OROBOL及其3′位羟基系列生长的修饰物在抗小RNA病毒科病毒感染中的应用的制作方法

本发明涉及药物化学领域，具体涉及异黄酮类天然产物3′，4′，5，7-四羟基异黄酮(OROBOL)及3′位羟基系列生长的修饰物在抗小RNA病毒科病毒感染中的应用。

用于制备预防和/或治疗含有3C蛋白酶的小RNA病毒科病毒感染的抗病毒药物中的用途。

背景技术：

小RNA病毒科病毒是一组颗粒直径为22～30nm大小，无膜，单正链RNA病毒，其基因组长度大约为10Kb个核苷酸左右，能在宿主细胞中复制繁殖。基于遗传组成和病毒翻译机制的不同，小RNA病毒科目前被分为六个属，其成员中有些是人和动物的重要病原体，包括肠道病毒属的柯萨奇病毒、口蹄疫病毒属的口蹄疫病毒、心病毒属的脑心肌炎病毒、肝病毒属的甲肝病毒和鼻病毒属的人类鼻病毒，可引发的医学重要疾病有普通感冒、无菌性脑膜炎、结膜炎、脑炎和呼吸道疾病；昆虫的蟋蟀麻痹病毒、蜜蜂残翅翼病毒、果蝇C病毒、蜜蜂急性麻痹病毒、茶尺蠖小RNA病毒、家蚕软化病病毒与柞蚕iflavirus病毒等人和动物的重要病原体[1]Baker A C，Schroeder D C.The use of RNA-dependent RNA polymerase for the taxonomic assignment of Picorna-like viruses(order Picornavirales)infecting Apis mellifera L.

小RNA病毒科病毒存在200多种血清型，仅鼻病毒属就超过100多种，除人脊髓灰质炎病毒外，目前还没有有效的预防用疫苗和治疗方法。

3C蛋白酶是小RNA病毒科基因编码共有的重要功能蛋白酶，在其复制及侵染宿主的过程中发挥重要作用。通过研究证明，该病毒的3C蛋白酶在人体中没有与其同源基因，在人体内没有与其相似的蛋白酶。鉴于其在病毒的生命周期中的作用，抑制其催化功能可有效抑制病毒前体蛋白的切割，阻断病毒复制， 是一个理想的小RNA病毒药物治疗研究的靶点之一

OROBOL(3′，4′，5，7-四羟基异黄酮)，为黄色粉末，溶于甲醇，分子式为C15H10O8，分子量286.05，熔点270℃，沸点616.1℃，是从植物中分离出来的异黄酮类天然产物。

目前尚未有OROBOL及其修饰物作为抗小RNA病毒科病毒3C蛋白酶抑制剂应用的任何报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供OROBOL及其修饰物在抗小RNA病毒科病毒感染中的应用。尤其是用于制备预防和/或治疗含有3C蛋白酶的小RNA病毒科病毒感染的抗病毒药物中的用途。

本发明应用虚拟筛选技术对含有10万个分子的chembridge分子库进行筛选，依据成药性及经验原则，从筛选结果中选择了多个结构系列的目标化合物，经体外抑制3C蛋白酶活性筛选，获得了1个结构新颖的3C蛋白酶抑制剂OROBOL,结构式如式Ⅰ所示，其中R＝H：

OROBOL能够抑制小RNA病毒科病毒3C蛋白酶的催化功能，进而抑制小RNA病毒科病毒在宿主细胞中的复制作用。

OROBOL的系列修饰物在制备抗小RNA病毒科病毒药物中的用途，为OROBOL在其3′位羟基做生长的系列修饰物，其系列修饰物的R分别为：

以上化合物的合成方法可以从已发表的相关文献和专利中获取。该系列修饰物能够抑制小RNA病毒科病毒3C蛋白酶的催化功能，进而抑制小RNA病毒科病毒在宿主细胞中的复制作用。

进一步的，小RNA病毒科病毒，包括人脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、脑心肌炎病毒、甲肝病毒、人类鼻病毒、动物口蹄疫病毒、蟋蟀麻痹病毒、蜜蜂残翅翼病毒、果蝇C病毒、蜜蜂急性麻痹病毒、茶尺蠖小RNA病毒、家蚕软化病病毒与柞蚕iflavirus病毒。

本发明提出的OROBOL及其系列修饰物可用于抗小RNA病毒科病毒药物的制备，并用于治疗各种包括肠道病毒属的人脊髓灰质炎病毒和柯萨奇病毒、口蹄疫病毒属的口蹄疫病毒、心病毒属的脑心肌炎病毒、肝病毒属的甲肝病毒和鼻病毒属的人类鼻病毒，可引发的医学重要疾病有普通感冒、无菌性脑膜炎、结膜炎、脑炎和呼吸道疾病，以及昆虫的蟋蟀麻痹病毒、蜜蜂残翅翼病毒、果蝇C病毒、蜜蜂急性麻痹病毒、茶尺蠖小RNA病毒、家蚕软化病病毒、柞蚕iflavirus病毒病等疾病。

附图说明

图1为在感染病毒的昆虫细胞Sf9中添加不同浓度OROBOL 16h后，用q-PCR法测定的病毒复制的变化情况。

图2为OROBOL对Sf9细胞的生长抑制作用，加药24小时后，用CCK-8法测定的细胞生长情况。

具体实施方式

实施例1 体外检测OROBOL对ApIV病毒复制的抑制作用

将状态良好的sf9以3.7×10⁵/ml个/孔的细胞密度接种在12孔板中，于27℃、条件下培养24h后，加入OROBOL，使其最终浓度分别为0.1，1，10μg/ml和10μl的病毒，以不加OROBOL作为对照组。16h后，提取细胞总RNA后，用β-actin做内参，用没有加OROBOL的细胞做对照，用q-PCR检测OROBOL对病毒的复制的作用，其结果见图1，实验结果表明随着加入的OROBOL浓度的升高，其对病毒复制的抑制作用越强，当加入的OROBOL的浓度为10μg/ml时，病毒复制的抑制率已达到80.5％，表明OROBOL可以抑制ApIV病毒的复制。

实施例2 OROBOL对昆虫细胞生长的影响。

培养Sf9细胞，以5.0×10⁴个/孔的细胞密度接种到96孔板，培养24小时(h)后，加入OROBOL，使其最终浓度分别为10μg/ml，16h后用CCK-8法检测OROBOL的细胞毒性，实验同时设置对照孔和空白孔，每个组设5个平行。

加入OROBOL 16h后的细胞生长结果统计并以柱状图表示，当OROBOL的浓度为10μg/ml时，细胞活性的降低仅为3.42％，而q-PCR中当OROBOL的浓度为10μg/ml时，对ApIV病毒复制的抑制率已达到80.5％，细胞存活状态良好，可以排除OROBOL是由于其细胞毒作用而抑制ApIV病毒在细胞中的复制的可能。

实施例3 CCK-8细胞毒性检测

在加入化合物的细胞中每孔加入10μlCCK-8溶液，培养箱中孵育4小时后取出，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

实施例4 OROBOL 3’位羟基系列修饰物筛选

基于结构的先导化合物优化主要集中于蛋白靶标的活性位点的化合物结构 的设计。Grow Scaffold工具可以根据蛋白靶标活性位点的特点，通过基于化学反应的原位生长(eaction-based in situ enumeration)方法来找出那些能够产生潜在化合物的试剂，根据结合效果的分析，选出6个化合物。

实施例5 Discovery Studio中Molecular Dynamics Simulation模拟分析、虚拟测试

Molecular Dynamics Simulation是分子模拟中最常用的方法之一。该方法基于分子立场，能够动态的描述生命的动态过程。运行Molecular Dynamics Simulation后，计算受体与配体之间的相互作用能，较低的相互作用能预示着较强的作用力。通过分子对接及预测的数据可知，OROBOL的修饰物比OROBOL与受体之间的相互作用能均有不同程度的降低，说明这些化合物对ApIV病毒的复制应有较好的抑制作用。

表1为使用Discovery Studio软件中的原位生长模块对OROBOL进行修饰后，Molecular Dynamics Simulation测定受体与配体(OROBOL及其修饰物)间相互作用能。

表1

OROBOL对ApIV病毒的抑制活性测试结果表明，本发明所提供化合物具有抑制小RNA病毒科病毒3C蛋白酶效果，同时对小RNA病毒科病毒在宿主细胞中的复制的具有抑制作用。

使用Discovery Studio软件中的原位生长模块对OROBOL进行修饰后，Molecular Dynamics Simulation测定受体与配体(OROBOL及其修饰物)间相互作用能，OROBOL的修饰物比OROBOL与受体之间的相互作用能均有不同程度的降低，说明这些化合物对ApIV病毒的复制应有较好的抑制作用。