
（4）将步骤（3）所得乙醇提取后的药渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，得水提取浓缩液Ⅵ；
（5）将步骤（3）所得乙醇提取浓缩液Ⅳ、步骤（4）所得水提取浓缩液Ⅵ、步骤（2）所得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ合并，混匀，干燥，粉碎，再加入步骤（1）所得挥发油提取物Ⅰ，混匀，即得。
实施例2：硬胶囊剂
药物处方：甘松500g，甘青铁线莲500g
制备方法：
（1）取甘松500g、甘青铁线莲500g，将其进行水蒸气蒸馏提取，从中提取挥发油，得挥发油提取物Ⅰ，备用；
（2）将甘松、甘青铁线莲水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤，得蒸馏后的水溶液，加热浓缩，得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ，备用；保留水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，备用；
（3）取步骤（2）所得水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小时，合并乙醇提取液，滤过，得乙醇提取液，回收乙醇并浓缩，得乙醇提取浓缩液Ⅳ，备用；保留乙醇提取后的药渣Ⅴ，备用；
（4）将步骤（3）所得乙醇提取后的药渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，得水提取浓缩液Ⅵ；
（5）将步骤（3）所得乙醇提取浓缩液Ⅳ、步骤（4）所得水提取浓缩液Ⅵ、步骤（2）所得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ合并，混匀，干燥，粉碎，再加入步骤（1）所得挥发油提取物Ⅰ，混匀，装入硬胶囊，制成1000粒。
采用高效液相色谱法对甘松根酮进行含量测定：
（1）色谱条件：色谱柱：Agilent zorbax-C18；流动相：比例为33:67的乙腈-0.05%磷酸溶液；柱温：30℃；流速：1mL/min；Waters 2420蒸发光散射检测条件：漂移管温度：43℃；雾化器温度：35℃；氮气压力：25Psi；进样量：10μL；
（2）对照品溶液制备：精密称取80℃干燥至恒重的甘松根酮对照品适量，加甲醇溶解制成每1mL含1mg的对照品溶液；
（3）供试品溶液的制备：供试品溶液的制备：取本品10g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，加热水50mL，振摇使溶解，分别用60mL、40mL、40mL、40mL的水饱和的正丁醇振摇提取四次，合并正丁醇液，用氨试液洗涤3次，每次40mL，弃去氨液，回收正丁醇至干，残渣加水10mL使溶解，通过D101大孔吸附树脂柱，以水50mL洗脱，弃去水液；再用40％乙醇50mL洗脱，弃去40％乙醇洗脱液，继用70％乙醇150mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并移至2mL的量瓶内，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
（4）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，进行检测，检测结果为甘松根酮的含量为0.1823mg/g。
采用气相色谱法对甘松薁醇、角鲨烯进行含量测定：
（1）色谱条件：色谱柱：HP-5型毛细管柱；检测器：氢火焰离子化检测器；载气：N2，流量，1.0mL·mL-1；氢气流量：50mL·mL-1；空气流量：480mL·min-1；分流比：9：1；进样口温度：270℃，检测器温度320℃；程序升温：初始60℃，每分钟10℃升至140℃，每分钟20℃升至280℃，保持6min；内标法；
（2）内标溶液的制备：取环己酮适量，加无水乙醇溶解并稀释制成每1mL含15.0mg的溶液，摇匀，作为内标溶液；
（3）供试品溶液的制备：精密量取本品1.0mL，置10mL容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，再精密量取1.0mL，置10mL容量瓶中，精密加入内标溶液1.0mL，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀；
（4）对照品溶液的制备：精密称取甘松薁醇对照品、角鲨烯对照品适量，加无水乙醇溶解并稀释制成含甘松薁醇0.350mg·mL-1及角鲨烯0.850mg·mL-1的对照品储备溶液，备用；
（5）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各10μL，注入气相色谱仪，进行检测。
（6）测定结果：本品每1g含甘松薁醇为0.225mg，含角鲨烯为0.231mg。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
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