本申请与2015年9月24日提交的美国临时专利申请号62/232,279有关；该美国临时专利申请通过引用整体并入本文。
政府利益
本文公开的发明至少部分在美国国立卫生研究院的基金号p01ai081677下由政府支持完成。因此，美国政府对本发明享有一定的权利。
发明领域
本发明涉及针对人类免疫缺陷病毒(“hiv”)的抗体及其使用方法。
发明背景
hiv导致获得性免疫缺陷综合征(aids)，这是一种以消耗综合征、中枢神经系统退化和免疫抑制为特征的人类病况，其导致威胁生命的感染和恶性肿瘤。自发现以来，1型hiv(hiv-1)已造成超过2,500万人死亡，并且预计未来二十年将有2至6千万人感染。因此，需要用于治疗或抑制hiv感染的治疗剂和方法。
一些感染hiv的个体的血清显示出igg同种型的广泛中和抗体(bnab)。然而，这些抗体的特异性和活性仍然大部分未知。中和抗体的被动转移可以有助于在动物模型中防止病毒攻击。
大多数疫苗的成功取决于抗体，而hiv抗体与最近的抗hiv疫苗试验中的保护有关。尽管一些患者在感染数年后发展出针对gp160的广泛中和抗体，但自体病毒突变的能力阻碍了针对hiv感染的保护。然而，广泛中和活性对该病毒施加选择性的压力，从而允许(bnab)被动转移到猕猴以防止shiv感染。因此，引发这样的抗体的疫苗可能保护人类免受hiv感染。
技术实现要素：
在一些方面，本发明涉及广泛中和抗hiv抗体。
在一个方面，提供了抗hiv抗体，如分离的抗hiv抗体，其中所述抗hiv抗体以1nm或更低的亲和力结合或者能够以1nm或更低的亲和力结合hiv的n-聚糖表位。在一些实施方案中，所述抗体中和hiv或者能够中和hiv。在一些实施方案中，所述抗体为广泛中和抗体。在其他实施方案中，hiv为hiv-1。在进一步的实施方案中，hiv为hiv-1m组。所述hiv可为hiv-1进化枝a(包括a1和/或a2)、b、c、d、e、f(包括f1和/或f2)、g、h、i、j、k或其任何组合、亚型或重组衍生物(包括循环重组形式(crf))。在一些实施方案中，重组hiv-1进化枝(在一些实施方案中被称为循环重组形式(crf))由其所源自的两个进化枝的组合来表示。在一些实施方案中，示例性crf包括ab、ac、ag、df、bc等。
在一些实施方案中，所述抗体已被糖工程化以修饰fc区中的寡糖，并且其中与未经糖工程化的抗体相比，所述抗体具有增加的adcc效应子功能。在一些实施方案中，所述抗体为单克隆抗体。在一些实施方案中，所述抗体为人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在一些实施方案中，所述抗体为全长igg类抗体。在其他实施方案中，所述抗体为抗体片段。在进一步的实施方案中，所述抗体为单链可变片段(scfv)。
在一些实施方案中，所述抗体包含：包含seqidno:17的氨基酸序列的cdr-h1；包含seqidno:18的氨基酸序列的cdr-h2；以及包含seqidno:19的氨基酸序列的cdr-h3。在一些实施方案中，所述抗体进一步包含：包含seqidno:20的氨基酸序列的cdr-l1；包含seqidno:21的氨基酸序列的cdr-l2；以及包含seqidno:22的氨基酸序列的cdr-l3。
在一些实施方案中，所述抗体包含：包含seqidno:20的氨基酸序列的cdr-l1；包含seqidno:21的氨基酸序列的cdr-l2；以及包含seqidno:22的氨基酸序列的cdr-l3。
在一些实施方案中，所述抗体包含：包含seqidno:23的氨基酸序列的cdr-h1；包含seqidno:24的氨基酸序列的cdr-h2；以及包含seqidno:25的氨基酸序列的cdr-h3。在一些实施方案中，所述抗体进一步包含：包含seqidno:26的氨基酸序列的cdr-l1；包含seqidno:27的氨基酸序列的cdr-l2；以及包含seqidno:28的氨基酸序列的cdr-l3。
在一些实施方案中，所述抗体包含：包含seqidno:26的氨基酸序列的cdr-l1；包含seqidno:27的氨基酸序列的cdr-l2；以及包含seqidno:28的氨基酸序列的cdr-l3。
在一些实施方案中，所述抗体包含：包含seqidno:29的氨基酸序列的cdr-h1；包含seqidno:30的氨基酸序列的cdr-h2；以及包含seqidno:31的氨基酸序列的cdr-h3。在一些实施方案中，所述抗体进一步包含：包含seqidno:32的氨基酸序列的cdr-l1；包含seqidno:33的氨基酸序列的cdr-l2；以及包含seqidno:34的氨基酸序列的cdr-l3。
在一些实施方案中，所述抗体包含：包含seqidno:32的氨基酸序列的cdr-l1；包含seqidno:33的氨基酸序列的cdr-l2；以及包含seqidno:34的氨基酸序列的cdr-l3。
在一些实施方案中，所述抗体包含：包含seqidno:35的氨基酸序列的cdr-h1；包含seqidno:36的氨基酸序列的cdr-h2；以及包含seqidno:37的氨基酸序列的cdr-h3。在一些实施方案中，所述抗体进一步包含：包含seqidno:38的氨基酸序列的cdr-l1；包含seqidno:39的氨基酸序列的cdr-l2；以及包含seqidno:40的氨基酸序列的cdr-l3。
在一些实施方案中，所述抗体包含：包含seqidno:38的氨基酸序列的cdr-l1；包含seqidno:39的氨基酸序列的cdr-l2；以及包含seqidno:40的氨基酸序列的cdr-l3。
在一些实施方案中，所述抗体包含：包含seqidno:41的氨基酸序列的cdr-h1；包含seqidno:42的氨基酸序列的cdr-h2；包含seqidno:43的氨基酸序列的cdr-h3；以及具有seqidno:10的氨基酸序列的vl序列。
在一些实施方案中，所述抗体包含：包含seqidno:17的氨基酸序列的cdr-h1；包含seqidno:18的氨基酸序列的cdr-h2；包含seqidno:16的氨基酸序列的cdr-h3；以及具有seqidno:12的氨基酸序列的vl序列。
在一些实施方案中，所述抗体包含：包含seqidno:53的氨基酸序列的cdr-h1；包含seqidno:54的氨基酸序列的cdr-h2；以及包含seqidno:55的氨基酸序列的cdr-h3。在一些实施方案中，所述抗体进一步包含：包含seqidno:56的氨基酸序列的cdr-l1；包含seqidno:57的氨基酸序列的cdr-l2；以及包含seqidno:58的氨基酸序列的cdr-l3。
在一些实施方案中，所述抗体包含：包含seqidno:56的氨基酸序列的cdr-l1；包含seqidno:57的氨基酸序列的cdr-l2；以及包含seqidno:58的氨基酸序列的cdr-l3。
在一些实施方案中，所述抗体包含：包含seqidno:59的氨基酸序列的cdr-h1；包含seqidno:60的氨基酸序列的cdr-h2；以及包含seqidno:61的氨基酸序列的cdr-h3。
在一些实施方案中，所述抗体包含：包含seqidno:62的氨基酸序列的cdr-h1；包含seqidno:63的氨基酸序列的cdr-h2；以及包含seqidno:64的氨基酸序列的cdr-h3。在一些实施方案中，所述抗体进一步包含：包含seqidno:26的氨基酸序列的cdr-l1；包含seqidno:27的氨基酸序列的cdr-l2；以及包含seqidno:28的氨基酸序列的cdr-l3。在一些实施方案中，所述抗体进一步包含：包含seqidno:66的氨基酸序列的cdr-l1；包含seqidno:67的氨基酸序列的cdr-l2；以及包含seqidno:68的氨基酸序列的cdr-l3。
在一些实施方案中，所述抗体包含与seqidno:1的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的vh序列；与seqidno:2的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的vl序列；或如(a)中的vh序列和如(b)中的vl序列。
在一些实施方案中，所述抗体包含与seqidno:3的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的vh序列；与seqidno:4的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的vl序列；或如(a)中的vh序列和如(b)中的vl序列。
在一些实施方案中，所述抗体包含与seqidno:5的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的vh序列；与seqidno:6的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的vl序列；或如(a)中的vh序列和如(b)中的vl序列。
在一些实施方案中，所述抗体包含与seqidno:7的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的vh序列；与seqidno:8的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的vl序列；或如(a)中的vh序列和如(b)中的vl序列。
在一些实施方案中，所述抗体包含与seqidno:9的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的vh序列；以及具有seqidno:10的氨基酸序列的vl序列。
在一些实施方案中，所述抗体包含与seqidno:11的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的vh序列；以及具有seqidno:12的氨基酸序列的vl序列。
在一些实施方案中，所述抗体包含与seqidno:13的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的vh序列；与seqidno:14的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的vl序列；或如(a)中的vh序列和如(b)中的vl序列。
在一些实施方案中，所述抗体包含与seqidno:16的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的vh序列；或如(a)中的vh序列和与seqidno:4的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的vl序列。
在一些实施方案中，所述抗体包含与seqidno:16的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的vh序列；或如(a)中的vh序列和与seqidno:65的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的vl序列。
在一些实施方案中，所述抗体不包含表4的cdr-h1、表4的cdr-h2、表4的cdr-h3或其任何组合；表5的cdr-l1、表5的cdr-l2、表5的cdr-l3或其任何组合；表4的vh序列、表5的vl序列或两者；或(a)、(b)或(c)的任何组合。
在一个方面，提供了编码任何本文所述抗体的分离的核酸。在一个方面，提供了包含所述核酸的载体。在一个方面，提供了包含所述载体的宿主细胞。
在一个方面，提供了产生抗体的方法，该方法包括培养包含编码任何本文所述抗体的核酸的宿主细胞，从而产生所述抗体。
在一个方面，提供了免疫偶联物，其包含任何本文所述的抗体，和细胞毒性剂。
在一个方面，提供了药物制剂，其包含本文所述的抗体，和药学上可接受的载体。
在一个方面，本文提供了用作药物的任何本文所述的抗体或免疫偶联物。
在一个方面，本文提供了用于治疗hiv感染或aids的任何本文所述的抗体或免疫偶联物。
在一个方面，本文提供了用于药物制备的任何本文所述的抗体或免疫偶联物。在一些实施方案中，所述药物用于治疗hiv感染或aids。在其他实施方案中，所述药物用于中和hiv。在一些实施方案中，所述抗体为广泛中和抗体。在一些实施方案中，hiv为hiv-1。在进一步的实施方案中，hiv为hiv-1m组。所述hiv可为hiv-1进化枝a(包括a1和/或a2)、b、c、d、e、f(包括f1和/或f2)、g、h、i、j、k或其任何组合、亚型或重组衍生物(包括循环重组形式(crf))。在一些实施方案中，重组hiv-1进化枝(在一些实施方案中被称为循环重组形式(crf))由其所源自的两个进化枝的组合来表示。在一些实施方案中，示例性crf包括ab、ac、ag、df、bc等。
在一个方面，本文提供了治疗患有hiv感染或aids的个体的方法，该方法包括向所述个体施用有效量的任何本文所述的抗体或免疫偶联物。在一些实施方案中，所述方法进一步包括施用治疗剂。在一些实施方案中，所述治疗剂为抗病毒剂。
在一个方面，本文提供了hiv免疫组织化学测定，其包括使样品与任何本文所述的抗体或免疫偶联物在允许所述抗体与所述样品中存在的hiv之间形成抗体-hiv复合体的条件下接触，以及通过免疫检测方法检测所述复合体的存在或不存在。在一些实施方案中，所述样品为血液样品或组织样品。
在一个方面，本文提供了用于制备抗hiv抗体或其片段的方法，该方法包括在允许表达由载体编码的多肽和组装抗体或其片段的条件下，在培养基中培养包含编码任何本文所述抗体的核酸的宿主细胞；以及从所述宿主细胞或所述宿主细胞的培养基中纯化所述抗体或片段。
在一个方面，本文提供了试剂盒，其包含药学上有效量的至少一种本文所述的分离的抗hiv抗体或免疫偶联物的药学上可接受的剂量单位。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含药学上有效量的抗hiv剂的药学上可接受的剂量单位。在一些实施方案中，所述抗hiv剂选自非核苷逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、进入或融合抑制剂和整合酶抑制剂。
在一个方面，本文提供了用于对受试者的hiv感染或aids进行诊断、预后和治疗监测的试剂盒，其包含至少一种本文所述的分离的抗hiv抗体或免疫偶联物以及一种或多种与所述抗hiv抗体特异性结合的检测试剂。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含用于进行pcr的试剂。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含用于进行质谱法的试剂。
在一个方面，融合蛋白或偶联物包含任何本文所述的抗体。在一些实施方案中，所述融合蛋白或偶联物为嵌合受体或包含嵌合受体，所述嵌合受体任选为嵌合抗原受体(car)。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体(car)包含任何本文所述的抗体。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体为进一步包含含有itam基序的细胞内信号传导结构域的car。在其他实施方案中，所述嵌合抗原受体为进一步包含来自cd3ζ的细胞内信号传导结构域的car。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体为进一步包含来自选自cd28、cd137、icos和ox40的共刺激分子的细胞内信号传导结构域的car。
援引并入
本文中的所有出版物、专利和专利申请均通过引用整体并入本文。如果本文中的术语与所并入参考文献中的术语之间存在冲突，则以本文中的术语为准。
附图说明
本文所述的新颖特征在随附权利要求中具体阐述。通过参考以下对应用本文所述特征的原理的说明性实例加以阐述的详细描述以及附图，将会获得对本文所述特征的特点和优点的更好理解，在这些附图中：
图1描绘了根据重链cdr3相似性进行筛选的结果的图示。在健康志愿者中观察到的匹配相似性表明“显著性阈值”(来自供体的重链中的抗体候选物的初始允许截止值)。
图2描绘了显示出所发现的抗体与已知pt17bnab系统发生地分离的图示。收集了来自供体17的bnab序列。系统发生地散布有这些bnab的新型抗体得到确定并且可能来自相同的谱系。利用与这些bnab的系统发生关系来鉴别新的广泛中和抗体。
图3描绘了衍生自供体17的已知和新型的ab的图示。新的抗体对散布有已知的bnab(重链和轻链二者)。
图4描绘了显示出已知和发现的抗体重链和轻链配对的图示。
图5描绘了abv1-9抗体可变区序列与种系抗体的可变区序列的比对。
图6a描绘了种系和abv1-9克隆变体的序列比对。(a)abv1-9抗体的重链(igh)的氨基酸比对，和克隆变体的种系(gl)vh。示出了如由kabat(jexpmed132(2):211-250)定义的基于晶体结构、框架(fwr)和互补决定区(cdr)的氨基酸编号。
图6b描绘了种系和abv1-9克隆变体的序列比对。abv1-9抗体的轻链(igl)的氨基酸比对，和克隆变体的种系(gl)vl。示出了如由kabat(jexpmed132(2):211-250)定义的基于晶体结构、框架(fwr)和互补决定区(cdr)的氨基酸编号。
图7例示了来自hivbnab发现方法的结果。将来自hivelite控制器的b细胞输入乳液中并且回收bcr对。(图7a)38,620个回收的vhvl对的重链同种型分布，其中罕见比例的igg链与先前已知的bnab(“pgt样”)良好对齐。(图7b)已知bnab加新回收的bnab(由线连接，用小液滴条码标记)的完整vdj氨基酸序列的系统树，其中重链(左)和轻链(右)分开绘制。潜在错配的抗体为pgt122.重链与pgt123.轻链，和pct123.重链与pgt122.轻链。(图7c)与pgt121的对照原种相比，8种新发现的pgt样变体针对十种hiv毒株的中和活性(ic50，μg/ml)。
具体实施方式
在一些方面，本发明至少部分基于针对hiv的广泛中和抗体(bnab)的新类别的意外发现，这些抗体在某些方面可识别例如在gp120上的碳水化合物依赖性表位，如复合型n-聚糖。
所提供的抗体有单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体和多反应性抗体)和抗体片段。该抗体包括抗体-偶联物和包含该抗体的分子，如嵌合分子；包含一个或多个刺激结构域、信号传导结构域和/或共刺激结构域的嵌合受体；以及嵌合抗原受体(car)。因此，抗体包括但不限于全长抗体和天然抗体，以及保留其结合特异性的片段和部分，如其任何特异性结合部分，包括具有任何数目的免疫球蛋白类别和/或同种型(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、igm、iga、igd、ige和igm)的其特异性结合部分；以及其生物学相关片段(抗原结合片段)或特异性结合部分，包括但不限于fab、f(ab')2、fv和scfv(单链或相关实体)。单克隆抗体通常为基本均质抗体的组合物内的抗体；因此，除了可能少量存在的自然发生的突变之外，单克隆抗体组合物内包含的任何单个抗体都是相同的。多克隆抗体是包含通常针对两种或更多种不同决定簇(表位)的具有不同序列的不同抗体的制剂。
还提供了诸如嵌合分子和融合分子(包括受体，如重组受体)等分子，其包括任何所述实施方案的抗体(例如，包含在细胞外结构域内或是细胞外结构域的一部分的抗体)和附加结构域，如细胞内信号传导结构域、间隔区、连接体和/或跨膜结构域。在一些实施方案中，所述受体为嵌合抗原受体，其包含含有任何所述实施方案的抗体或片段的细胞外部分和细胞内信号传导结构域。
因此，本文中的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括多克隆抗体和单克隆抗体，包括完整抗体及其功能性(抗原结合)抗体片段，该功能性(抗原结合)抗体片段包括片段抗原结合(fab)片段、f(ab')2片段、fab'片段、fv片段、重组igg(rigg)片段、单链抗体片段(包括单链可变片段(sfv或scfv))和单结构域抗体(例如，sdab、sdfv、纳米抗体)片段。该术语包含免疫球蛋白的基因工程化形式和/或以其他方式修饰的形式，诸如胞内抗体、肽抗体、嵌合抗体、完全人类抗体、人源化抗体和异源偶联抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、双抗体、三抗体和四抗体、串联双-scfv、串联三-scfv。除非另有说明，术语“抗体”应理解为包括其功能性抗体片段。该术语还包含完整抗体或全长抗体，包括任何类别或亚类的抗体，包括igg及其亚类(igm、ige、iga和igd)。
与“高变区”或“hvr”同义的术语“互补决定区”和“cdr”在本领域中是已知的，用于指代抗体可变区内氨基酸赋予抗原特异性和/或结合亲和力的非连续序列。通常，每个重链可变区中有三个cdr(cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3)，并且每个轻链可变区中有三个cdr(cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3)。“构架区”和“fr”在本领域中是已知的，用于指代重链和轻链可变区的非cdr部分。通常，每个全长重链可变区中有四个fr(fr-h1、fr-h2、fr-h3和fr-h4)，并且每个全长轻链可变区有四个fr(fr-l1、fr-l2、fr-l3和fr-l4)。
给定cdr或fr的精确氨基酸序列边界可使用许多众所周知的方案中的任一种容易地确定，所述方案包括kabat等人(1991),“sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,”第5版.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(“kabat”编号方案)、al-lazikani等人,(1997)jmb273,927-948(“chothia”编号方案)、maccallum等人,j.mol.biol.262:732-745(1996),“antibody-antigeninteractions:contactanalysisandbindingsitetopography,”j.mol.biol.262,732-745.”(“contact”编号方案)、lefrancmp等人,“imgtuniquenumberingforimmunoglobulinandtcellreceptorvariabledomainsandigsuperfamilyv-likedomains,”devcompimmunol,2003年1月；27(1):55-77(“imgt”编号方案)和honeggeraandplückthuna,“yetanothernumberingschemeforimmunoglobulinvariabledomains:anautomaticmodelingandanalysistool,”jmolbiol,2001年6月,8；309(3):657-70,(“aho”编号方案)所述的编号方案。
给定cdr或fr的边界可根据用于鉴别的方案而变化。例如，kabat方案是基于结构比对，而chothia方案是基于结构信息。kabat方案和chothia方案二者的编号均基于最常见的抗体区序列长度，其中插入由插入字母(例如，“30a”)调节并且在一些抗体中出现缺失。这两种方案在不同位置处放置某些插入和缺失(“indel”)，从而导致差异的编号。contact方案基于对复合晶体结构的分析，并且在许多方面与chothia编号方案相似。
以下表a列出了分别通过kabat、chothia和contact方案鉴别的cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3和cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3的示例性位置边界。对于cdr-h1，使用kaba编号方案和chothia编号方案二者来列出残基编号。fr位于cdr之间，例如fr-l1位于cdr-l1与cdr-l2之间，等等。值得注意的是，由于所示的kabat编号方案在h35a和h35b处放置了插入，因此chothiacdr-h1环的末端在使用所示的kabat编号惯例进行编号时根据环的长度而在h32与h34之间变化。
表a
1-kabat等人(1991),“sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,”第5版.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md
2-al-lazikani等人,(1997)jmb273,927-948
因此，除非另有规定，否则给定抗体或其区域(如其可变区)的“cdr”或“互补决定区”或单个指定的cdr(例如，“cdr-h1、cdr-h2)应理解为包括如由任何前述方案所定义的互补决定区(或特定互补决定区)。例如，在阐明特定cdr(例如，cdr-h3)含有给定vh或vl氨基酸序列中相应cdr的氨基酸序列的情况下，应当理解，此类cdr具有如由任何前述方案所定义的可变区内的相应cdr(例如，cdr-h3)的序列。在一些实施方案中，指定了特定的cdr序列。
同样地，除非另有规定，否则给定抗体或其区域(如其可变区)的fr或单个指定fr(例如，fr-h1、fr-h2)应理解为包括如由任何已知方案所定义的构架区(或特定构架区)。在一些情况下，指定了用于鉴别特定cdr、fr或fr或cdr(如由kabat、chothia或contact方法所定义的cdr)的方案。在其他情况下，给出了cdr或fr的具体氨基酸序列。
术语“可变区”或“可变域”是指涉及抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链(分别为vh和vl)的可变域通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的构架区(fr)和三个cdr。(参见例如，kindt等人.kubyimmunology,第6版,w.h.freemanandco.,第91页(2007))。单个vh或vl域可足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可使用vh或vl域从结合该抗原的抗体中分离，从而分别筛选互补的vl或vh域的文库，参见例如，portolano等人,j.immunol.150:880-887(1993)；clarkson等人,nature352:624-628(1991)。
所提供的抗体中存在抗体片段。“抗体片段”是指除了完整抗体以外的包含完整抗体的一部分的分子，该部分结合该完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于fv、fab、fab'、fab’-sh、f(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scfv或sfv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。在特定的实施方案中，抗体是包含可变重链区和/或可变轻链区的单链抗体片段，如scfv。
单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变域或全部或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体为人类单结构域抗体。
抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白质水解消化以及通过重组宿主细胞的生产。在一些实施方案中，抗体是重组产生的片段，诸如包含非天然存在的排列的片段，诸如具有两个或更多个通过合成连接体(例如，肽连接体)连接的抗体区或链和/或可能无法通过天然存在的完整抗体的酶消化而产生的片段。在一些方面，抗体片段为scfv。
“人源化”抗体是其中全部或基本上全部cdr氨基酸残基都来源于非人类cdr且全部或基本上全部fr氨基酸残基都来源于人类fr的抗体。人源化抗体可任选地包括来源于人类抗体的抗体恒定区的至少一部分。非人类抗体的“人源化形式”是指已经历人源化的非人类抗体的变体，该人源化通常用于降低对人的免疫原性，同时保留亲代非人类抗体的特异性和亲和力。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些fr残基用来自非人类抗体(例如，衍生出cdr残基的抗体)的相应残基置换，例如用以恢复或提高抗体特异性或亲和力。
所提供的抗体中存在人类抗体。“人类抗体”是具有这样的氨基酸序列的抗体，该氨基酸序列与由人或人细胞或采用人类抗体组库或其他人类抗体编码序列(包括人类抗体文库)的非人来源产生的抗体的氨基酸序列相对应。该术语排除包含非人类抗原结合区的非人类抗体的人源化形式，诸如其中全部或基本上全部cdr均是非人类的人源化形式的非人类抗体。
人类抗体可通过向转基因动物施用免疫原来制备，该转基因动物已经被修饰以响应于抗原激发而产生完整人类抗体或具有人类可变区的完整抗体。这样的动物通常含有全部或部分人类免疫球蛋白基因座，该人类免疫球蛋白基因座取代内源性免疫球蛋白基因座，或者存在于染色体外或被随机整合到动物染色体中。在这样的转基因动物中，内源性免疫球蛋白基因座通常已经失活。人类抗体还可以来源于含有源自人组库的抗体编码序列的人类抗体文库，包括噬菌体展示文库和无细胞文库。
所提供的抗体中存在单克隆抗体，包括单克隆抗体片段。如本文所用的，术语“单克隆抗体”是指从基本均质的抗体群体(即，组成该群体的各个抗体是相同的)获得的抗体或在基本均质的抗体群体内的抗体，而含有天然存在的突变或在生产单克隆抗体制备物期间产生的可能变体(这样的变体通常以少量存在)除外。与通常包括针对不同表位的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体是针对抗原上的单个表位。该术语不应被解释为抗体生产需要通过任何特定的方法。单克隆抗体可通过多种技术制备，包括但不限于从杂交瘤生成、重组dna方法、噬菌体展示以及其他抗体展示方法。
术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，用于指代氨基酸残基的聚合物，且不限制最小长度。包括所提供的抗体和抗体链以及其他肽(例如，连接体和结合肽)在内的多肽可包括氨基酸残基，包括天然和/或非天然的氨基酸残基。该术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等。在一些方面，多肽可含有相对于原始或天然序列的修饰，只要该蛋白质仍保持所需的活性即可。这些修饰可以是故意的，诸如通过定点诱变，或可以是偶然的，诸如通过产生该蛋白质的宿主的突变或由于pcr扩增引起的错误。
相对于参考多肽序列的序列同一性百分比(％)是在比对序列并引入空位(若必要)以实现最大序列同一性百分比之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，不将任何保守置换视为序列同一性的一部分。为了确定氨基酸序列同一性百分比而进行的比对可以通过已知的各种方式来实现，例如使用可公开获得的计算机软件如blast、blast-2、align或megalign(dnastar)软件。能够确定用于比对序列的适当参数，包括在被比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，对于本发明，使用序列比较计算机程序align-2来生成氨基酸序列同一性％值。该align-2序列比较计算机程序由genentech,inc.授权，并且源代码和用户文件已经在美国版权局(washingtond.c.,20559)提交，该程序在美国版权注册号txu510087下于美国版权局注册。该align-2程序可从genentech,inc.(southsanfrancisco,calif.)公开获得，或者可以从该源代码编译。该align-2程序应该被编译用于unix操作系统，包含数字unixv4.0d。所有的序列比较参数都由align-2程序设置且不会改变。
在使用align-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列a与给定氨基酸序列b的氨基酸序列同一性％(或者其可以以如下方式措辞：给定的氨基酸序列a相对于给定氨基酸序列b具有或包含某个氨基酸序列同一性％)如下计算：100乘以分数x/y，其中x为通过序列比对程序align-2在该程序的a与b比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中y是b中氨基酸残基的总数。应理解，在氨基酸序列a的长度不等于氨基酸序列b的长度的情况下，a与b的氨基酸序列同一性％将不等于b与a的氨基酸序列同一性％。除非另有特别说明，否则本文所用的所有氨基酸序列同一性％值都是使用align-2计算机程序如前一段所述获得的。
组合物和方法
在一些实施方案中，本发明提供了抗hiv抗体(包括但不限于抗体的抗原结合片段和偶联物，和/或抗体的融合蛋白，例如片段，诸如嵌合蛋白或嵌合受体，例如，含有一种或多种该抗体的嵌合抗原受体(car))。在一些实施方案中，这样的抗体、融合蛋白和/或偶联物可用于hiv的治疗、诊断和/或预后。所提供的抗体(及其融合蛋白和偶联物)有可以中和hiv的抗体。该抗体可以是广泛中和抗体。在一些实施方案中，本发明的抗体可以中和hiv-1或hiv-2。例如，在一些实施方案中，本发明的抗体可以中和hiv-1m组、hiv-1n组、hiv-1o组和/或hiv-1p组。在一些实施方案中，本发明的抗体可中和hiv-1进化枝a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k或其任何组合、亚型或重组衍生物(包括循环重组形式(crf))。在一些实施方案中，提供了与hiv的糖蛋白结合的抗体。在一些实施方案中，提供了与hiv结合的具有增强的效应子功能的抗体。所提供的融合蛋白和偶联物(包括嵌合受体如嵌合抗原受体(car))包括单独或组合地包含任一种或多种所提供抗体的蛋白质和偶联物。
示例性抗hiv抗体
在一个方面，本发明提供了与hiv结合的抗体，如分离的抗体。该hiv可为hiv-1。该hiv可为hiv-2。该hiv可为hiv-1m组。该hiv可为hiv-1n组、hiv-1o组和/或hiv-1p组。该hiv可为hiv-1进化枝a(包括a1和/或a2)、b、c、d、e、f(包括f1和/或f2)、g、h、i、j、k或其任何组合、亚型或重组衍生物(包括循环重组形式(crf))。在一些实施方案中，重组hiv-1进化枝(在一些实施方案中被称为循环重组形式(crf))由其所源自的两个进化枝的组合来表示。在一些实施方案中，示例性crf包括ab、ac、ag、df、bc等。特别地，所提供的抗hiv抗体与hiv的包膜糖蛋白结合。分离的抗体是从其天然环境的组分分离的抗体。在一些实施方案中，如通过例如电泳(例如，sds-page、等电聚焦(ief)、毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相hplc)确定的，抗体被纯化至大于95％或99％的纯度。(参见例如，flatman等人,j.chromatogr.b848:79-87(2007))。
特别地，所提供的抗hiv抗体与人hiv的复合型n-聚糖表位结合。特别地，所提供的抗hiv抗体与人hiv的gp120结合。本发明的抗hiv抗体与存在于包含复合型n-聚糖的人hiv的gp120结构域上的表位结合。
在一些实施方案中，本发明提供了可以中和hiv的分离的抗体。中和抗体可以是抑制病毒的感染性的抗体。在其他实施方案中，本发明提供了可以广泛中和hiv的分离的抗体。广泛中和抗体可以是抑制病毒的两种或更多种毒株或亚型的感染性的抗体。该hiv可为hiv-1。该hiv可为hiv-2。该hiv可为hiv-1m组。该hiv可为hiv-1n组、hiv-1o组和/或hiv-1p组。该hiv可为hiv-1进化枝a(包括a1和/或a2)、b、c、d、e、f(包括f1和/或f2)、g、h、i、j、k或其任何组合、亚型或重组衍生物(包括循环重组形式(crf))。
在一些实施方案中，所述抗hiv抗体诱导表达hiv的细胞的裂解。可以通过任何机制来诱导裂解，诸如通过介导效应子功能，如c1q结合和补体依赖性细胞毒性(cdc)；fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，b细胞受体)的下调；b细胞激活或直接诱导细胞凋亡。
在一些实施方案中，将所述抗hiv抗体工程化为与非工程化亲本抗hiv抗体相比具有至少一种效应子功能的增加。效应子功能是可归因于抗体的fc区的生物学活性，其随着抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：c1q结合和补体依赖性细胞毒性(cdc)；fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，b细胞受体)的下调；以及b细胞激活。例如，该抗hiv抗体可经糖工程化为与未经糖工程化的亲本抗hiv抗体相比具有至少一种效应子功能的增加。抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)是该抗体的iggfab部分与细胞表面上的病毒蛋白之间形成复合体以及fc部分与效应细胞上的fc受体(fcγr)结合的结果。效应子功能的增加可以是对fc受体的结合亲和力增加、adcc增加；吞噬作用增加；细胞介导的免疫力增加；与细胞毒性cd8t细胞的结合增加；与nk细胞的结合增加；与巨噬细胞的结合增加；与多形核细胞的结合增加；与单核细胞的结合增加；与巨噬细胞的结合增加；与大颗粒淋巴细胞的结合增加；与粒细胞的结合增加；诱导凋亡的直接信号传导；树突细胞成熟增加；或者t细胞引发增加。与针对hiv的相同表位的未经糖工程化的抗体相比，经糖工程化的抗hiv抗体在罹患表达hiv的癌症的受试者中提供了存活益处。
abv1-9
在一个方面，抗hiv抗体包含与seqidno:1、3、5、7、9、11、13、15和16的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的vh序列。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的vh序列含有相对于参考序列的置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗hiv抗体保留与hiv结合的能力。该抗hiv抗体可以保留与hiv-1结合的能力。该抗hiv抗体可以保留与hiv-2结合的能力。该抗hiv抗体可以保留与hiv-1m组结合的能力。该抗hiv抗体可以保留与hiv-1n组、hiv-1o组和/或hiv-1p组结合的能力。该抗hiv抗体可以保留与hiv-1进化枝a(包括a1和/或a2)、b、c、d、e、f(包括f1和/或f2)、g、h、i、j、k或其任何组合、亚型或重组衍生物(包括循环重组形式(crf))结合的能力。在一些实施方案中，在seqidno:1、3、5、7、9、11、13、15和16的氨基酸序列中，已经置换、插入并且/或者缺失了总计1至10个氨基酸。在一些实施方案中，置换、插入或缺失发生在cdr外的区域中(例如，在fr中)。任选地，该抗hiv抗体包含seqidno:1、3、5、7、9、11、13、15和16的氨基酸序列的vh序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定的实施方案中，所述vh包含选自以下的一个、两个或三个cdr：(a)包含seqidno:17、23、29、35、41、47、53、59和61的氨基酸序列的cdr-h1，(b)包含seqidno:18、24、30、36、42、48、54、60和63的氨基酸序列的cdr-h2，以及(c)包含seqidno:19、25、31、37、43、49、55、61和64的氨基酸序列的cdr-h3。
在一个方面，提供了抗hiv抗体，其中所述抗体包含与seqidno:2、4、6、8、10、12和14的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(vl)。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的vl序列含有相对于参考序列的置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗hiv抗体保留与hiv结合的能力。在一些实施方案中，在seqidno:2、4、6、8、10、12和14的任一个氨基酸序列中，已经置换、插入并且/或者缺失了总计1至10个氨基酸。在一些实施方案中，该置换、插入或缺失发生在cdr外的区域中(例如，在fr中)。任选地，该抗hiv抗体包含seqidno:2、4、6、8、10、12和14的vl序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定的实施方案中，所述vl包含选自以下的一个、两个或三个cdr：(a)包含seqidno:20、26、32、38、44、50和56的氨基酸序列的cdr-l1；(b)包含seqidno:21、27、33、39、45、51和57的氨基酸序列的cdr-l2；(c)包含seqidno:22、28、34、40、46、52和58的氨基酸序列的cdr-l3。
在一个方面，提供了抗hiv抗体，其中所述抗体包含如任何上文提供的实施方案所述的vh，以及如任何上文提供的实施方案所述的vl。在一些实施方案中，所述抗体包含含有seqidno:1、3、5、7、9、11、13、15和16的氨基酸序列的vh，以及seqidno:2、4、6、8、10、12和14中的vl序列，包括这些序列的翻译后修饰。
在一个方面，提供了抗hiv抗体，其中所述抗体包含选自表1中任何vh的vh。在一个方面，提供了抗hiv抗体，其中所述抗体包含选自表2中任何vl的vl。在一个方面，提供了抗hiv抗体，其中所述抗体包含选自表1中任何vh的vh和选自表2中任何vl的vl。在一个方面，提供了抗hiv抗体，其中所述抗体包含选自表1中任何vh的vh和选自表2中任何vl的vl，其中根据表3将选择的vh和vl配对。
abv-1
在一个方面，本发明提供了包含至少一个或两个可变区的抗hiv抗体，所述可变区选自(a)包含seqidno:1的氨基酸序列的vh和(b)包含seqidno:2的氨基酸序列的vl。
在一个方面，本发明提供了抗hiv抗体，其包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的cdr：(a)包含seqidno:17的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno:18的氨基酸序列的cdr-h2；(c)包含seqidno:19的氨基酸序列的cdr-h3；(d)包含seqidno:20的氨基酸序列的cdr-l1；(e)包含seqidno:21的氨基酸序列的cdr-l2；以及(f)包含seqidno:22的氨基酸序列的cdr-l3。
在一个方面，本发明提供了抗hiv抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的vhcdr序列：(a)包含seqidno:14的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno:15的氨基酸序列的cdr-h2；以及(c)包含seqidno:16的氨基酸序列的cdr-h3。在一个方面，本发明提供了抗hiv抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自(a)包含seqidno:14的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno:15的氨基酸序列的cdr-h2；以及(c)包含seqidno:16的氨基酸序列的cdr-h3的vhcdr序列；以及(d)包含seqidno:2的氨基酸序列的vl。
在一个方面，本发明提供了抗hiv抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的vlcdr序列：(a)包含seqidno:20的氨基酸序列的cdr-l1；(b)包含seqidno:21的氨基酸序列的cdr-l2；以及(c)包含seqidno:22的氨基酸序列的cdr-l3。在一个方面，本发明提供了抗hiv抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自(a)包含seqidno:20的氨基酸序列的cdr-l1；(b)包含seqidno:21的氨基酸序列的cdr-l2；以及(c)包含seqidno:22的氨基酸序列的cdr-l3的vlcdr序列；以及(d)包含seqidno:1的氨基酸序列的vh。
在一个方面，本发明提供了包含以下cdr的抗hiv抗体：(a)包含seqidno:17的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno:18的氨基酸序列的cdr-h2；(c)包含seqidno:19的氨基酸序列的cdr-h3；(d)包含seqidno:20的氨基酸序列的cdr-l1；(e)包含seqidno:21的氨基酸序列的cdr-l2；以及(f)包含seqidno:22的氨基酸序列的cdr-l3。
在一个方面，抗hiv抗体包含与seqidno:1的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的vh序列。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的vh序列含有相对于参考序列的置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗hiv抗体保留与hiv结合的能力。在一些实施方案中，在seqidno:1的氨基酸序列中，已经置换、插入并且/或者缺失了总计1至10个氨基酸。在一些实施方案中，置换、插入或缺失发生在cdr外的区域中(例如，在fr中)。任选地，该抗hiv抗体包含seqidno:1的氨基酸序列的vh序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定的实施方案中，所述vh包含选自以下的一个、两个或三个cdr：(a)包含seqidno:17的氨基酸序列的cdr-h1，(b)包含seqidno:18的氨基酸序列的cdr-h2，以及(c)包含seqidno:19的氨基酸序列的cdr-h3。
在一个方面，提供了抗hiv抗体，其中所述抗体包含与seqidno:2的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(vl)。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的vl序列含有相对于参考序列的置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗hiv抗体保留与hiv结合的能力。在一些实施方案中，在任一个seqidno:2的氨基酸序列中，已经置换、插入并且/或者缺失了总计1至10个氨基酸。在一些实施方案中，该置换、插入或缺失发生在cdr外的区域中(例如，在fr中)。任选地，该抗hiv抗体包含seqidno:2的vl序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定的实施方案中，所述vl包含选自以下的一个、两个或三个cdr：(a)包含seqidno:20的氨基酸序列的cdr-l1；(b)包含seqidno:21的氨基酸序列的cdr-l2；以及(c)包含seqidno:22的氨基酸序列的cdr-l3。
在一个方面，提供了抗hiv抗体，其中所述抗体包含如任何上文提供的实施方案所述的vh，以及如任何上文提供的实施方案所述的vl。在一些实施方案中，所述抗体包含含有seqidno:1的氨基酸序列的vh，以及seqidno:2中的vl序列，包括这些序列的翻译后修饰。
abv-2
在一个方面，本发明提供了包含至少一个或两个可变区的抗hiv抗体，所述可变区选自(a)包含seqidno:3的氨基酸序列的vh和(b)包含seqidno:4的氨基酸序列的vl。
在一个方面，本发明提供了抗hiv抗体，其包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的cdr：(a)包含seqidno:23的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno:24的氨基酸序列的cdr-h2；(c)包含seqidno:25的氨基酸序列的cdr-h3；(d)包含seqidno:26的氨基酸序列的cdr-l1；(e)包含seqidno:27的氨基酸序列的cdr-l2；以及(f)包含seqidno:28的氨基酸序列的cdr-l3。
在一个方面，本发明提供了抗hiv抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的vhcdr序列：(a)包含seqidno:23的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno:24的氨基酸序列的cdr-h2；以及(c)包含seqidno:25的氨基酸序列的cdr-h3。在一个方面，本发明提供了抗hiv抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自(a)包含seqidno:23的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno:24的氨基酸序列的cdr-h2；以及(c)包含seqidno:25的氨基酸序列的cdr-h3的vhcdr序列；以及(d)包含seqidno:4的氨基酸序列的vl。
在一个方面，本发明提供了抗hiv抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的vlcdr序列：(a)包含seqidno:26的氨基酸序列的cdr-l1；(b)包含seqidno:27的氨基酸序列的cdr-l2；以及(c)包含seqidno:28的氨基酸序列的cdr-l3。在一个方面，本发明提供了抗hiv抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自(a)包含seqidno:26的氨基酸序列的cdr-l1；(b)包含seqidno:27的氨基酸序列的cdr-l2；以及(c)包含seqidno:28的氨基酸序列的cdr-l3的vlcdr序列；以及(d)包含seqidno:3的氨基酸序列的vh。在一个方面，本发明提供了包含以下cdr的抗hiv抗体：(a)包含seqidno:23的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno:24的氨基酸序列的cdr-h2；(c)包含seqidno:25的氨基酸序列的cdr-h3；(d)包含seqidno:26的氨基酸序列的cdr-l1；(e)包含seqidno:27的氨基酸序列的cdr-l2；以及(f)包含seqidno:28的氨基酸序列的cdr-l3。
在一个方面，抗hiv抗体包含与seqidno:3的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的vh序列。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的vh序列含有相对于参考序列的置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗hiv抗体保留与hiv结合的能力。在一些实施方案中，在seqidno:3的氨基酸序列中，已经置换、插入并且/或者缺失了总计1至10个氨基酸。在一些实施方案中，置换、插入或缺失发生在cdr外的区域中(例如，在fr中)。任选地，该抗hiv抗体包含seqidno:3的氨基酸序列的vh序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定的实施方案中，所述vh包含选自以下的一个、两个或三个cdr：(a)包含seqidno:23的氨基酸序列的cdr-h1，(b)包含seqidno:24的氨基酸序列的cdr-h2，以及(c)包含seqidno:25的氨基酸序列的cdr-h3。
在一个方面，提供了抗hiv抗体，其中所述抗体包含与seqidno:4的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(vl)。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的vl序列含有相对于参考序列的置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗hiv抗体保留与hiv结合的能力。在一些实施方案中，在任一个seqidno:4的氨基酸序列中，已经置换、插入并且/或者缺失了总计1至10个氨基酸。在一些实施方案中，该置换、插入或缺失发生在cdr外的区域中(例如，在fr中)。任选地，该抗hiv抗体包含seqidno:4的vl序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定的实施方案中，所述vl包含选自以下的一个、两个或三个cdr：(a)包含seqidno:26的氨基酸序列的cdr-l1；(b)包含seqidno:27的氨基酸序列的cdr-l2；以及(c)包含seqidno:28的氨基酸序列的cdr-l3。
在一个方面，提供了抗hiv抗体，其中所述抗体包含如任何上文提供的实施方案所述的vh，以及如任何上文提供的实施方案所述的vl。在一些实施方案中，所述抗体包含含有seqidno:3的氨基酸序列的vh，以及seqidno:4中的vl序列，包括这些序列的翻译后修饰。
abv-3
在一个方面，本发明提供了包含至少一个或两个可变区的抗hiv抗体，所述可变区选自(a)包含seqidno:5的氨基酸序列的vh和(b)包含seqidno:6的氨基酸序列的vl。
在一个方面，本发明提供了抗hiv抗体，其包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的cdr：(a)包含seqidno:29的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno:30的氨基酸序列的cdr-h2；(c)包含seqidno:31的氨基酸序列的cdr-h3；(d)包含seqidno:32的氨基酸序列的cdr-l1；(e)包含seqidno:33的氨基酸序列的cdr-l2；以及(f)包含seqidno:34的氨基酸序列的cdr-l3。
在一个方面，本发明提供了抗hiv抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的vhcdr序列：(a)包含seqidno:29的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno:30的氨基酸序列的cdr-h2；以及(c)包含seqidno:31的氨基酸序列的cdr-h3。在一个方面，本发明提供了抗hiv抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自(a)包含seqidno:29的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno:30的氨基酸序列的cdr-h2；以及(c)包含seqidno:31的氨基酸序列的cdr-h3的vhcdr序列；以及(d)包含seqidno:6的氨基酸序列的vl。
在一个方面，本发明提供了抗hiv抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的vlcdr序列：(a)包含seqidno:32的氨基酸序列的cdr-l1；(b)包含seqidno:33的氨基酸序列的cdr-l2；以及(c)包含seqidno:34的氨基酸序列的cdr-l3。在一个方面，本发明提供了抗hiv抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自(a)包含seqidno:32的氨基酸序列的cdr-l1；(b)包含seqidno:33的氨基酸序列的cdr-l2；以及(c)包含seqidno:34的氨基酸序列的cdr-l3的vlcdr序列；以及(d)包含seqidno:5的氨基酸序列的vh。
在一个方面，本发明提供了包含以下cdr的抗hiv抗体：(a)包含seqidno:29的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno:30的氨基酸序列的cdr-h2；(c)包含seqidno:31的氨基酸序列的cdr-h3；(d)包含seqidno:32的氨基酸序列的cdr-l1；(e)包含seqidno:33的氨基酸序列的cdr-l2；以及(f)包含seqidno:34的氨基酸序列的cdr-l3。
在一个方面，抗hiv抗体包含与seqidno:5的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的vh序列。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的vh序列含有相对于参考序列的置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗hiv抗体保留与hiv结合的能力。在一些实施方案中，在seqidno:5的氨基酸序列中，已经置换、插入并且/或者缺失了总计1至10个氨基酸。在一些实施方案中，置换、插入或缺失发生在cdr外的区域中(例如，在fr中)。任选地，该抗hiv抗体包含seqidno:5的氨基酸序列的vh序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定的实施方案中，所述vh包含选自以下的一个、两个或三个cdr：(a)包含seqidno:29的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno:30的氨基酸序列的cdr-h2；以及(c)包含seqidno:31的氨基酸序列的cdr-h3。
在一个方面，提供了抗hiv抗体，其中所述抗体包含与seqidno:6的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(vl)。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的vl序列含有相对于参考序列的置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗hiv抗体保留与hiv结合的能力。在一些实施方案中，在任一个seqidno:6的氨基酸序列中，已经置换、插入并且/或者缺失了总计1至10个氨基酸。在一些实施方案中，该置换、插入或缺失发生在cdr外的区域中(例如，在fr中)。任选地，该抗hiv抗体包含seqidno:6的vl序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定的实施方案中，所述vl包含选自以下的一个、两个或三个cdr：(a)包含seqidno:32的氨基酸序列的cdr-l1；(b)包含seqidno:33的氨基酸序列的cdr-l2；以及(c)包含seqidno:34的氨基酸序列的cdr-l3。
在一个方面，提供了抗hiv抗体，其中所述抗体包含如任何上文提供的实施方案所述的vh，以及如任何上文提供的实施方案所述的vl。在一些实施方案中，所述抗体包含含有seqidno:5的氨基酸序列的vh，以及seqidno:6中的vl序列，包括这些序列的翻译后修饰。
abv-4
在一个方面，本发明提供了包含至少一个或两个可变区的抗hiv抗体，所述可变区选自(a)包含seqidno:7的氨基酸序列的vh和(b)包含seqidno:8的氨基酸序列的vl。
在一个方面，本发明提供了抗hiv抗体，其包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的cdr：(a)包含seqidno:35的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno:36的氨基酸序列的cdr-h2；(c)包含seqidno:37的氨基酸序列的cdr-h3；(d)包含seqidno:38的氨基酸序列的cdr-l1；(e)包含seqidno:39的氨基酸序列的cdr-l2；以及(f)包含seqidno:40的氨基酸序列的cdr-l3。
在一个方面，本发明提供了抗hiv抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的vhcdr序列：(a)包含seqidno:35的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno:36的氨基酸序列的cdr-h2；以及(c)包含seqidno:37的氨基酸序列的cdr-h3。在一个方面，本发明提供了抗hiv抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自(a)包含seqidno:35的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno:36的氨基酸序列的cdr-h2；以及(c)包含seqidno:37的氨基酸序列的cdr-h3的vhcdr序列；以及(d)包含seqidno:8的氨基酸序列的vl。
在一个方面，本发明提供了抗hiv抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的vlcdr序列：(a)包含seqidno:38的氨基酸序列的cdr-l1；(b)包含seqidno:39的氨基酸序列的cdr-l2；以及(c)包含seqidno:40的氨基酸序列的cdr-l3。在一个方面，本发明提供了抗hiv抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自(a)包含seqidno:38的氨基酸序列的cdr-l1；(b)包含seqidno:39的氨基酸序列的cdr-l2；以及(c)包含seqidno:40的氨基酸序列的cdr-l3的vlcdr序列；以及(d)包含seqidno:7的氨基酸序列的vh。
在一个方面，本发明提供了包含以下cdr的抗hiv抗体：(a)包含seqidno:35的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno:36的氨基酸序列的cdr-h2；(c)包含seqidno:37的氨基酸序列的cdr-h3；(d)包含seqidno:38的氨基酸序列的cdr-l1；(e)包含seqidno:39的氨基酸序列的cdr-l2；以及(f)包含seqidno:40的氨基酸序列的cdr-l3。
在一个方面，抗hiv抗体包含与seqidno:7的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的vh序列。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的vh序列含有相对于参考序列的置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗hiv抗体保留与hiv结合的能力。在一些实施方案中，在seqidno:7的氨基酸序列中，已经置换、插入并且/或者缺失了总计1至10个氨基酸。在一些实施方案中，置换、插入或缺失发生在cdr外的区域中(例如，在fr中)。任选地，该抗hiv抗体包含seqidno:7的氨基酸序列的vh序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定的实施方案中，所述vh包含选自以下的一个、两个或三个cdr：(a)包含seqidno:35的氨基酸序列的cdr-h1，(b)包含seqidno:36的氨基酸序列的cdr-h2，以及(c)包含seqidno:37的氨基酸序列的cdr-h3。
在一个方面，提供了抗hiv抗体，其中所述抗体包含与seqidno:8的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(vl)。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的vl序列含有相对于参考序列的置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗hiv抗体保留与hiv结合的能力。在一些实施方案中，在任一个seqidno:8的氨基酸序列中，已经置换、插入并且/或者缺失了总计1至10个氨基酸。在一些实施方案中，该置换、插入或缺失发生在cdr外的区域中(例如，在fr中)。任选地，该抗hiv抗体包含seqidno:8的vl序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定的实施方案中，所述vl包含选自以下的一个、两个或三个cdr：(a)包含seqidno:38的氨基酸序列的cdr-l1；(b)包含seqidno:39的氨基酸序列的cdr-l2；以及(c)包含seqidno:40的氨基酸序列的cdr-l3。
在一个方面，提供了抗hiv抗体，其中所述抗体包含如任何上文提供的实施方案所述的vh，以及如任何上文提供的实施方案所述的vl。在一些实施方案中，所述抗体包含含有seqidno:7的氨基酸序列的vh，以及seqidno:8中的vl序列，包括这些序列的翻译后修饰。
abv-5
在一个方面，本发明提供了包含两个可变区的抗hiv抗体，所述可变区选自(a)包含seqidno:9的氨基酸序列的vh和(b)包含seqidno:10的氨基酸序列的vl。
在一个方面，本发明提供了抗hiv抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的vhcdr序列：(a)包含seqidno:41的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno:42的氨基酸序列的cdr-h2；以及(c)包含seqidno:43的氨基酸序列的cdr-h3；以及至少一个、至少两个或全部三个选自以下的vlcdr序列：(d)包含seqidno:44的氨基酸序列的cdr-l1；(e)包含seqidno:45的氨基酸序列的cdr-l2；以及(f)包含seqidno:46的氨基酸序列的cdr-l3。
在一个方面，本发明提供了包含以下cdr的抗hiv抗体：(a)包含seqidno:41的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno:42的氨基酸序列的cdr-h2；(c)包含seqidno:43的氨基酸序列的cdr-h3；(d)包含seqidno:44的氨基酸序列的cdr-l1；(e)包含seqidno:45的氨基酸序列的cdr-l2；以及(f)包含seqidno:46的氨基酸序列的cdr-l3。
在一个方面，抗hiv抗体包含与seqidno:9的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的vh序列。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的vh序列含有相对于参考序列的置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗hiv抗体保留与hiv结合的能力。在一些实施方案中，在seqidno:9的氨基酸序列中，已经置换、插入并且/或者缺失了总计1至10个氨基酸。在一些实施方案中，置换、插入或缺失发生在cdr外的区域中(例如，在fr中)。任选地，该抗hiv抗体包含seqidno:9的氨基酸序列的vh序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定的实施方案中，所述vh包含选自以下的一个、两个或三个cdr：(a)包含seqidno:41的氨基酸序列的cdr-h1，(b)包含seqidno:42的氨基酸序列的cdr-h2，以及(c)包含seqidno:43的氨基酸序列的cdr-h3。
在一个方面，提供了抗hiv抗体，其中所述抗体包含与seqidno:10的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(vl)。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的vl序列含有相对于参考序列的置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗hiv抗体保留与hiv结合的能力。在一些实施方案中，在任一个seqidno:10的氨基酸序列中，已经置换、插入并且/或者缺失了总计1至10个氨基酸。在一些实施方案中，该置换、插入或缺失发生在cdr外的区域中(例如，在fr中)。任选地，该抗hiv抗体包含seqidno:10的vl序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定的实施方案中，所述vl包含选自以下的一个、两个或三个cdr：(a)包含seqidno:44的氨基酸序列的cdr-l1；(b)包含seqidno:45的氨基酸序列的cdr-l2；以及(c)包含seqidno:46的氨基酸序列的cdr-l3。
在一个方面，提供了抗hiv抗体，其中所述抗体包含如任何上文提供的实施方案所述的vh，以及如任何上文提供的实施方案所述的vl。在一些实施方案中，所述抗体包含含有seqidno:9的氨基酸序列的vh，以及seqidno:10中的vl序列，包括这些序列的翻译后修饰。abv-6
在一个方面，本发明提供了包含两个可变区的抗hiv抗体，所述可变区选自(a)包含seqidno:11的氨基酸序列的vh和(b)包含seqidno:12的氨基酸序列的vl。
在一个方面，本发明提供了抗hiv抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的vhcdr序列：(a)包含seqidno:47的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno:48的氨基酸序列的cdr-h2；以及(c)包含seqidno:49的氨基酸序列的cdr-h3；以及至少一个、至少两个或全部三个选自以下的vlcdr序列：(d)包含seqidno:50的氨基酸序列的cdr-l1；(e)包含seqidno:51的氨基酸序列的cdr-l2；以及(f)包含seqidno:52的氨基酸序列的cdr-l3。
在一个方面，本发明提供了包含以下cdr的抗hiv抗体：(a)包含seqidno:47的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno:48的氨基酸序列的cdr-h2；以及(c)包含seqidno:49的氨基酸序列的cdr-h3；(d)包含seqidno:50的氨基酸序列的cdr-l1；(e)包含seqidno:51的氨基酸序列的cdr-l2；以及(f)包含seqidno:52的氨基酸序列的cdr-l3。
在一个方面，抗hiv抗体包含与seqidno:11的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的vh序列。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的vh序列含有相对于参考序列的置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗hiv抗体保留与hiv结合的能力。在一些实施方案中，在seqidno:11的氨基酸序列中，已经置换、插入并且/或者缺失了总计1至10个氨基酸。在一些实施方案中，置换、插入或缺失发生在cdr外的区域中(例如，在fr中)。任选地，该抗hiv抗体包含seqidno:11的氨基酸序列的vh序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定的实施方案中，所述vh包含选自以下的一个、两个或三个cdr：(a)包含seqidno:47的氨基酸序列的cdr-h1，(b)包含seqidno:48的氨基酸序列的cdr-h2，以及(c)包含seqidno:49的氨基酸序列的cdr-h3。
在一个方面，提供了抗hiv抗体，其中所述抗体包含与seqidno:12的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(vl)。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的vl序列含有相对于参考序列的置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗hiv抗体保留与hiv结合的能力。在一些实施方案中，在任一个seqidno:12的氨基酸序列中，已经置换、插入并且/或者缺失了总计1至10个氨基酸。在一些实施方案中，该置换、插入或缺失发生在cdr外的区域中(例如，在fr中)。任选地，该抗hiv抗体包含seqidno:12的vl序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定的实施方案中，所述vl包含选自以下的一个、两个或三个cdr：(a)包含seqidno:50的氨基酸序列的cdr-l1；(b)包含seqidno:51的氨基酸序列的cdr-l2；以及(c)包含seqidno:52的氨基酸序列的cdr-l3。
在一个方面，提供了抗hiv抗体，其中所述抗体包含如任何上文提供的实施方案所述的vh，以及如任何上文提供的实施方案所述的vl。在一些实施方案中，所述抗体包含含有seqidno:11的氨基酸序列的vh，以及seqidno:12中的vl序列，包括这些序列的翻译后修饰。abv-7
在一个方面，本发明提供了包含至少一个或两个可变区的抗hiv抗体，所述可变区选自(a)包含seqidno:13的氨基酸序列的vh和(b)包含seqidno:14的氨基酸序列的vl。
在一个方面，本发明提供了抗hiv抗体，其包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的cdr：(a)包含seqidno:53的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno:54的氨基酸序列的cdr-h2；(c)包含seqidno:55的氨基酸序列的cdr-h3；(d)包含seqidno:56的氨基酸序列的cdr-l1；(e)包含seqidno:57的氨基酸序列的cdr-l2；以及(f)包含seqidno:58的氨基酸序列的cdr-l3。
在一个方面，本发明提供了抗hiv抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的vhcdr序列：(a)包含seqidno:53的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno:54的氨基酸序列的cdr-h2；以及(c)包含seqidno:55的氨基酸序列的cdr-h3。在一个方面，本发明提供了抗hiv抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自(a)包含seqidno:53的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno:54的氨基酸序列的cdr-h2；以及(c)包含seqidno:55的氨基酸序列的cdr-h3的vhcdr序列；以及(d)包含seqidno:8的氨基酸序列的vl。在一个方面，本发明提供了抗hiv抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的vlcdr序列：(a)包含seqidno:56的氨基酸序列的cdr-l1；(b)包含seqidno:57的氨基酸序列的cdr-l2；以及(c)包含seqidno:58的氨基酸序列的cdr-l3。在一个方面，本发明提供了抗hiv抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自(a)包含seqidno:56的氨基酸序列的cdr-l1；(b)包含seqidno:57的氨基酸序列的cdr-l2；以及(c)包含seqidno:58的氨基酸序列的cdr-l3的vlcdr序列；以及(d)包含seqidno:13的氨基酸序列的vh。
在一个方面，本发明提供了包含以下cdr的抗hiv抗体：(a)包含seqidno:53的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno:54的氨基酸序列的cdr-h2；(c)包含seqidno:55的氨基酸序列的cdr-h3；(d)包含seqidno:56的氨基酸序列的cdr-l1；(e)包含seqidno:57的氨基酸序列的cdr-l2；以及(f)包含seqidno:58的氨基酸序列的cdr-l3。
在一个方面，抗hiv抗体包含与seqidno:13的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的vh序列。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的vh序列含有相对于参考序列的置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗hiv抗体保留与hiv结合的能力。在一些实施方案中，在seqidno:13的氨基酸序列中，已经置换、插入并且/或者缺失了总计1至10个氨基酸。在一些实施方案中，置换、插入或缺失发生在cdr外的区域中(例如，在fr中)。任选地，该抗hiv抗体包含seqidno:13的氨基酸序列的vh序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定的实施方案中，所述vh包含选自以下的一个、两个或三个cdr：(a)包含seqidno:53的氨基酸序列的cdr-h1，(b)包含seqidno:54的氨基酸序列的cdr-h2，以及(c)包含seqidno:55的氨基酸序列的cdr-h3。
在一个方面，提供了抗hiv抗体，其中所述抗体包含与seqidno:14的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(vl)。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的vl序列含有相对于参考序列的置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗hiv抗体保留与hiv结合的能力。在一些实施方案中，在任一个seqidno:14的氨基酸序列中，已经置换、插入并且/或者缺失了总计1至10个氨基酸。在一些实施方案中，该置换、插入或缺失发生在cdr外的区域中(例如，在fr中)。任选地，该抗hiv抗体包含seqidno:14的vl序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定的实施方案中，所述vl包含选自以下的一个、两个或三个cdr：(a)包含seqidno:56的氨基酸序列的cdr-l1；(b)包含seqidno:57的氨基酸序列的cdr-l2；以及(c)包含seqidno:58的氨基酸序列的cdr-l3。
在一个方面，提供了抗hiv抗体，其中所述抗体包含如任何上文提供的实施方案所述的vh，以及如任何上文提供的实施方案所述的vl。在一些实施方案中，所述抗体包含含有seqidno:13的氨基酸序列的vh，以及seqidno:14中的vl序列，包括这些序列的翻译后修饰。abv-8
在一个方面，本发明提供了抗hiv抗体，其包含含有seqidno:15的氨基酸序列的可变区vh。在一个方面，本发明提供了抗hiv抗体，其包含含有seqidno:15的氨基酸序列的可变区vh；以及配对的vl区。
在一个方面，本发明提供了抗hiv抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的vhcdr序列：(a)包含seqidno:59的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno:60的氨基酸序列的cdr-h2；以及(c)包含seqidno:61的氨基酸序列的cdr-h3。
在一个方面，本发明提供了抗hiv抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自(a)包含seqidno:59的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno:60的氨基酸序列的cdr-h2；以及(c)包含seqidno:61的氨基酸序列的cdr-h3的vhcdr序列；以及(d)配对的vl区。
在一个方面，本发明提供了抗hiv抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的vhcdr序列：(a)包含seqidno:59的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno:60的氨基酸序列的cdr-h2；以及(c)包含seqidno:61的氨基酸序列的cdr-h3；以及至少一个、至少两个或全部三个选自配对的vl区的vlcdr序列。
在一个方面，本发明提供了包含以下cdr的抗hiv抗体：(a)包含seqidno:59的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno:60的氨基酸序列的cdr-h2；以及(c)包含seqidno:61的氨基酸序列的cdr-h3；以及全部三个选自配对的vl区的vlcdr序列。
在一个方面，抗hiv抗体包含与seqidno:15的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的vh序列。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的vh序列含有相对于参考序列的置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗hiv抗体保留与hiv结合的能力。在一些实施方案中，在seqidno:15的氨基酸序列中，已经置换、插入并且/或者缺失了总计1至10个氨基酸。在一些实施方案中，置换、插入或缺失发生在cdr外的区域中(例如，在fr中)。任选地，该抗hiv抗体包含seqidno:15的氨基酸序列的vh序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定的实施方案中，所述vh包含选自以下的一个、两个或三个cdr：(a)包含seqidno:59的氨基酸序列的cdr-h1，(b)包含seqidno:60的氨基酸序列的cdr-h2，以及(c)包含seqidno:61的氨基酸序列的cdr-h3。
在一个方面，提供了抗hiv抗体，其中所述抗体包含如任何上文提供的实施方案所述的vh，以及如任何上文提供的实施方案所述的vl。在一些实施方案中，所述抗体包含含有seqidno:15的氨基酸序列的vh，以及配对的vl序列，包括这些序列的翻译后修饰。
abv-9
在一个方面，本发明提供了抗hiv抗体，其包含含有seqidno:16的氨基酸序列的可变区。在一个方面，本发明提供了包含可变区的抗hiv抗体，所述可变区选自(a)包含seqidno:16的氨基酸序列的vh和(b)包含seqidno:4的氨基酸序列的vl。在一个方面，本发明提供了包含可变区的抗hiv抗体，所述可变区选自(a)包含seqidno:16的氨基酸序列的vh和(b)包含seqidno:65的氨基酸序列的vl。
在一个方面，本发明提供了抗hiv抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的vhcdr序列：(a)包含seqidno:62的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno:63的氨基酸序列的cdr-h2；以及(c)包含seqidno:64的氨基酸序列的cdr-h3。
在一个方面，本发明提供了抗hiv抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自(a)包含seqidno:62的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno:63的氨基酸序列的cdr-h2；以及(c)包含seqidno:64的氨基酸序列的cdr-h3的vhcdr序列；以及(d)包含seqidno:16的氨基酸序列的vl。
在一个方面，本发明提供了抗hiv抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自(a)包含seqidno:62的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno:63的氨基酸序列的cdr-h2；以及(c)包含seqidno:64的氨基酸序列的cdr-h3的vhcdr序列；以及(d)包含seqidno:65的氨基酸序列的vl。
在一个方面，本发明提供了抗hiv抗体，其包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的cdr：(a)包含seqidno:62的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno:63的氨基酸序列的cdr-h2；(c)包含seqidno:64的氨基酸序列的cdr-h3；(d)包含seqidno:26的氨基酸序列的cdr-l1；(e)包含seqidno:27的氨基酸序列的cdr-l2；以及(f)包含seqidno:28的氨基酸序列的cdr-l3。
在一个方面，本发明提供了包含以下cdr的抗hiv抗体：(a)包含seqidno:62的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno:63的氨基酸序列的cdr-h2；(c)包含seqidno:64的氨基酸序列的cdr-h3；(d)包含seqidno:26的氨基酸序列的cdr-l1；(e)包含seqidno:27的氨基酸序列的cdr-l2；以及(f)包含seqidno:28的氨基酸序列的cdr-l3。
在一个方面，本发明提供了抗hiv抗体，其包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的cdr：(a)包含seqidno:62的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno:63的氨基酸序列的cdr-h2；(c)包含seqidno:64的氨基酸序列的cdr-h3；(d)包含seqidno:66的氨基酸序列的cdr-l1；(e)包含seqidno:67的氨基酸序列的cdr-l2；以及(f)包含seqidno:68的氨基酸序列的cdr-l3。
在一个方面，本发明提供了包含以下cdr的抗hiv抗体：(a)包含seqidno:62的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno:63的氨基酸序列的cdr-h2；(c)包含seqidno:64的氨基酸序列的cdr-h3；(d)包含seqidno:66的氨基酸序列的cdr-l1；(e)包含seqidno:67的氨基酸序列的cdr-l2；以及(f)包含seqidno:68的氨基酸序列的cdr-l3。
abv-9a
在一个方面，抗hiv抗体包含与seqidno:16的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的vh序列。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的vh序列含有相对于参考序列的置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗hiv抗体保留与hiv结合的能力。在一些实施方案中，在seqidno:16的氨基酸序列中，已经置换、插入并且/或者缺失了总计1至10个氨基酸。在一些实施方案中，置换、插入或缺失发生在cdr外的区域中(例如，在fr中)。任选地，该抗hiv抗体包含seqidno:16的氨基酸序列的vh序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定的实施方案中，所述vh包含选自以下的一个、两个或三个cdr：(a)包含seqidno:62的氨基酸序列的cdr-h1，(b)包含seqidno:63的氨基酸序列的cdr-h2，以及(c)包含seqidno:64的氨基酸序列的cdr-h3。
在一个方面，提供了抗hiv抗体，其中所述抗体包含与seqidno:4的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(vl)。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的vl序列含有相对于参考序列的置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗hiv抗体保留与hiv结合的能力。在一些实施方案中，在任一个seqidno:4的氨基酸序列中，已经置换、插入并且/或者缺失了总计1至10个氨基酸。在一些实施方案中，该置换、插入或缺失发生在cdr外的区域中(例如，在fr中)。任选地，该抗hiv抗体包含seqidno:4的vl序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定的实施方案中，所述vl包含选自以下的一个、两个或三个cdr：(a)包含seqidno:26的氨基酸序列的cdr-l1；(b)包含seqidno:27的氨基酸序列的cdr-l2；以及(c)包含seqidno:28的氨基酸序列的cdr-l3。
在一个方面，提供了抗hiv抗体，其中所述抗体包含如任何上文提供的实施方案所述的vh，以及如任何上文提供的实施方案所述的vl。在一些实施方案中，所述抗体包含含有seqidno:16的氨基酸序列的vh，以及seqidno:4中的vl序列，包括这些序列的翻译后修饰。
abv-9b
在一个方面，抗hiv抗体包含与seqidno:16的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的vh序列。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的vh序列含有相对于参考序列的置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗hiv抗体保留与hiv结合的能力。在一些实施方案中，在seqidno:16的氨基酸序列中，已经置换、插入并且/或者缺失了总计1至10个氨基酸。在一些实施方案中，置换、插入或缺失发生在cdr外的区域中(例如，在fr中)。任选地，该抗hiv抗体包含seqidno:16的氨基酸序列的vh序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定的实施方案中，所述vh包含选自以下的一个、两个或三个cdr：(a)包含seqidno:62的氨基酸序列的cdr-h1，(b)包含seqidno:63的氨基酸序列的cdr-h2，以及(c)包含seqidno:64的氨基酸序列的cdr-h3。
在一个方面，提供了抗hiv抗体，其中所述抗体包含与seqidno:65的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(vl)。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的vl序列含有相对于参考序列的置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗hiv抗体保留与hiv结合的能力。在一些实施方案中，在任一个seqidno:65的氨基酸序列中，已经置换、插入并且/或者缺失了总计1至10个氨基酸。在一些实施方案中，该置换、插入或缺失发生在cdr外的区域中(例如，在fr中)。任选地，该抗hiv抗体包含seqidno:65的vl序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定的实施方案中，所述vl包含选自以下的一个、两个或三个cdr：(a)包含seqidno:66的氨基酸序列的cdr-l1；(b)包含seqidno:67的氨基酸序列的cdr-l2；以及(c)包含seqidno:68的氨基酸序列的cdr-l3。
在一个方面，提供了抗hiv抗体，其中所述抗体包含如任何上文提供的实施方案所述的vh，以及如任何上文提供的实施方案所述的vl。在一些实施方案中，所述抗体包含含有seqidno:16的氨基酸序列的vh，以及seqidno:68中的vl序列，包括这些序列的翻译后修饰。
在一些实施方案中，所述抗hiv抗体为人单克隆抗体abv-1。该抗体的重链和轻链的氨基酸序列分别呈现于seqidno:1和2中。在一些实施方案中，所述抗hiv抗体为人单克隆抗体abv-2。该抗体的重链和轻链的氨基酸序列分别呈现于seqidno:3和4中。在一些实施方案中，所述抗hiv抗体为人单克隆抗体abv-3。该抗体的重链和轻链的氨基酸序列分别呈现于seqidno:5和6中。在一些实施方案中，所述抗hiv抗体为人单克隆抗体abv-4。该抗体的重链和轻链的氨基酸序列分别呈现于seqidno:7和8中。在一些实施方案中，所述抗hiv抗体为人单克隆抗体abv-5。该抗体的重链和轻链的氨基酸序列分别呈现于seqidno:9和10中。在一些实施方案中，所述抗hiv抗体为人单克隆抗体abv-6。该抗体的重链和轻链的氨基酸序列分别呈现于seqidno:11和12中。在一些实施方案中，所述抗hiv抗体为人单克隆抗体abv-7。该抗体的重链和轻链的氨基酸序列分别呈现于seqidno:13和14中。在一些实施方案中，所述抗hiv抗体为人单克隆抗体abv-8。该抗体的重链的核酸序列呈现于seqidno:15中。在一些实施方案中，所述抗hiv抗体为人单克隆抗体abv-9a。该抗体的重链和轻链的氨基酸序列分别呈现于seqidno:16和4中。在一些实施方案中，所述抗hiv抗体为人单克隆抗体abv-9b。该抗体的重链和轻链的氨基酸序列分别呈现于seqidno:16和65中。
在一些实施方案中，所述抗hiv抗体为衍生自任何上文提及的人类抗体的嵌合抗体。在一些实施方案中，所述抗hiv抗体为人源化抗体。在一些实施方案中，所述抗hiv抗体为人类抗体。
在其他方面，根据任何上文实施方案的抗hiv抗体可以单独或组合地并入如下所述的任何特征。
抗体特性
突变频率
本发明的抗体可以包含来自种系序列的突变频率为至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％或更高的重链序列。本发明的抗体可以包含cdr3区，该cdr3区为来自种系序列的突变频率为至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％或更高的轻链序列。本发明的抗体可以包含来自种系序列的突变频率为至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％或更高的重链序列和轻链序列。本发明的抗体可以包含来自vh家族的vh区，该vh家族选自vh家族4-59中的任一个。
重链和轻链的长度
本发明的抗体可以包含长度为至少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸的cdr3区。本发明的抗体可以包含长度为至少约18个氨基酸的cdr3区。
本发明的抗体可以在轻链末端处包含缺失。本发明的抗体可以在轻链末端处包含3个或更多个氨基酸的缺失。本发明的抗体可以在轻链末端处包含7个或更少氨基酸的缺失。本发明的抗体可以在轻链末端处包含3、4、5、6或7个氨基酸的缺失。
本发明的抗体可以在轻链中包含插入。本发明的抗体可以在轻链中包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸的插入。本发明的抗体可以在轻链中包含3个氨基酸的插入。
亲和力
亲和力为分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间总的非共价相互作用的强度。除非另有说明，否则如本文所用的，“结合亲和力”是指反映结合对成员(例如，抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子x对其配偶体y的亲和力通常可以由解离常数(kd)表示。亲和力可以通过许多已知方法中的任一种来测量，包括那些常用的和/或那些本文所述的方法。以下描述了用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施方案。
在一些实施方案中，本文提供的抗体具有约1μm、100nm、10nm、5nm、2nm、1nm、0.5nm、0.1nm、0.05nm、0.01nm或0.001nm或更小(例如，10-8m或更小，例如，10-8m至10-13m，例如，10-9m至10-13m)的解离常数(kd)。抗体靶标可以为hiv靶标。该抗体靶标可以为hiv-1靶标。该抗体靶标可以为hiv-2靶标。该抗体靶标可以为hiv-1m组靶标。该抗体靶标可以为hiv-1n组靶标、hiv-1o组靶标和/或hiv-1p组靶标。该hiv靶标可以为hiv-1进化枝a(包括a1和/或a2)、b、c、d、e、f(包括f1和/或f2)、g、h、i、j、k或其任何组合、亚型或重组衍生物(包括循环重组形式(crf))。本发明的另一方面提供了对其hiv靶标具有增加的亲和力的抗hiv抗体，例如亲和力成熟的抗hiv抗体。亲和力成熟的抗体是与不具有改变的亲本抗体相比在一个或多个高变区(hvr)中具有一个或多个改变的抗体，这样的变化导致抗体对抗原的亲和力提高。这些抗体可以以约5×10-9m、2×10-9m、1×10-9m、5×10-10m、2×10-9m、1×10-10m、5×10-11m、1×10-11m、5×10-12m、1×10-12m或更小的kd与hiv结合。在一些实施方案中，本发明提供了与包含seqidno:69的重链序列、seqidno:70的轻链序列或二者的种系抗hiv抗体相比具有增加至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍或更多的亲和力的抗hiv抗体。在其他实施方案中，提供了与本文所述的抗hiv抗体竞争结合相同表位的抗体。在一些实施方案中，与抗hiv抗体结合相同表位和/或竞争结合相同表位的抗体表现出效应子功能活性，诸如例如fc介导的细胞毒性，包括adcc活性。
可以通过任何合适的测定法测量kd。例如，可以通过放射性标记的抗原结合测定(ria)测量kd(参见例如，chen等人,j.mol.biol.293:865-881(1999)；presta等人,cancerres.57:4593-4599(1997))。例如，可以使用表面等离子体共振测定(例如，使用
抗体片段
抗体片段包含完整抗体的一部分，如完整抗体的抗原结合区或可变区。在本发明的其他方面，根据任何上述实施方案的抗hiv抗体为单克隆抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体或人类抗体。抗体片段包括但不限于fab、fab'、fab'-sh、f(ab')2、fv、双抗体、线性抗体、由抗体片段和scfv片段形成的多特异性抗体以及如下所述的其他片段。在另一个实施方案中，该抗体为全长抗体，例如，如本文所述的完整igg1抗体或其他抗体类别或同种型。(参见例如，hudson等人,nat.med.9:129-134(2003)；pluckthiin,thepharmacologyofmonoclonalantibodies,vol.113,pp.269-315(1994)；hollinger等人,proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448(1993)；wo93/01161；以及美国专利号5,571,894、5,869,046、6,248,516和5,587,458)。全长抗体、完整抗体或全抗体是具有与天然抗体结构基本相似的结构的抗体或具有含有如本文所定义的fc区的重链的抗体。如本文所述，抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如，大肠杆菌(e.coli)或噬菌体)的生产。
fv为含有完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该片段含有一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域紧密非共价缔合的二聚体。从这两个结构域的折叠产生六个高变环(来自h链和l链的各三个环)，其贡献用于抗原结合的氨基酸残基并且为该抗体赋予抗原特结合异性。然而，即使是单个可变区(或仅包含三个对抗原有特异性的cdr的fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，只不过其亲和力低于整个结合位点。
单链fv(sfv或scfv)为包含连接成单个多肽链的vh抗体结构域和vl抗体结构域的抗体片段。该sfv多肽可以进一步包含在vh域与vl域之间的多肽连接体，其使得sfv能够形成抗原结合所需的结构。(参见，例如，pluckthuninthepharmacologyofmonoclonalantibodies,第113卷,rosenburg和moore编,springer-verlag,newyork,pp.269-315(1994)；borrebaeck1995,见下文)。在一些实施方案中，该sfv可存在于嵌合抗原受体(car)中。
双抗体是通过构建在vh域与vl域之间具有短连接体(约5-10个残基)的sfv片段，使得实现v结构域的链间配对而不是链内配对，从而产生二价片段，而制备的小抗体片段。双特异性双抗体为两种交叉sfv片段的异二聚体，其中两种抗体的vh域和vl域存在于不同的多肽链上。(参见，例如，ep404,097；wo93/11161；以及hollinger等人,proc.natl.acad.sci.usa,90:6444-6448(1993))。
可以以完全人类的形式产生的结构域抗体(dab)是抗体的已知最小的抗原结合片段(约11kda至约15kda)。dab为免疫球蛋白重链和轻链的稳健可变区(分别为vh和vl)。它们在微生物细胞培养中高度表达，显示出包括但不限于例如溶解度和温度稳定性的有利的生物物理特性，并且非常适合通过体外选择系统(例如，噬菌体展示)进行选择和亲和力成熟。dab作为单体具有生物学活性，并且由于其较小的尺寸和固有的稳定性，其可以设计为更大的分子以产生具有延长的血清半衰期或其他药学活性的药物。(参见例如，w09425591和us20030130496)。
fv和sfv为具有缺乏恒定区的完整结合位点的种类。因此，它们适用于降低体内使用期间的非特异性结合。可以构建sfv融合蛋白以在sfv的氨基或羧基末端处产生效应蛋白的融合。该抗体片段还可以是“线性抗体”。(参见例如，美国专利号5,641,870)。这样的线性抗体片段可以是单特异性或双特异性的。
嵌合抗原受体(car)
示例性的抗原受体(包括car)以及用于将这类受体工程化并引入细胞的方法包括在例如国际专利申请公开号wo200014257、wo2013126726、wo2012/129514、wo2014031687、wo2013/166321、wo2013/071154、wo2013/123061、美国专利申请公开号us2002131960、us2013287748、us20130149337、美国专利号6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118，以及欧洲专利申请号ep2537416中所述的抗原受体和方法，和/或由sadelain等人,cancerdiscov.2013年4月；3(4):388–398；davila等人,(2013)plosone8(4):e61338；turtle等人,curr.opin.immunol.,2012年10月；24(5):633-39；wu等人,cancer,2012年3月18日(2):160-75所述的抗原受体和方法。在一些方面，抗原受体包括如美国专利号7,446,190中描述的car，以及国际专利申请号wo/2014055668a1中描述的car。car的实例包括如任何前述出版物，诸如wo2014031687、us8,339,645、us7,446,179、us2013/0149337、美国专利号：7,446,190、美国专利号：8,389,282、kochenderfer等人,2013,naturereviewsclinicaloncology,10,267-276(2013)；wang等人(2012)j.immunother.35(9):689-701；和brentjens等人,scitranslmed.20135(177)所公开的car。还参见wo2014031687、us8,339,645、us7,446,179、us2013/0149337、美国专利号：7,446,190和美国专利号8,389,282。嵌合受体如car通常包括细胞外抗原结合域，如抗体分子的一部分，该细胞外抗原结合域通常是抗体的可变重(vh)链区和/或可变轻(vl)链区，例如sctv抗体片段。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体(car)可以包含含有t细胞受体的细胞内结构域的细胞内结构域和含有抗体的抗原结合部分(例如，抗体的sfv)的细胞外部分。通常，嵌合受体(例如，car)包含在抗原结合部分与跨膜结构域之间的连接体或间隔区结构域。在一些实施方案中，该连接体或间隔区衍生自免疫球蛋白铰链区。除了编码包含t细胞受体的细胞内结构域的细胞内结构域和包含抗体的抗原结合部分(例如，抗体的sfv)的细胞外部分之外还编码car构建体(在一些实施方案中为car载体)的核酸可以包含启动子。例如，启动子可以是合成的启动子，含有用骨髓增生性肉瘤病毒增强子修饰的momulvltr的u3区。在其他实施方案中，启动子可以是ef1a启动子或ef1启动子。在一些实施方案中，car可以包含含有共刺激结构域和t细胞受体的细胞内结构域的细胞内结构域，以及包含抗体(如本文提供的一种或多种抗体，该抗体可为单链抗体或其片段)的细胞外部分。在一些实施方案中，该抗体为sfv或scfv，或包含sfv或scfv。在一些实施方案中，该car可以进一步包含附加的细胞外部分，如间隔区和/或铰链区。
在任何上述实施方案中，嵌合分子(例如，嵌合受体，例如car)内的抗体(如sfv)可包含抗体的vh域和vl域。例如，sfv可以包含来自abv-1、abv-2、abv-3、abv-4、abv-5、abv-6、abv-7、abv-8、abv-9、abv-9a或abv-9b中任一个的vh域与来自abv-1、abv-2、abv-3、abv-4、abv-5、abv-6、abv-7、abv-8、abv-9、abv-9a或abv-9b中任一个的vl域的组合。例如，可以通过合成由许多连接体中的一个分隔的重链和轻链的密码子优化序列而产生sfv。
在一些方面，富含甘氨酸和丝氨酸(和/或苏氨酸)的连接体包括至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的这些氨基酸。在一些实施方案中，它们包括至少或约50％、55％、60％、70％或75％的甘氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸。在一些实施方案中，连接体基本上完全由甘氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸组成。连接体的长度通常为约5个氨基酸至约50个氨基酸，通常为10个氨基酸或30个氨基酸或约10至约30个氨基酸，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸，并且在一些实例中长度为10个氨基酸至25个氨基酸。示例性连接体包括具有不同数目的序列ggggs(4gs)或gggs(3gs)的重复，诸如这种序列的2、3、4至5次重复的连接体。示例性连接体包括具有ggggsggggsggggs或由之组成的连接体。示例性连接体进一步包括具有序列gstsgsgkpgsgegstkg或由之组成的连接体。
在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包括共刺激受体如cd28、cd137(4-1bb)、ox40和/或icos的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，car包括调节tcr复合体的初级激活的初级细胞质信号传导序列。以刺激方式起作用的初级细胞质信号传导序列可含有被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或itam的信号传导基序。含有初级细胞质信号传导序列的itam的实例包括衍生自tcrζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd8、cd22、cd79a、cd79b和cd66d的itam。在一些实施方案中，tcr样car中的细胞质信号传导分子含有细胞质信号传导结构域、其部分或衍生自cd3ζ的序列。
可以将示例性car载体(包含编码car的核酸)转染至t细胞中。该t细胞可以为cd8+t细胞。在一些实施方案中，被转染并表达car的cd8+t细胞可以识别感染细胞的增殖、杀伤和/或病毒复制抑制。在其他实施方案中，用car转染的t细胞可以为cd4+t细胞。在一些实施方案中，可以进一步修饰经car修饰的cd4+t细胞，使其不再表达cd4。在一些实施方案中，可以进一步修饰用car转染的t细胞以使其缺乏参与hiv感染的共同受体，如ccr2b、ccr3、cxcr4和/或ccr5。例如，可以用诸如sirna等试剂转染t细胞以降低或敲减参与hiv感染的一种或多种共同受体(如ccr2b、ccr3、cxcr4和/或ccr5)的表达。在一些实施方案中，可以通过靶向基因组编辑工具(如锌指核酸酶(zfn)、转录激活物样效应物核酸酶(talen)、crispr/cas系统、rna引导的内切核酸酶和/或工程化大范围核酸酶再工程化归巢核酸内切酶)降低或敲减参与hiv感染的一种或多种这些共同受体的表达。
嵌合抗体和人源化抗体
在一些实施方案中，本文提供的抗体为嵌合抗体(参见例如，美国专利号4,816,567；以及morrison等人,proc.natl.acad.sci.usa,81:6851-6855(1984))。嵌合抗体通常是指其中重链和/或轻链的一部分来自特定的来源或物种，而该重链和/或轻链的其余部分来自不同来源或物种的抗体。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，来自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物如猴的可变区)和人恒定区。在进一步的实例中，嵌合抗体是“类别转换的”抗体，其中类别或亚类已经从亲本抗体的类别或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述抗体为人源化抗体(参见例如，almagro和fransson,front.biosci.13:1619-1633(2008)；riechmann等人,nature332:323-329(1988)；queen等人,proc.nat'lacad.sci.usa86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321以及7,087,409；kashmiri等人,methods36:25-34(2005)；padlan,mol.immunol.28:489-498(1991)；dall'acqua等人,methods36:43-60(2005)；osbourn等人,methods36:61-68(2005)；以及klimka等人,br.j.cancer,83:252-260(2000))。
可以对非人抗体进行人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。人源化抗体可以包含一个或多个可变域，该可变域包含一个或多个来自非人抗体的cdr或其部分。人源化抗体可以包含一个或多个可变域，该可变域包含一个或多个来自人类抗体序列的fr或其部分。人源化抗体可以任选地包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一个或多个fr残基被来自非人抗体(例如，cdr残基来源的抗体)的相应残基置换，例如，以便恢复或改善抗体特异性或亲和力。
可用于人源化的人构架区包括但不限于：使用“最适合”方法选择的构架区；源自具有特定亚组的轻链或重链可变区的人类抗体的共有序列的构架区；人成熟(体细胞突变)构架区或人种系构架区；以及通过筛查fr文库得到的构架区(参见例如，sims等人,j.immunol.151:2296(1993)；carter等人,proc.natl.acad.sci.usa,89:4285(1992)；presta等人,j.immunol.,151:2623(1993)；baca等人,j.biol.chem.272:10678-10684(1997)；以及rosok等人,j.biol.chem.271:22611-22618(1996))。
人类抗体
在一些情况下，本文提供的抗体为人类抗体。可以使用各种已知技术产生人类抗体(参见例如，vandijk和vandewinkel,curr.opin.pharmacol.5:368-74(2001)；以及lonberg,curr.opin.immunol.20:450-459(2008))。在一些方面，可以通过向转基因动物施用免疫原(例如，hiv免疫原)来制备人类抗体，该转基因动物已经被修饰以响应抗原攻击而产生完整人类抗体或具有人可变区的完整抗体。(参见例如，lonberg,nat.biotech.23:1117-1125(2005)；美国专利号6,075,181、6,150,584、5,770,429和7,041,870；以及美国专利申请公开号us2007/0061900)。来自由这些动物生成的完整抗体的人可变区可以被进一步修饰，例如，通过与不同的人恒定区结合。
在一些方面，还可通过基于杂交瘤的方法制备人类抗体。例如，可使用人类b细胞杂交瘤技术和其他方法，从人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系产生人类抗体(参见例如，kozborj.immunol.,133:3001(1984)；brodeur等人,monoclonalantibodyproductiontechniquesandapplications,pp.51-63(1987)；boerner等人,j.immunol.,147:86(1991)；li等人,proc.natl.acad.,103:3557-3562(2006)；美国专利号7,189,826；ni,xiandaimianyixue,26(4):265-268(2006)；vollmers和brandlein,histologyandhistopathology,20(3):927-937(2005)；以及vollmers和brandlein,methodsandfindingsinexperimentalandclinicalpharmacology,27(3):185-91(2005))。还可通过分离选自人源噬菌体展示文库的fv克隆可变域序列来生成人类抗体。然后可将这样的可变域序列与期望的人类恒定域组合。
文库衍生化
可以通过针对具有所需活性的抗体筛查组合文库来分离抗体。(参见例如，hoogenboom等人,methodsinmolecularbiology178:1-37(2001)；mccafferty等人,nature348:552-554；clackson等人,nature352:624-628(1991)；marks等人,j.mol.biol.222:581-597(1992)；marks和bradbury,methodsinmolecularbiology248:161-175(2003)；sidhu等人,j.mol.biol.338(2):299-310(2004)；；lee等人,j.mol.biol.340(5):1073-1093(2004)；fellouse,proc.natl.acad.sci.usa101(34):12467-12472(2004)；以及lee等人,j.immunol.methods284(1-2):119-132(2004))。可以分别克隆(例如，通过pcr)vh基因和vl基因的组库并在文库(例如，噬菌体文库)中随机重新组合，并进行筛选(参见例如，winter等人,ann.rev.immunol.,12:433-455(1994))。或者，可以克隆天然组库(例如，来自人的天然租库)以提供针对广泛的非自身抗原和自身抗原的单一来源的抗体，而无需任何免疫接种(参见例如,griffiths等人,emboj,12:725-734(1993).)。或者，可以通过克隆来自干细胞的未重排v基因区段并使用随机引物编码cdr3区或在体外重排v基因区段来合成制备天然文库(参见例如，hoogenboom和winter,j.mol.biol.,227:381-388(1992)；美国专利号5,750,373，以及美国专利公开号us2005/0079574、us2005/0119455、us2005/0266000、us2007/0117126、us2007/0160598、us2007/0237764、us2007/0292936和us2009/0002360)。从人类抗体文库分离的抗体或抗体片段在此被认为是人类抗体或人类抗体片段。
多特异性
在一些情况下，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如，双特异性抗体。多特异性抗体通常是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体(参见例如，美国专利公开号us2008/0069820)。在一些实施方案中，该结合特异性中的一种针对hiv，另一种针对任何其他抗原。在一些实施方案中，双特异性抗体可与hiv的两个不同表位结合。双特异性抗体还可用于将细胞毒性剂定位于感染hiv的细胞。可以将双特异性抗体制备为全长抗体或抗体片段。
用于制备多特异性抗体的示例性技术包括具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达，用于制备fc-异二聚体分子的工程静电转向效应，两种或更多种抗体或片段的交联，使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体，使用“双抗体”技术制备双特异性抗体片段，使用单链fv(sfv)二聚体、制备三特异性抗体，以及“杵臼(knob-in-hole)”工程化(参见例如，milstein和cuello,nature305:537(1983)；wo09/089004a1；wo93/08829；traunecker等人,emboj.10:3655(1991)；美国专利号4,676,980和5,731,168；brennan等人,science,229:81(1985)；kostelny等人,j.immunol.,148(5):1547-1553(1992)；hollinger等人,proc.natl.acad.sci.usa,90:6444-6448(1993)；gruber等人,j.immunol.,152:5368(1994)；以及tutt等人j.immunol.147:60(1991))。具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体也包括在内(参见例如，us2006/0025576)。
变体
在一些实施方案中，设想了本文提供的抗体的氨基酸序列变体。变体通常因一个或多个置换、缺失、添加和/或插入而不同于本文具体公开的多肽。这样的变体可以是天然存在的或可以合成产生的，例如通过修饰本发明的一种或多种上述多肽序列并如本文所述评价该多肽的一种或多种生物学活性，和/或使用许多已知技术中的任一种。例如，可能需要改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学性质。可以通过将适当的修饰引入编码抗体的核苷酸序列或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。这样的修饰包括例如抗体氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或置换。可进行缺失、插入和置换的任意组合以得到最终构建体，条件是最终构建体具有所需的特征，例如抗原结合。
置换、插入和缺失的变体
在一些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。通过置换来诱变的感兴趣位点包括cdr和fr。可将氨基酸置换引入感兴趣的抗体中，并针对所需的活性筛选产物，例如，保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的adcc或cdc。
疏水氨基酸包括：正亮氨酸、met、ala、val、leu和ile。中性亲水氨基酸包括：cys、ser、thr、asn和gln。酸性氨基酸包括：asp和glu。碱性氨基酸包括：his、lys和arg。具有影响链取向的残基的氨基酸包括：gly和pro。芳香族氨基酸包括：trp、tyr和phe。
在一些情况下，置换、插入或缺失可发生在一个或多个cdr内，其中该置换、插入或缺失基本不降低抗体与抗原的结合。例如，可在cdr中进行基本不降低结合亲和力的保守置换。这样的改变可在cdr“热点”或sdr之外。在变体vh和vl序列的一些情况下，每个cdr或者是未改变的，或者含有不超过一个、两个或三个氨基酸置换。
可在cdr中进行改变(例如，置换)，例如以改善抗体亲和力。可在体细胞成熟期间在具有高突变率的编码cdr的密码子中进行这样的改变(参见例如，chowdhury,methodsmol.biol.207:179-196(2008))，并且可对所得变体的结合亲和力进行测试。亲和力成熟(例如，使用易错pcr、链改组、cdr的随机化或寡核苷酸定向诱变)可用于改善抗体亲和力(参见例如，hoogenboom等人inmethodsinmolecularbiology178:1-37(2001))。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴别参与抗原结合的cdr残基(参见例如，cunninghamandwellsscience,244:1081-1085(1989))。特别是cdr-h3和cdr-l3经常被靶向。备选地或附加地，使用抗原-抗体或抗原-tcr复合体的晶体结构来鉴别抗体与抗原之间的接触点。这样的接触残基和相邻残基可作为用于置换的候选物而被靶向或消除。可筛选变体以确定其是否含有所需的特性。
氨基酸序列插入和缺失包括长度从一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽的氨基末端和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入和缺失。末端插入的实例包括具有n末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的n末端或c末端与延长抗体的血清半衰期的酶(例如，用于adept)或多肽的融合。抗体分子的序列内插入变体的实例包括在轻链中插入3个氨基酸。末端缺失的实例包括在轻链末端处具有7个或更少氨基酸缺失的抗体。
糖基化变体
在一些实施方案中，改变抗体以增加或降低其糖基化(例如，通过改变氨基酸序列使得产生或去除一个或多个糖基化位点)。可改变与抗体fc区附接的碳水化合物。来自哺乳动物细胞的天然抗体通常包含通过n连接与fc区的ch2域的asn297附接的分支双触角寡糖(参见例如，wright等人,tibtech15:26-32(1997))。该寡糖可以是与双触角寡糖结构的茎中的glcnac附接的各种碳水化合物，例如，甘露糖、n-乙酰葡糖胺(glcnac)、半乳糖、唾液酸、岩藻糖。可对抗体中的寡糖进行修饰，例如以产生具有某些改善特性的抗体变体。抗体糖基化变体可具有改善的adcc和/或cdc功能。
在一些实施方案中，提供了具有碳水化合物结构的抗体变体，该碳水化合物结构缺乏与fc区附接(直接或间接)的岩藻糖。例如，岩藻糖在这样的抗体中的量可以为1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。通过相对于与asn297附接的所有糖结构的总和计算asn297处糖链内岩藻糖的平均量来确定岩藻糖的量(参见例如，wo08/077546)。asn297是指位于fc区的位置297(fc区残基的eu编号)附近处的天冬酰胺残基；然而，由于抗体中较少的序列变异，asn297还可位于位置297上游或下游约±3个氨基酸处，即在位置294与位置300之间。这样的岩藻糖基化变体可以具有改善的adcc功能(参见例如，专利公开号us2003/0157108；us2004/0093621；us2003/0157108；wo00/61739；wo01/29246；us2003/0115614；us2002/0164328；2004/0093621；us2004/0132140；us2004/0110704；us2004/0110282；us2004/0109865；wo03/085119；wo03/084570；wo05/035586；wo05/035778；wo05/053742；wo02/031140；okazaki等人,j.mol.biol.336:1239-1249(2004)；以及yamane-ohnuki等人biotech.bioeng.87:614(2004))。细胞系，例如敲除细胞系及其使用方法可用于产生去岩藻糖基化的抗体，例如缺乏蛋白质岩藻糖化的lec13cho细胞和α-1,6-岩藻糖基转移酶基因(fut8)敲除cho细胞(参见例如，ripka等人,arch.biochem.biophys.249:533-545(1986)；yamane-ohnuki等人,biotech.bioeng.87:614(2004)；kanda,y.等人,biotechnol.bioeng.,94(4):680-688(2006)；wo03/085107；ep1176195a1,wo04/056312；wo04/057002；wo03/084570；wo03/085119；wo03/056914；wo04/024927；以及美国专利公开号us2003/0157108；us2003/0115614、us2004/093621、us2004/110282、us2004/110704和us2004/132140)。还包括其他抗体糖基化变体(参见例如，美国专利号6,602,684；专利公开号us2005/0123546；wo03/011878；wo97/30087；wo98/58964；以及wo99/22764.)。
因此，本发明的抗hiv抗体可由具有一种或多种外源和/或高内源糖基转移酶活性的宿主细胞产生。具有糖基转移酶活性的基因包括β(1,4)-n-乙酰基葡萄糖胺基转移酶iii(gntii)、α-甘露糖苷酶ii(manii)、β(1,4)-半乳糖基转移酶(galt)、β(1,2)-n-乙酰基葡萄糖胺基转移酶i(gnti)和β(1,2)-n-乙酰基葡萄糖胺基转移酶ii(gntii)。糖基转移酶可包含含有高尔基体定位结构域的融合物(参见例如，lifely等人,glycobiology318:813-22(1995)；schachter,biochem.cellbiol.64:163-81(1986)；美国临时专利申请号60/495,142和60/441,307；专利公开号us2003/0175884和us2004/0241817；以及wo04/065540)。在一些实施方案中，可在包含破坏的或失活的糖基转移酶基因的宿主细胞中表达抗hiv抗体。因此，在一些实施方案中，本发明涉及宿主细胞，其包含(a)分离的核酸，该核酸含有编码具有糖基转移酶活性的多肽的序列；和(b)分离的多核苷酸，该多核苷酸编码结合人类hiv的本发明抗hiv抗体。在特定的实施方案中，由宿主细胞产生的经修饰抗hiv抗体具有包含fc区的igg恒定区或其片段。在另一种特定的实施方案中，该抗hiv抗体是包含fc区的人源化抗体或其片段。分离的核酸是已经从其天然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中包含的核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或位于与其天然染色体位置不同的染色体位置。
由本发明的宿主细胞产生、具有改变的糖基化的抗hiv抗体可显示出增加的fc受体结合亲和力(例如，增加的与fcγ激活受体如fcγriiia受体的结合)和/或增加的效应子功能。增加的效应子功能可以是以下的一项或多项的增加：抗体依赖性细胞毒性增加、抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)增加、细胞因子分泌增加、通过抗原呈递细胞的免疫复合体介导的抗原摄取增加、fc介导的细胞毒性增加、与nk细胞的结合增加、与巨噬细胞的结合增加、与多形核细胞(pmn)的结合增加、与单核细胞的结合增加、与靶标结合的抗体或tcr的交联增加、诱导凋亡的直接信号传导增加、树突细胞成熟增加、以及t细胞引发增加。因此，在一个方面，本发明提供了与未经糖工程化的抗hiv抗体相比，具有增加的效应子功能的抗hiv抗体的糖型。(参见例如，tang等人,j.immunol.179:2815-2823(2007))。
本发明还涉及用于产生具有经修饰的寡糖的本发明抗hiv抗体的方法，该方法包括(a)在允许产生根据本发明抗hiv抗体的条件下培养宿主细胞，该宿主细胞被工程化以表达至少一种编码具有糖基转移酶活性的多肽的核酸，其中所述具有糖基转移酶活性的多肽以足以修饰由来自所述宿主细胞产生的所述抗hiv抗体的fc区中寡糖的量进行表达；以及(b)分离所述抗hiv抗体。在另一个实施方案中，存在两种具有糖基转移酶活性的多肽。本发明方法产生的抗hiv抗体可具有增加的fc受体结合亲和力和/或增加的效应子功能。
在一些实施方案中，抗hiv抗体的fc区中平分的n-连接寡糖的百分比为总寡糖的至少约10％至约100％，具体地至少约50％，更具体地至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90-95％。在另一个实施方案中，由于通过本发明的方法修饰了抗体的寡糖，通过本发明方法产生的抗体在fc区中具有比例增加的非岩藻糖基化寡糖。在一些实施方案中，非岩藻糖基化寡糖的百分比为至少约20％至约100％，具体地为至少约50％、至少约60％至约70％，并且更具体地为至少约75％。非岩藻糖基化寡糖可以为杂合型或复合型。在又一个实施方案中，由于通过本发明方法修饰了抗体的寡糖，通过本发明方法产生的抗体在fc区中具有比例增加的平分的寡糖。在一些实施方案中，平分的寡糖的百分比为至少约20％至约100％，具体地为至少约50％、至少约60％至约70％，并且更具体地为至少约75％。
在另一个实施方案中，本发明涉及通过本发明方法产生的抗hiv抗体，该抗体被工程化以具有增加的效应子功能和/或增加的fc受体结合亲和力。在一些实施方案中，该抗体是完整的抗体。在一些实施方案中，该抗体是含有fc区的抗体片段，或包含与免疫球蛋白的fc区等同的区域的融合蛋白。
在一个方面，本发明提供了用于生成具有修饰的糖基化模式的本发明抗体的宿主细胞表达系统。特别地，本发明提供了用于生成具有改善的治疗价值的本发明抗体的糖型的宿主细胞系统。因此，本发明提供了被选择或工程化以表达具有糖基转移酶活性的多肽的宿主细胞表达系统。
通常，包括上文所述细胞系在内的任何类型的培养细胞系均可用作将本发明的宿主细胞系工程化的背景。在一些实施方案中，cho细胞、bhk细胞、ns0细胞、sp2/0细胞、yo骨髓瘤细胞、p3x63小鼠骨髓瘤细胞、per细胞、per.c6细胞或杂交瘤细胞、其他哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞用作生成本发明的工程化宿主细胞的背景细胞系。
含有本发明抗体的编码序列并且表达生物学活性基因产物的宿主细胞可通过至少四种一般方法来鉴别；(a)dna-dna或dna-rna杂交；(b)“标志物”基因功能的存在或不存在；(c)评估如由宿主细胞中各个mrna转录物的表达所测量的转录水平；以及(d)如通过免疫测定或通过基因产物的生物学活性测量的基因产物的检测。
fc区变体
在一些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的抗体的fc区中，从而产生fc区变体。本文的fc区为含有恒定区的至少一部分的免疫球蛋白重链的c末端区域。fc区包括天然序列fc区和变体fc区。该fc区变体可包含在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如，置换)的人fc区序列(例如，人igg1、igg2、igg3或igg4fc区)。
在一些实施方案中，本发明设想了具有一些但不是全部效应子功能的抗体变体，这使其在抗体的体内半衰期很重要而某些效应子功能(如补体和adcc)是不必要的或有害的应用中成为理想的候选物中。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认cdc和/或adcc活性的降低/耗尽。例如，可以进行fc受体(fcr)结合测定以确保抗体缺乏fcγr结合能力(因此可能缺乏adcc活性)，但保留fcrn结合能力。美国专利号5,500,362和5,821,337中描述了用于评估感兴趣分子的adcc活性的体外测定的非限制性实例。或者，可以采用非放射性测定方法(例如，actitm和cytotox
抗体可以具有延长的半衰期和改善的与新生儿fc受体(fcrn)的结合(参见例如，us2005/0014934)。这样的抗体可包含其中具有改善fc区与fcrn结合的一个或多个置换的fc区，并且包括在以下fc区残基中的一个或多个处具有置换的抗体：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434(参见例如，美国专利号7,371,826)。还设想了fc区变体的其他实例(参见例如，duncan&winter,nature322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260和5,624,821；以及wo94/29351)。
半胱氨酸工程化抗体变体
在一些实施方案中，可能需要产生半胱氨酸工程化抗体，例如“thiomab”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基置换。在一些实施方案中，置换的残基出现在抗体的可接近位点处。反应性巯基基团可以位于与其他部分(如药物部分或连接体-药物部分)偶联的位点以产生免疫偶联物。在一些实施方案中，任一个或多个以下的残基可以被半胱氨酸置换：轻链的v205(kabat编号)；重链a118的(eu编号)；以及重链fc区的s400(eu编号)。半胱氨酸工程化抗体可以如所述生成(参见例如，美国专利号7,521,541)。
抗体衍生物
在一些实施方案中，可进一步修饰本文提供的抗体，以包含已知并且可用的附加非蛋白质部分。适用于抗体衍生的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(peg)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而可在制造中具有优势。
聚合物可以具有任何分子量，并且可以是分支的或无分支的。与抗体附接的聚合物的数目可以变化，并且如果附接了两个或更多个聚合物，则这些聚合物可以是相同或不同的分子。
在另一个实施方案中，提供了可通过暴露于辐射而被选择性加热的抗体与非蛋白质部分的偶联物。在一些实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(参见例如，kam等人,proc.natl.acad.sci.usa102:11600-11605(2005))。辐射可以具有任何波长，并且包括但不限于不伤害普通细胞但将非蛋白质部分加热至接近抗体-非蛋白质部分或tcr-非蛋白质部分的细胞被杀死的温度的波长。
重组方法和组合物
可以使用重组方法和组合物产生抗体(参见例如，美国专利号4,816,567)。在一些实施方案中，提供了本文所述的编码抗hiv抗体的分离的核酸或其片段。这样的核酸可编码包含抗体的vl的氨基酸序列和/或包含抗体的vh的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，提供了包含这样的核酸的一种或多种载体。载体是能够使与其连接的另一核酸增殖的核酸分子。该术语包括作为自我复制的核酸结构的载体以及整合到其被引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。在一些实施方案中，提供了编码car的核酸和/或载体，该car包含源自本文公开的抗hiv抗体的结合域。
在进一步的实施方案中，提供了包含这样的核酸的宿主细胞。宿主细胞是已被引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括初级转化的细胞和由其衍生的子代，而不考虑传代次数。子代在核酸内含物方面不能与亲本细胞完全相同，但可含有突变。本文包括如在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变子代。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含(例如已被转化具有)含有编码包含抗体的vl的氨基酸序列和包含抗体的vh的氨基酸序列的核酸的载体，或含有编码包含抗体的vl的氨基酸序列的核酸的第一载体和含有编码包含抗体的vh的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一些实施方案中，该宿主细胞包含含有编码car的核酸的载体。在一些实施方案中，该宿主细胞是真核细胞，例如，中国仓鼠卵巢(cho)细胞或淋巴样细胞(例如y0、ns0、sp20细胞)。在一些实施方案中，提供了制备抗hiv抗体的方法，其中该方法包括在适用于表达所述抗体的条件下培养如上文提供的包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞，并且任选地从所述宿主细胞或宿主细胞培养基回收所述抗体。在一些实施方案中，该宿主细胞为从患者获得的原代免疫细胞，例如，t细胞。在一些实施方案中，该t细胞为cd4+t细胞、cd8+t细胞、调节性t细胞或nk细胞。
为了重组产生抗hiv抗体，将编码例如如上所述的抗体的分离的核酸插入到一个或多个载体中，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可使用常规程序容易地对这样的核酸进行分离和测序。
用于克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以例如在不需要糖基化和fc效应子功能时，在细菌中产生抗体(参见例如，美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523；charlton,methodsinmolecularbiology,vol.248,pp.245-254(2003))。表达后，可从细菌细胞糊中以可溶级分形式分离抗体，并且可将其进一步纯化。
除原核生物之外，真核微生物如丝状真菌或酵母是编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主(参见例如，gerngross,nat.biotech.22:1409-1414(2004)；以及li等人,nat.biotech.24:210-215(2006))。用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞还来源于多细胞生物体，包括无脊椎动物和脊椎动物。无脊椎动物的实例包括植物和昆虫细胞(参见例如，美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429)。脊椎动物细胞的实例包括哺乳动物细胞系，经sv40转化的猴肾cv1系(cos-7)；人胚胎肾系(如例如在graham等人,j.genvirol.36:59(1977)中描述的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(bhk)；小鼠支持细胞(tm4细胞)；猴肾细胞(cv1)；非洲绿猴肾细胞(vero-76)；人宫颈癌细胞(hela)；犬肾细胞(mdck)；水牛大鼠肝细胞(brl3a)；人肺细胞(w138)；人肝细胞(hepg2)；小鼠乳房肿瘤(mmt060562)；tr1细胞；mrc5细胞；fs4细胞；中国仓鼠卵巢(cho)细胞，包括dhfrcho细胞；以及骨髓瘤细胞系如y0、ns0和sp2/0。(参见例如，yazaki和wu,methodsinmolecularbiology,vol.248,pp.255-268(2003))。
测定
可以通过各种已知的测定来鉴别、筛选或表征本文提供的抗hiv抗体的物理/化学性质和/或生物学活性。
在一个方面，例如，通过elisa、western印迹法等来测试本发明抗体的抗原结合活性。在一个方面，竞争性测定可用于鉴别与本文所述的抗hiv抗体竞争与hiv结合的抗体。在一些实施方案中，这样的竞争性抗体结合与本文所述的抗hiv抗体所结合的相同表位(例如，线性表位或构象表位)结合。示例性表位作图方法是已知的(参见例如，morris“epitopemappingprotocols,”inmethodsinmolecularbiologyvol.66(1996))。
在示例性竞争性测定中，在包含第一标记抗体和第二未标记抗体的溶液中温育固定的hiv，该第一标记抗体与hiv结合，该第二未标记抗体正在被测试其与第一抗体竞争与hiv结合的能力。第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，在包含第一标记抗体但不包含第二未标记抗体的溶液中温育固定的hiv。在允许第一抗体与hiv结合的条件下温育后，去除过量的未结合抗体，并测量与固定的hiv相关的标记的量。如果测试样品中与固定的hiv相关的标记的量相对于对照样品大幅降低，则表明第二抗体与第一抗体竞争与hiv的结合(参见例如，harlowandlaneantibodies:alaboratorymanualch.14(1996))。
一个方面，提供了用于鉴别具有生物学活性的其抗hiv抗体的测定。在一些实施方案中，提供了用于鉴别对hiv具有中和活性的其抗hiv抗体的测定。还提供了在体内和/或体外具有这样的生物学活性的抗体。在一些实施方案中，测试由本发明的抗体的这样的生物学活性。
免疫偶联物
本发明还提供了包含本文抗hiv抗体的免疫偶联物。免疫偶联物是与一种或多种异源分子偶联的抗体。例如，免疫偶联物可以包含与一种或多种细胞毒性剂如化疗剂或化疗药物、生长抑制剂、蛋白质结构域、毒素(例如，蛋白毒素、细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素，或其片段)或放射性同位素偶联的抗hiv抗体。在一些实施方案中，免疫偶联物可以包含抗hiv抗体或其片段(例如，scfv)。
在一些实施方案中，免疫偶联物为抗体-药物偶联物(adc)，其中抗体与一种或多种药物偶联，该药物包括但不限于美登木素生物碱；阿里他汀(auristatin)如单甲基阿里他汀药物部分de和df(mmae和mmaf)；多拉司他汀(dolastatin)；卡奇霉素(calicheamicin)或其衍生物；蒽环类如道诺霉素或多柔比星；甲氨蝶呤；长春地辛；紫杉烷如多西他赛、紫杉醇、拉罗他赛、替司他赛和奥他赛；单端孢菌毒素；以及cc1065(参见例如，美国专利号5,208,020、5,416,064、5,635,483、5,780,588、7,498,298、5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001、6,630,579和5,877,296；ep0425235b1；hinman等人,cancerres.53:3336-3342(1993)；lode等人,cancerres.58:2925-2928(1998)；kratz等人,currentmed.chem.13:477-523(2006)；jeffrey等人,bioorganic&med.chem.letters16:358-362(2006)；torgov等人,bioconj.chem.16:717-721(2005)；nagy等人,proc.natl.acad.sci.usa97:829-834(2000)；dubowchik等人,bioorg.&med.chem.letters12:1529-1532(2002)；以及king等人,j.med.chem.45:4336-4343(2002))。
在另一个实施方案中，免疫偶联物包含与酶促活性毒素或其片段偶联的如本文所述的抗体，所述酶促活性毒素或其片段包括但不限于白喉a链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素a链(来自铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒蛋白a链、相思豆毒蛋白a链、蒴莲根毒蛋白iia链、α-帚曲霉素、油桐(aleuritesfordii)蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陆(phytolacaamericana)蛋白(papi、papii和pap-s)、苦瓜(momordicacharantia)抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥阜草(sapaonariaofficinalis)抑制剂、多花白树毒蛋白、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单孢霉烯族毒素(tricothecene)。
在另一个实施方案中，免疫偶联物包含与放射性原子偶联以形成放射偶联物的如本文所述的抗体。可用于产生放射偶联物的示例性放射性同位素包含at211、i131、i125、y90、re186、re188、sm153、bi212、p32、pb212和lu的放射性同位素。放射性偶联物可以包含用于闪烁照相检测的放射性原子(例如，tc99m或1123，或用于核磁共振(nmr)成像的自旋标记物，如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁)。
可以使用双功能蛋白质偶联剂制备抗体和细胞毒性剂的偶联物，该双功能蛋白质偶联剂例如是n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(spdp)、琥珀酰亚胺基-4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(smcc)、亚氨基硫杂环戊烷(it)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如二亚胺代己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(例如，双琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛(例如，戊二醛)、双叠氮基化合物(例如，双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(例如，双(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如，1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以制备蓖麻毒蛋白免疫毒素(参见例如，vitetta等人,science238:1098(1987))。碳-14标记的1-异硫氰基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(mx-dtpa)是用于放射性核苷酸与抗体偶联的示例性螯合剂(参见例如，wo94/11026)。连接体可以是可切割的，从而促进细胞中细胞毒性药物的释放。示例性可切割的连接体包括酸不稳定连接体、肽酶敏感连接体、光不稳定连接体、二甲基连接体和含二硫化物的连接体(参见例如，chari等人,cancerres.52:127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。
本文的免疫偶联物或adc明确设想了用交联剂试剂制备的偶联物。示例性交联试剂包括bmps、emcs、gmbs、hbvs、lc-smcc、mbs、mpbh、sbap、sia、siab、smcc、smpb、smph、硫代emcs、硫代gmbs、硫代kmus、硫代mbs、硫代siab、硫代smcc以及硫代smpb和svsb(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。
用于诊断和检测的方法和组合物
在一些实施方案中，任何本文提供的抗hiv抗体均可用于检测生物样品中hiv的存在。检测包括定量或定性检测。
本文公开的抗体和组合物可用于多种目的，如用于在受试者中检测hiv感染或诊断aids。这些方法可包括使来自诊断患有hiv或aids的受试者的样品与本文所述的抗体接触，以及检测抗体与样品的结合。相对于抗体与对照样品的结合，抗体与样品结合的增加确认受试者患有hiv-1感染和/或aids。在一些实施方案中，该方法进一步包括使结合hiv的第二抗体与该样品接触，以及检测该第二抗体的结合。在一些非限制性实例中，相对于与对照样品的结合，抗体与样品结合的增加检测出受试者中的hiv。在一些非限制性实例中，该抗体特异性结合该样品中的可溶性gp120。在一些实施方案中，该方法进一步包括使特异性识别hiv抗体的第二抗体与样品接触，以及检测第二抗体的结合。
根据另一个实施方案，本发明提供了诊断方法。诊断方法通常涉及使从患者获得的生物样品(诸如例如，血液、血清、唾液、尿、痰、细胞拭子样品或组织活检物)与hiv抗体接触，以及确定与对照样品或预定截止值相比，抗体是否优先与样品结合，从而表明hiv病毒的存在。
根据另一个实施方案，本发明提供了在来自患者的生物样品中检测本发明hiv抗体的存在的方法。检测方法通常涉及从患者获得生物样品(诸如例如，血液、血清、唾液、尿、痰、细胞拭子样品或组织活检)，以及分离hiv抗体或其片段或编码hiv抗体的核酸，以及测定生物样品中hiv抗体的存在。而且，本发明提供了检测细胞中hiv抗体的核苷酸序列的方法。该hiv抗体的核苷酸序列也可以使用本文公开的引物来检测。可以利用已知的重组技术和/或使用质谱仪来确定该hiv抗体在来自患者的生物样品中的存在。
在一些实施方案中，提供了用于诊断或检测方法的抗hiv抗体。在其他方面，提供了检测生物样品中hiv存在的方法。在一些实施方案中，该方法包括使生物样品与如本文所述的抗hiv抗体在允许抗hiv抗体与hiv结合的条件下接触，以及检测在抗hiv抗体与hiv之间是否形成复合体。这样的方法可以是体外方法或体内方法。在一些实施方案中，使用抗hiv抗体来选择符合抗hiv抗体疗法资格的受试者，例如，其中hiv是用于选择患者的生物标志物。
可以使用本发明的抗体诊断的示例性病症包含以hiv感染为特征的病症，包括aids。
在一些实施方案中，提供了标记的抗hiv抗体。标记物包括但不限于直接检测的标记物或部分(例如，荧光标记物、发色团标记物、电子致密物标记物、化学发光标记物和放射性标记物)以及例如通过酶促反应或分子间相互作用间接检测的部分(例如，酶或配体)。示例性标记物包括放射性同位素(例如，32p、14c、125i、3h和131i)、荧光团(例如，稀土螯合物或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、伞形酮、萤光素酶(luceriferase)(参见例如，美国专利号4,737,456)、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮、辣根过氧化物酶(hrp)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶、与采用过氧化氢来氧化染料前体的酶偶联的杂环氧化酶、生物素/抗生物素蛋白、自旋标记物、噬菌体标记物、稳定的自由基等。
药物制剂
还提供了如本文所述的抗hiv抗体的药物制剂，其通过将具有所需纯度的这种抗体与一种或多种任选的药学上可接受的载体(例如参见，remington'spharmaceuticalsciences第16th版,osol,a.ed.(1980))混合而制备，呈冻干制剂或水溶液的形式。药学上可接受的载体通常在所用剂量和浓度下对接受者无毒。示例性药学上可接受的载体包括缓冲剂(例如，磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸)；抗氧化剂(例如，抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(例如，十八烷基二甲基苄基氯化铵)；六甲铵氯化物；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质(例如，血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；亲水聚合物(例如，聚乙烯吡咯烷酮)；氨基酸(例如，甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸)；单糖、二糖和其他碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖或糊精)；螯合剂(例如，edta)；糖(例如，蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇)；成盐抗衡离子(例如，钠离子)；金属络合物(例如，zn-蛋白质络合物)；以及/或者非离子表面活性剂(例如，聚乙二醇(peg))。本文的示例性药学上可接受的载体进一步包括间质性药物分散剂(例如，可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(shasegp))(参见例如，美国专利公开号us2005/0260186和us2006/0104968)。在一个方面，将shasegp与一种或多种额外的糖胺聚糖酶(例如，软骨素酶)组合。
还提供了包含抗hiv-抗体或其片段和/或融合蛋白和/或嵌合受体和/或表达所述分子的工程化细胞的药物制剂。该药物组合物和制剂通常包含一种或多种任选的药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，该组合物包含至少一种额外的治疗剂。
术语“药物制剂”是指这样的制剂，其形式允许其中所含活性成分的生物学活性是有效的，并且其不含对制剂将要施用至的受试者具有不可接受的毒性的额外组分。
“药学上可接受的载体”是指药物制剂中除了活性成分之外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
在一些方面，载体的选择部分地由具体的细胞、结合分子和/或抗体和/或由施用方法来确定。因此，存在多种合适的制剂。例如，该药物制剂可以含有防腐剂。合适的防腐剂可以包含例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面，使用两种或更多种防腐剂的混合物。该防腐剂或其混合物通常以按总组合物重量计约0.0001％至约2％的量存在。
在一些方面，所述组合物包含缓冲剂。合适的缓冲剂包含例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾以及各种其他的酸和盐。在一些方面，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。该缓冲剂或其混合物通常以按总组合物重量计约0.001％至约4％的量存在。制备可施用药物组合物的方法是已知的。示例性方法在例如remington:thescienceandpracticeofpharmacy,lippincottwilliams&wilkins；第21版(2005年5月1日)中更详细地描述。
抗体的制剂可以包括冻干制剂和水溶液。
所述制剂或组合物还可以含有多于一种可用于用所述抗体或其片段或细胞治疗的特定适应症、疾病或病况的活性成分，优选具有与所述抗体或其片段或细胞互补的活性的活性成分，其中各自的活性不会对彼此产生不利影响。在一些实施方案中，所述制剂还可以包含治疗、改善、控制、降低病毒负荷或降低特定适应症(例如，hiv感染或aids)的疾病严重程度所需的成分。这样的活性成分适合以对预期目有效的量的组合存在。因此，在一些实施方案中，药物组合物进一步包含其他药物活性剂或药物，如抗病毒剂。在一些实施方案中，将该细胞或抗体以盐(例如，药学上可接受的盐)的形式施用。合适的药学上可接受的酸加成盐包括来源于无机酸如盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸和硫酸，以及有机酸如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸、苯甲酸、乙醇酸、葡萄糖酸、琥珀酸和芳基磺酸，例如，对甲苯磺酸的酸加成盐。
可以将抗体制剂冻干(参见例如，美国专利号6,267,958)。抗体制剂可以是水性抗体(参见例如，美国专利号6,171,586和wo06/044908)。
可将活性成分包埋在微胶囊(例如，羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯))中。可将活性成分包埋在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)的微胶囊中或粗乳状液中。可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适的实例包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质为成形制品(例如，膜或微胶囊)的形式。
在一些方面，所述药物组合物可以采用随时间释放、延迟释放和持续释放的递送系统，使得组合物的递送发生在待治疗部位敏化之前并且发生足够的时间以引起待治疗部位的敏化。许多类型的释放递送系统是可用的并且已知的。这样的系统可以避免该组合物的重复施用，从而增加对受试者和医师的便利性。
在一些实施方案中，所述药物组合物含有有效治疗或预防疾病或病况的量(如治疗有效量或预防有效量)的抗体或其片段和/或细胞。在一些实施方案中，通过定期评估治疗的受试者来监测治疗或预防的功效。对于在几天或更长时间内的重复施用，根据病况重复该治疗直至出现期望的疾病症状抑制。然而，其他给药方案也可能是有用的并且可以被确定。可以通过单次推注施用组合物、通过该多次推注施用组合物或通过连续输注施用组合物来递送所需剂量。
在某些实施方案中，在含有抗体或其片段的基因工程化细胞的情况下，向受试者施用约100万个至约1000亿个细胞，诸如例如，100万个至约500亿个细胞(例如，约500万个细胞、约2500万个细胞、约5亿个细胞、约10亿个细胞、约50亿个细胞、约200亿个细胞、约300亿个细胞、约400亿个细胞或由任何两个前述值定义的范围)，如约1000万至约1000亿个细胞(例如，约2000万个细胞、约3000万个细胞、约4000万个细胞、约6000万个细胞、约7000万个细胞、约8000万个细胞、约9000万个细胞、约100亿个细胞、约250亿个细胞、约500亿个细胞、约750亿个细胞、约900亿个细胞或由上述任何两个值定义的范围)，以及在一些情况下约1亿个细胞至约500亿个细胞(例如，约1.2亿个细胞、约2.5亿个细胞、约3.5亿个细胞、约4.5亿个细胞、约6.5亿个细胞、约8亿个细胞、约9亿个细胞、约30亿个细胞、约300亿个细胞、约450亿个细胞)或者这些范围之间的任何值，和/或每千克受试者体重的该数目的细胞。
可以使用标准施用技术、制剂和/或装置施用该组合物。提供了用于储存和施用组合物的制剂和装置，如注射器和小瓶。该细胞的施用可以是自体的或异源的。例如，可以从一个受试者获得免疫应答细胞或祖细胞，并将其施用至相同的受试者或不同的相容受试者。可经由局部注射(包括导管施用、全身注射、局部注射、静脉内注射或胃肠外施用)来施用衍生自外周血的免疫应答细胞或其子代(例如，体内、离体或体外衍生的)。当施用治疗组合物(例如，含有经基因修饰的免疫应答细胞的药物组合物)时，该组合物通常以单位剂量的可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)配制。
制剂包括用于口服施用、静脉内施用、腹膜内施用、皮下施用、经肺施用、经皮施用、肌内施用、鼻内施用、颊部施用、舌下施用或栓剂施用的制剂。在一些实施方案中，胃肠外施用该细胞群体。如本文所用的，术语“胃肠外”包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道和腹膜内的施用。在一些实施方案中，通过静脉内、腹膜内或皮下注射采用外周全身递送将该细胞群施用至受试者。
在一些实施方案中，组合物被提供为无菌液体制剂，例如，等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散液或粘性组合物，其在一些方面可以被缓冲至选定的ph。液体制剂通常比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。另外，液体组合物稍稍更便于施用，特别是通过注射。另一方面，粘性组合物可以在合适的粘度范围内配制，以提供与特定组织更长的接触时间。液体或粘性组合物可以包含载体，该载体可以是溶剂或含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适混合物的分散介质。
可通过将抗体或其片段掺入溶剂中，如与合适的载体、稀释剂或赋形剂如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等混合来制备无菌注射溶液。还可以将该组合物冻干。根据期望的给药途径和制剂，该组合物可以含有辅助物质如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如，甲基纤维素)、ph缓冲剂、胶凝添加剂或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂、着色剂等。在一些方面，可以参考标准文本来制备合适的制剂。
可以添加各种增强组合物稳定性和无菌性的添加剂，包含抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸等来确保防止微生物的作用。可以通过使用延迟吸收的药剂例如单硬脂酸铝和明胶来实现可注射药物形式的延长吸收。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适的实例包括含有所述抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质呈成形制品(例如，膜或微胶囊)的形式。
用于体内施用的制剂通常是无菌的(例如，经由通过无菌滤膜过滤)。
治疗方法和组合物
任何本文提供的抗hiv抗体均可用于治疗方法。本发明提供了用于治疗感染病毒(例如，hiv)的哺乳动物的方法，其包括向所述哺乳动物施用包含本文公开的hiv抗体的药物组合物。进一步提供了用于使受试者hiv病毒滴度、病毒复制、病毒增殖或hiv病毒蛋白量的增加减缓的方法。
在一个方面，提供了用作药物的抗hiv抗体。在其他方面，提供了用于治疗hiv感染的抗hiv抗体。在一些实施方案中，该抗hiv抗体中和hiv。在一些实施方案中，该抗hiv抗体为广泛中和抗体。在其他实施方案中，该hiv为hiv-1。在一些实施方案中，该hiv为hiv-2。在其他实施方案中，该hiv为hiv-1m组。在一些实施方案中，该hiv为hiv-1n组、hiv-1o组和/或hiv-1p组。在其他实施方案中，该hiv为hiv-1进化枝a(包含a1和/或a2)、b、c、d、e、f(包含f1和/或f2)、g、h、i、j、k或其任何组合、亚型或重组衍生物(包含循环重组形式(crf))。在其他方面，提供了用于治疗aids的抗hiv抗体。在一些实施方案中，提供了用于治疗方法的抗hiv抗体。在一些实施方案中，本发明提供了用于治疗感染hiv或患有aids的个体的方法的抗hiv抗体，该方法包括向该个体施用有效量的抗hiv抗体。有效量的药剂是在给药时有效且持续必须的时间段以达到期望的治疗或预防结果的量。在一个这样的实施方案中，该方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种额外的治疗剂。该个体可以是人。
在其他方面，本发明提供了抗hiv抗体在药物制造或制备中的用途。在一些实施方案中，所述药物用于治疗hiv感染。在一些实施方案中，所述药物用于治疗aids。在进一步的实施方案中，该药物用于治疗hiv感染或aids的方法，该方法包括向患有hiv感染或aids的个体施用有效量的药物。
在其他方面，本发明提供了治疗hiv感染或aids的方法。在一些实施方案中，该方法包括向患有这种hiv感染或aids的个体施用有效量的抗hiv抗体。
在一些实施方案中，所述感染或aids的hiv在其组成病毒的表面上表达gp120。
根据另一个实施方案，本发明提供了用于制备和施用hiv抗体组合物的方法，该组合物适用于以足以在人体内诱导针对hiv的保护性免疫响应或hiv病毒的减少的方案和一定量向患有hiv感染或存在hiv感染风险的人或非人灵长类患者施用。
根据另一个实施方案，本发明提供了包含至少一种本发明的抗体和药学上可接受的载体的疫苗。根据一个实施方案，该疫苗为包含至少一种本文所述的抗体和药学上可接受的载体的疫苗。该疫苗可以以任意组合包含具有本文所述特征的多种抗体，并且可以进一步包含额外的抗体，如其他可用的中和hiv的抗体。
应当理解，组合物可以是单个本文公开的抗体或是本文公开抗体的组合，该抗体可以是相同的或不同的，以便在接种后预防性或治疗性地治疗各种亚型的hiv感染的进展。可以根据所需的免疫力来选择这样的组合。当抗体施用于动物或人时，可将其与一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或佐剂组合。
此外，关于确定患者中hiv治疗的有效水平，特别地，合适的动物模型是可用的，并且已被广泛实施用于评价各种基因治疗方案对抗hiv的体内功效(sarver等人,(1993b),同上)。这些模型包括小鼠、猴和猫。虽然这些动物并非天然易感hiv疾病，但用人外周血单核细胞(pbmc)、淋巴结、胎儿肝脏/胸腺或其他组织重建的嵌合小鼠模型(例如，scid、bg/nu/xid、nod/scid、scid-hu、免疫活性scid-hu、骨髓切除的balb/c)可以感染慢病毒载体或hiv，并且用作hiv发病机制的模型。类似地，可以采用猿免疫缺陷病毒(siv)/猴模型，也可以使用猫免疫缺陷病毒(fiv)/猫模型。当用于治疗性地治疗aids时，该药物组合物可以含有其他药物，联合根据本发明的载体。这些其他药物可以以其传统方式使用(即，作为治疗hiv感染的药剂)。根据另一个实施方案，本发明提供了基于抗体的药物组合物，其包含有效量的分离的hiv抗体或亲和力成熟形式，其提供了用于减少hiv病毒感染的预防性或治疗性治疗选择。本发明的基于抗体的药物组合物可以通过任何数目的通常已知的策略配制(参见例如，mcgoff和scher,2000,solutionformulationofproteins/peptides:inmcnally,e.j.,ed.proteinformulationanddelivery.newyork,ny:marceldekker；pp.139-158；akers和defilippis,2000,peptidesandproteinsasparenteralsolutions.in:pharmaceuticalformulationdevelopmentofpeptidesandproteins.philadelphia,pa:talyorandfrancis；pp.145-177；akers,等人,2002,pharm.biotechnol.14:47-127)。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于检测生物样品中包含含有高度保守的共有序列的重链和含有高度保守的共有序列的轻链的hiv抗体的方法，该方法包括从哺乳动物受试者获得含免疫球蛋白的生物样品、从所述样品分离hiv抗体，以及鉴别所述重链和轻链的高度保守的共有序列。该生物样品可以是血液、血清、唾液、尿、痰、细胞拭子样品或组织活检物。该氨基酸序列可以通过包括例如pcr和质谱法在内的已知方法确定。
在其他方面，本发明提供了包含任何本文提供的抗hiv抗体的药物制剂(例如，用在任何上述的治疗方法)。在一些实施方案中，药物制剂包含任何本文提供的抗hiv抗体和药学上可接受的载体。在另一个实施方案中，药物制剂包含任何本文提供的抗hiv抗体和至少一种额外的治疗剂。
如本文所述的抗体或其片段可以在疗法中单独使用或与其他药剂联合使用。例如，本发明的抗体可以与至少一种额外的治疗剂共同施用。例如，该抗体或其片段可以单独使用或与一种或超过一种抗体(例如，多种抗体或抗体池)联合使用。例如，抗体可单独使用或与一种或多种其他抗体(例如，hiv中和抗体)联合使用，该抗体例如但不限于vrco1、vrc02、vrc03、vrc-pg-04、vrc-pg-05、bl2、(cd4b)、(pgt、pg9和pg16)。(参见，science333(6049):1633-1637；nature477(7365):466-470；science334(6060):1289-1293；science326(5950):285-289；science334(6059):1097-1103；以及nature480(7377):336-343.)
根据另一个实施方案，本发明提供了用于治疗感染病毒(诸如例如，hiv)的哺乳动物的方法，其包括向所述哺乳动物施用包含本文公开的hiv抗体的药物组合物。根据一个实施方案，用于治疗感染hiv的哺乳动物的方法包括向所述哺乳动物施用包含本发明抗体或其片段的药物组合物。
上述的这样的联合治疗包括联合施用(其中两种或更多种治疗剂包含在相同或单独的制剂中)和单独施用，在这种情况下，本发明抗体的施用可以在施用额外治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后发生。
还提供了用于过继性细胞疗法的方法和用途。在一些实施方案中，所述方法包括将所述细胞或含有所述细胞的组合物施用于受试者、组织或细胞，诸如存在疾病、病况或病症的风险或疑似患有所述疾病、病况或病症的受试者、组织或细胞。在一些实施方案中，例如通过过继性细胞疗法，诸如过继性t细胞疗法，将细胞、群体和组合物施用于患有待治疗的特定疾病或病况的受试者。在一些实施方案中，将细胞或组合物施用于受试者，诸如患有该疾病或病况或存在该疾病或病况的风险的受试者。在一些方面，所述方法由此治疗，例如减轻疾病或病况的一种或多种症状。
用于施用细胞以供过继性细胞疗法的方法是已知的并且可以与所提供的方法和组合物结合使用。例如，过继性t细胞治疗方法在例如gruenberg等人的美国专利申请公开号2003/0170238；rosenberg的美国专利号4,690,915；rosenberg(2011)natrevclinoncol.8(10):577-85)中有述。参见例如，themeli等人,(2013)natbiotechnol.31(10):928-933；tsukahara等人,(2013)biochembiophysrescommun438(1):84-9；davila等人,(2013)plosone8(4):e61338。
在一些实施方案中，细胞疗法(例如，过继性细胞疗法，例如过继性t细胞疗法)通过自体转移来实施，其中从接受该细胞疗法的受试者或来源于该受试者的样品分离和/或以其他方式制备细胞。因此，在一些方面，细胞来源于需要治疗的受试者(例如，患者)，并且将分离和处理后的细胞施用于同一受试者。
在一些实施方案中，细胞疗法(例如，过继性细胞疗法，例如过继性t细胞疗法)通过同种异体转移来实施，其中从除了将要接受或最终接受该细胞疗法的受试者(例如，第一受试者)之外的受试者分离和/或以其他方式制备细胞。在这样的实施方案中，然后将细胞施用于相同物种的不同受试者，例如第二受试者。在一些实施方案中，第一受试者和第二受试者在遗传学上是相同的。在一些实施方案中，第一受试者和第二受试者在遗传学上是相似的。在一些实施方案中，第二受试者表达与第一受试者相同的hla类别或超类型。
在一些实施方案中，所述细胞、细胞群体或组合物所施用至的受试者为灵长类动物，如人类。在一些实施方案中，该灵长类动物为猴或类人猿。受试者可以是雄性的或雌性的，并且可以为任何适合的年龄，包括婴儿、少年、青少年、成人和老年受试者。在一些实施方案中，受试者是非灵长类哺乳动物，如啮齿动物。在一些实例中，患者或受试者是用于疾病、过继性细胞疗法和/或用于评估毒性结果如细胞因子释放综合征(crs)的经过验证的动物模型。
本发明的抗体(和任何额外的治疗剂)可以通过任何合适的手段施用，该手段包括肠胃外施用、肺内施用和鼻内施用，以及局部治疗需要时的病灶内施用。肠胃外输注包括肌内施用、静脉内施用、动脉内施用、腹膜内施用或皮下施用。可以通过任何合适的途径来给药。例如，可以通过注射(例如，静脉内或皮下注射)来剂量。本文设想了各种给药方案，包括但不限于在各个时间点的单次或多次施用、推注施用和脉冲输注。
本发明的抗体将以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在这种情况下考虑的因素包括被治疗的具体病症、被治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、病症的原因、药剂递送部位、施用方法、施用安排以及医师已知的其他因素。该抗体不必但任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所讨论的病症的药剂一起配制。有效量的这些其他药剂取决于制剂中存在的抗体的量、病症或治疗的类型和上文所述的其他因素。这些抗体通常以相同剂量使用并采用如本文所述的施用途径，或者以本文所述的剂量的约1％至99％使用，或者以任何剂量使用并且通过经验/临床地确定为合适的任何途径使用。
为了预防或治疗疾病，本发明抗体(当单独使用或与一种或多种其他额外的治疗剂联合使用时)的适当剂量将取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重程度和进程、抗体是否已用于预防或治疗目的、先前疗法、患者的临床病史和对抗体的响应，以及主治医生的判断。抗体一次或通过一系列治疗适当地施用至患者。对于向患者施用，约1μg/kg至15mg/kg(例如，0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体可以是初始候选剂量(例如，通过一次或多次单独施用或通过连续输注)。每日剂量可以在约1μg/kg至100mg/kg或的范围内，或更大。对于经几天或更长的重复施用，治疗通常将持续直至出现期望的感染或疾病症状抑制。抗体的一个示例性剂量将在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)的一个或多个剂量。这样的剂量可以间歇施用(例如，每周或每三周)。可以施用初始较高的负荷剂量，随后施用一次或多次较低剂量。
应当理解，可以使用本发明的免疫偶联物代替抗hiv抗体或除抗hiv抗体之外还使用本发明的免疫偶联物来进行上述任何配制或治疗方法。
进一步提供了用于使受试者hiv病毒滴度、病毒复制、病毒增殖或hiv病毒蛋白量的增加减缓的方法。根据另一方面，方法包括向受试者施用一定量的hiv抗体，该一定量的hiv抗体使该受试者的hiv滴度、病毒复制或一种或多种hiv毒株或分离株的hiv蛋白量的增加有效减缓。
根据另一个实施方案，本发明提供了减缓病毒复制或hiv感染向其他宿主细胞或组织的扩散的方法，其包括使哺乳动物细胞与结合gp120上的抗原表位的抗体或其部分接触。
被动免疫可用于有效且安全地预防和治疗病毒性疾病。(参见例如，keller等人,clin.microbiol.rev.13:602-14(2000)；casadevall,nat.biotechnol.20:114(2002)；shibata等人,nat.med.5:204-10(1999)；以及igarashi等人,nat.med.5:211-16(1999))。使用人单克隆抗体的被动免疫为hiv的紧急预防和治疗提供了立即治疗策略。
存在hiv相关疾病或病症风险的受试者包括已与感染者接触或以一些其他方式暴露于hiv的患者。预防剂的施用可以在表现出hiv相关疾病或病症的症状特征之前发生，使得疾病或病症得以预防，或者备选地延迟其进展。
制品
在本发明的一个方面，提供了含有用于治疗、预防和/或诊断上述病症的材料的制品。该制品包含容器以及在容器上或与容器相关联的标记或包装插页。合适的容器包括例如，瓶子、小瓶、注射器、iv输液袋等。容器可由多种材料如玻璃或塑料形成。该容器容纳组合物，该组合物本身或与另一组合物组合对于治疗、预防和/或诊断病况是有效的，并且可具有无菌入口(例如，该容器可以是静脉输液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标记或包装插页指示组合物用于治疗所选择的病况。此外，该制品可包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中该组合物包含本发明的抗体；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中该组合物包含另外的细胞毒性剂或其他治疗剂。本发明的在这种实施方案中的制品可进一步包含包装插页，其指示组合物可用于治疗特定病况。备选地或额外地，该制品可进一步包含第二(或第三)容器，该容器包含药学上可接受的缓冲剂，如注射用抑菌水(bwfi)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。该制品可进一步包含从商业和用户角度来看所需的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针和注射器。
本发明还包括编码表1和2中列出的hiv抗体重链和轻链的多肽的分离核酸序列，以及seqidno:1-16和65的重链和轻链的序列。
表1-重链氨基酸序列
表2-轻链氨基酸序列
表3-重链和轻链配对
表4-排除的重链氨基酸序列
表5-排除的轻链氨基酸序列
序列表
seqidno:1-16——重链和轻链可变区序列：
seqidno:1-
qmqlqesgpglvkpsetlsltcvvsggsvsgniwswirqspgkgpewvgfvsgeyieynpslksrltisrdtsknqlsltlrsvtaadtamyycaktlrarriygviafgevydyhyfdvwgkgtmvtvss
seqidno:2-
tdsvasdvamsvapgdtatiscgeksngaravqwyqqkpgqapvliiynnqdrpsgiperfsaspdagfgttatltisrveagdeadyychiwdsrfplswvfaggtkltvl
seqidno:3-
qvqlqesgpglvkpsetlsvtcsvsgdsmnnyywtwirqspgkglewigyvsdrasatynpslksrvvisrdtsknqlslklnsvtladtavyycatarrgqriygevafgeffyyysmdvwgkgtavtvss
seqidno:4-
gsvtsfvrplsvalgetasiscgrqalgsravqwyqhrpgqapvlliynnqdrpsgiperfsgtpdinfgtratltisgveagdeadyychmwdsrsgfswsfggatrltvl
seqidno:5-
qlqlqesgpglvkppetlsltcsvsgasindaywswirqspgkrpewvgyvhhsgdtnynpslkrrvtfsldtaknevslklvaltaadsavyfcaralhgkriygtvalgelfvyfhmdvwgkgtavtvss
seqidno:6-
hctgavssfvsvapgqtaritcgeeslgsrsviwyqqrpgqapsliiynnndrpsgiperfsgspgstfgttatltitsveagdeadyychiwdsrrptnwvfgegttltvl
seqidno:7-
qlqlqesgpglvkppetlsltcsvsgasindaywswirqspgkrpewvgyvhhsgdtnynpslkrrvtfsldtaknevslklvaltaadsavyfcaralhgkriygtvalgelfvyfymdvwgkgtavtvss
seqidno:8-
hctgavssfvsvapgqtaritcgeeslgsrsviwyqqrpgqapsliiynnndrpsgiperfsgspgstfgttatltitsveagdeadyychiwdsrrptnwvfgegttltvl
seqidno:9-
qvhlqesgpglvkpsetlsltcnvsgtlvrdnywswirqplgkqpewigyvhdsgdtnynpslksrvhlsldksknlvslrltgvtaadsaiyycattkhgrriygvvafkewftyfymdvwgkgtsvtvss
seqidno:10-
hctaslassmsvspgetakiscgkesigsravqwyqqkpgqppsliiynnqdrpagvperfsaspdfrpgttatltitnvdaedeadyychiydarggtnwvfdrgttltvl
seqidno:11-
qvhlqesgpglvkpsetlsltcnvsgtlvrdnywswirqplgkqpewigyvhdsgdtnynpslksrvhlsldksknlvslrltgvtaadsaiyycattkhgrriygvvafkewftyfymdvwgkgtsvtvss
seqidno:12-
hctgslassmsvspgetakiscgkesigsravqwyqqkpgqppsliiynnqdrpagvperfsaspdfrpgttatltitnvdaedeadyychiydarggtnwvfdrgttltvl
seqidno:13-
qmqlqesgpglvkpsetlsltcsvsgasisdsywswfrrspgkglewigyvhksgdtnyspslksrvnlsldasknqvslslvaataadsgkyycartlhgrriygivafnewftyfymdvwgngtqvtvss
seqidno:14-
hctasvtsdisvapgetariscgekslgsravqwyqhragqapsliiynnqdrpsgiperfsgspdsafgttatltitsveagdeadyychiwdsrvptkwvfgggttltvl
seqidno:15-
qvhlqesgpglvkpsetlsltcvvsgastsgqywswirqspgkglewigyrsdsgdanynpslksrviisldtsrnqlslnvtsvttadtamyfcaraqrgkriygvvslgeyyhyyimdvwgtgtpvtvss
seqidno:16-
qvqlqesgpglvkpsetlsvtcsvsgdsmnnyywtwirqspgkglewigyisdrasatynpslnsrvvisrdtsknqlslklnsvtpadtavyycatarrgqriygevsfgeffyyysmdvwgkgtavtvss
seqidno:17-64——重链和轻链cdr1、cdr2和cdr3序列：
seqidno:17-gniws
seqidno:18-fvsgeyieynpslks
seqidno:19-tlrarriygviafgevydyhyfdv
seqidno:20-geksngaravq
seqidno:21-nnqdrps
seqidno:22-hiwdsrfplswv
seqidno:23-nyywt
seqidno:24-yvsdrasatynpslks
seqidno:25-arrgqriygevafgeffyyysmdv
seqidno:26-grqalgsravq
seqidno:27-nnqdrps
seqidno:28-hmwdsrsgfsws
seqidno:29-grqalgsravq
seqidno:30-nnqdrps
seqidno:31-hmwdsrsgfsws
seqidno:32-geeslgsrsvi
seqidno:33-nnndrps
seqidno:34-hiwdsrrptnwv
seqidno:35-dayws
seqidno:36-yvhhsgdtnynpslkr
seqidno:37-alhgkriygtvalgelfvyfymdv
seqidno:38-geeslgsrsvi
seqidno:39-nnndrps
seqidno:40-hiwdsrrptnwv
seqidno:41-dnyws
seqidno:42-yvhdsgdtnynpslksv
seqidno:43-tkhgrriygvvafkewftyfymdv
seqidno:44-gkesigsravq
seqidno:45-nnqdrpa
seqidno:46-hiydarggtnwv
seqidno:47-dnyw
seqidno:48-yvhdsgdtnynpslks
seqidno:49-tkhgrriygvvafkewftyfymdv
seqidno:50-gkesigsra
seqidno:51-nnqdrpa
seqidno:52-hiydarggtnwv
seqidno:53-dsyws
seqidno:54-yvhksgdtnyspslks
seqidno:55-tlhgrriygivafnewftyfymdv
seqidno:56-gekslgsravq
seqidno:57-nnqdrps
seqidno:58-hiwdsrvptkwv
seqidno:59-gqyws
seqidno:60-yrsdsgdanynpslks
seqidno:61-aqrgkriygvvslgeyyhyyimdv
seqidno:62-nyywt
seqidno:63-yisdrasatynpslns
seqidno:64-arrgqriygevsfgeffyyysmdv
seqidno:65——轻链可变区序列：
seqidno:65-
xxxxsyvrplsvalgetasiscgrqalgsravqwyqhrpgqapilliynnqdrpsgiperfsgtpdinfgtratltisgveagdeadyychmwdsrsgfswsfggatrltvl
seqidno:66-68——轻链cdr1、cdr2和cdr3序列：
seqidno:66-grqalgsravq
seqidno:67-nnqdrps
seqidno:68-hmwdsrsgfsws
seqidno:69和70——种系可变区序列：
seqidno:69-
qvqlqesgpglvkpsetlsltctvsggsissyywswirqppgkglewigyiyysgstnynpslksrvtisvdtsknqfslklssvtaadtavyycartqqgkriygvvsfgdyyyyyymdvwgkgttvtvss
seqidno:70-
syvltqppsvsvapgqtaritcggnnigsksvhwyqqkpgqapvlvvyddsdrpsgiperfsgsnsgntatltisrveagdeadyycqvwdsssdhpwvfgggtkltvl
实施例
实施例1–abv-1–9抗体的表征
为了更好地理解中和抗体对hiv-1的响应和由abv1-9抗体靶向的表位，从感染进化枝a的患者分离了支配gp160特异性igg记忆响应的大克隆家族中的成员。针对abv-1–9抗体确定序列、结合亲和力、中和活性以及碳水化合物识别和v3环。进行测定以分离编码abv-1–9的b细胞克隆。将abv-1–9克隆分成由序列、结合亲和力、碳水化合物识别和中和活性区分的两个不同的组。第一组尽管无法可检测地与无蛋白聚糖结合，但仍表现出显著的效力和广度。
实施例2–kd值的确定
如由以下测定所述，通过用感兴趣抗体的fab形式及其抗原进行的放射性标记抗原结合测定(ria)来测量kd。通过在滴定系列的未标记抗原的存在下使fab与最小浓度的(125i)标记抗原平衡，然后用包被有抗fab抗体的板捕获结合的抗原来测量fab对抗原的溶液结合亲和力(参见例如，chen等人,j.mol.biol.293:865-881(1999))。为建立测定条件，将
实施例3–kd值的确定
采用表面等离子体共振测定，使用
实施例4–hiv供体测序
将来自患者的生物样品的七个等分试样(各自含有约90,000个细胞)分离成级分，并分析配对保真度。使用pct/us2014/028925中公开的abpair技术方法，该分析得到约100,000个可能的重链对和约37,000个高置信度天然重链-轻链对。用wo2012048341和wo2012048340中公开的abseq技术方法对等分试样进行测序。
实施例5–新型bnab生物信息学发现(内部供体相似性)
确定了abv1-9的cdr3氨基酸与来自患者17(pt17)的已知bnab的相似性。使用健康患者的序列来校准假阳性的阈值并且得到相似性截止值或阈值。使用完整的氨基酸序列来分析abv1-9抗体与已知bnab的系统发生关系。将选定抗体的其他特征与其他已知bnab序列特征的那些特征(包括种系家族、突变水平等)进行比较。结果：发现了7个高置信度的重链和轻链对和2个重链与推断轻链的配对(abv1-9)。
实施例6–实施例2-5中使用的材料和方法。
在gpl40特异性单b细胞捕获后克隆并产生hiv抗体。通过置换各个重链位置上的残基来生成糖工程化抗体。通过elisa、spr和聚糖微阵列测定来测定抗gp140抗体对hivenv蛋白的结合特性。使用(i)tzm.b1细胞中基于萤光素酶的测定和(ii)采用原代hiv-1变体感染的基于pbmc的测定来评价中和。通过分子置换高分辨率地解析glfab片段和结合或未结合至配体的abv1-9的结构。
单b细胞rt-pcr和ig基因分析
对来自患者的gpl40+cd19+igg+b细胞进行单细胞分选。进行了pbmc制备、cdna合成和ig基因的巢式pcr扩增。扩增由abv1-9克隆变体表达的igk基因pcr。对所有pcr产物进行测序并分析其ig基因使用、cdr3分析和vh/vk体细胞超变的数目。使用具有clustalw分析功能的macvector程序进行多序列比对，并将其用于通过邻接法生成系统树。或者，使用upgma法生成系统树。
使用igblast和imgtdvv-quest鉴别abv1-9抗体的种系(gl)前体基因区段。为了构建代表性gl祖先序列，使用igblast将含有最少体细胞超变的抗体的igh和igl序列与gl序列比对。通过将成熟vh和jh基因区段用其gl对应物来取代并将10-996序列用于涉及n-区核苷酸和dh基因区段的cdrh3区域来构建该gligh序列。该gligl序列由vl3-21*02和jl3*02基因区段序列组装。
抗体的克隆和产生
将纯化的经消化pcr产物克隆到人igγ1表达载体或igλ表达载体中。然后对含有igh和igλ基因的载体进行测序并将其与原始pcr产物序列进行比较。使用定点诱变(quikchangesite-directedmutagenesiskit；stratagene)产生变体抗体。为了生成his标记的fab，将vh基因亚克隆到6xhis-igcyl表达载体g中以编码后接6x-his标签的igglch1域。编码突变抗体的ighdna片段作为合成的小基因(idt)获得，并将其亚克隆到igγ1表达载体中。
通过使用聚乙烯亚胺(pei)沉淀法将igh和igl表达质粒瞬时转染到呈指数生长的hek293t细胞(atcc，crl-11268)中来产生抗体和fab片段。根据制造商的说明书，使用蛋白g琼脂糖珠(gehealthcare)对igg抗体进行亲和纯化。如下所述使用hispurtmcobalt树脂(thermoscientific)对fab片段进行亲和纯化。
hiv-1env蛋白
根据制造商的说明书，使用quikchange定点诱变试剂盒(stratagene)将丙氨酸突变引入pyu-2gp120载体中。通过将单个丙氨酸突变引入pyu-2gp120突变体载体中，使用相同程序来产生双聚糖突变体。通过dna测序来验证定点突变。
使用编码yu-2gp140、yu-2gp120、hxb2cgp120core、hxb2c2cccore蛋白和yu-2gp120突变蛋白的表达载体转染hek293t细胞。为了产生仅高甘露糖的yu-2gp120蛋白，在转染时添加25μm几夫碱(kifunensine)(enzolifesciences)。收获培养上清液并使用基于离心的过滤装置进行浓缩，该过滤装置允许将样品缓冲液更换为ph7.4的10mm咪唑、50mm磷酸钠、300mm氯化钠。根据制造商的说明书，通过使用hispurtmcobalt树脂(thermoscientific)的亲和层析来纯化蛋白质。
对于去糖基化反应，在37℃下用在没有变性剂的其各自反应缓冲液中的200upng酶f(newenglandbiolabs)或10,000uendohf(newenglandbiolabs)将50μg在pbs中的hek293t细胞产生的yu-2gp120消化过夜。在使用离心过滤器(
elisa
用100ng/孔在pbs中的纯化gp120将高结合96孔elisa板(costar)包被过夜。洗涤后，用2％bsa、1μmedta、0.05％tween-pbs(封闭缓冲剂)将该板封闭2h，然后与浓度为26.7nm的igg和在pbs中的7次连续1：4稀释液一起温育2h。洗涤后，通过与山羊hrp偶联的抗人igg抗体(jacksonimmunoreseach)(在封闭缓冲剂中为0.8μg/ml)温育1h以及添加hrp显色底物(abts溶液,invitrogen)而使板显色。使用先前描述的肽-elisa方法测试与选定gp120重叠肽结合的抗体。
对于竞争性elisa，用封闭缓冲剂将包被有gp120的板封闭2h，然后与pbs中抗体竞争物的1：2系列稀释溶液中的生物素化抗体(igg的浓度在5.2-667nm的范围内)一起温育2h。如上所述使用hrp偶联的链霉亲和素(jacksonimmunoreseach)(在封闭缓冲液中为0.8μg/ml)使平板显色。所有实验至少一式两份地进行。
聚糖微阵列分析
通过将与脂质连接的聚糖探针(拟糖脂质)在两个水平(2和5fmol/点)下一次两份地机器地打印到涂覆有硝酸纤维素的载玻片上而生成微阵列。用含有衍生自高甘露糖和复合型的n-聚糖的15种拟糖脂质的微阵列进行结合分析。简言之，在50μg/ml下对抗体进行测试，并且用生物素化抗人igg(vector)以及随后的alexafluor647标记的链霉亲和素(molecularprobes)来检测结合。
表面等离子体共振
使用biacoret100(biacore,inc.)进行实验。简言之，以300ru的偶联密度将yu-2gp140和gp120蛋白伯胺偶联到cm5芯片(biacore,inc.)上。将抗gp120igg和种系前体(gl)分别以1μm和10μm以35μl/min的流速注射到流动池上，其中有3分钟缔合阶段和5分钟解离阶段。通过在50μl/分钟流速下ph2.5的10mm甘氨酸-hcl的30秒注射将传感器再生。在使用没有体积反射指数(ri)校正的1:1结合模型减去背景之后，从动力学分析计算解离常数(kd(s-1))、缔合常数(k&(m-1s-1))和结合常数(kd、(m)或ka(m-1))(biacoret100评价软件)。
中和测定
在tzm.bl中使用基于萤光素酶的测定来评价病毒中和。待测试的hiv-1假病毒主要含有二级和三级病毒。在用25μm几夫碱(enzolifesciences)处理的野生型细胞或hek293sgnti-/-细胞中产生了仅高甘露糖的假病毒。使用非线性回归分析来计算观察到半数最大抑制的浓度(ic50值)。还采用先前表征的基于pbmc的测定，使用原代hiv-1变体(n＝95)感染来评价中和活性，该原代hiv-1变体分离自具有在1985年至1989年间(历史上，n＝14)或在2003年至2006年间(当代，n＝21)的已知血清转化日期的进化枝b感染供体。
使用graphpadprism软件以最佳拟合曲线下的面积来计算每种抗体的中和活性，该最佳拟合曲线将所中和的病毒的比例相对于在0.001至50μg/ml范围内的ic50值拟合。通过将所有auc值相对于最高值归一化而得到曲线下的相对面积(rauc)值。
统计分析
用graphpadprism软件进行统计分析。使用spearman相关性检验来分析在tzm-bl测定中针对选定组的病毒毒株的中和效力以及抗体对gp120和gp140的表观结合亲和力。使用mannwhitney检验来比较：(i)抗体对gp120/gpl40的亲和力，以及(ii)针对从历史和当代血清转化体分离的病毒的中和活性。
结晶和结构测定
表达了用于结晶的6x-his标记的abv1-9fab。通过顺序的ni-nta亲和层析(qiagen)和superdex20010/300(gehealthcare)大小排阻色谱法从瞬时转染的hek293-6e细胞的上清液中纯化fab。对于非配体结合的pgt121fab的晶体，通过蛋白a亲和层析(pierce)从瞬时转染的hek293-6e细胞的上清液中分离出pgt121igg，并且通过igg的木瓜蛋白酶切割以及使用superdex20010/300(gehealthcare)大小排阻色谱法的进一步纯化来获得fab片段。
在pbs缓冲液中将纯化的fab浓缩至8-20mg/ml。从与3倍摩尔过量的na2聚糖混合并在20℃下温育2小时的蛋白质样品(最终浓度：15mg/ml)制备“配体结合的”abv1-9fab晶体。在使用1:1的蛋白质与储库比率的400nl小液滴中使用
在pilatus6m像素检测器(dectris)上的束线12-2处收集衍射数据。使用xds对数据进行索引、整合和缩放。使用从非配体结合的abv1-9fab晶体获得的数据，将phenix用于使用两种搜索模型(pgt128fab(pdb代码3pv3)的ch-cl结构域和2f5(pdb代码3idj)的vh-vl结构域)在省略cdrh3和cdrl3环中的残基后寻找每个不对称单元一个fab的分子替换解决方案。随后，使用非配体结合的abv1-9结构作为搜索模型以寻找配体结合的abv1-9fab(每个不对称单元一个fab)和gl(每个不对称单元四个fab)的分子替换解决方案。
使用phenix进行迭代细化(包括gl的非晶体学对称约束)，并使用coot将模型手动拟合到电子密度图中。将pymol用于分子可视化并生成fab结构图。用使用1.4a探针的areaimol(ccp4suite)进行埋藏表面积计算。使用pymol中的超级脚本来比对fab结构。使用pdbefold进行成对ca比对。
实施例7–新独特变体的鉴别
使用yu-2gp140三聚体作为诱饵，从感染进化枝a的非洲供体分离abv1-9克隆型gp140特异性igg记忆b细胞的超优势度和多样性。鉴别了与独特克隆家族相对应的匹配的免疫球蛋白重链(igh)和轻链(igl)链基因。与igh基因中高水平的超变一致，扩增的ig基因高度突变并携带核苷酸改变。
表达了新的独特变体并且可以通过elisa和表面等离子体共振(spr)证明其与yu-2gp120和gpl40的结合。除非另有说明，否则用于这些和其他实验的gp120和gp140蛋白在可将复合型或高甘露糖的n-聚糖附接到pngs的哺乳动物细胞中表达。
实施例8–v3环在抗原识别中的作用
检查了v3在抗原被abv1-9抗体识别中的作用。使用缺乏vi-v3环(gp120core)或保留v3的一部分(2cc-核心)的hxb2gp120核心蛋白，并使用在v3茎中携带双丙氨酸置换的yu-2gp120突变蛋白(gp120gd3245aa)来进行elisa。与完整的yu-2gp120相比，抗体可对缺乏v3环的变体和gp120gd3245aa显示出降低的反应性，因此可能表明abv1-9的识别涉及在该v3环附近的蛋白质决定簇。没有一种抗体可以与跨越v3的重叠肽结合，因此可能表明靶向的表位是不连续的并且/或者需要未通过分离的肽实现的特定构象。
为了比较abv1-9抗体的总体聚糖识别，检查了其与经png酶f处理的yu-2gp120的结合，该png酶f切割复合型和高甘露糖的n-聚糖。由于gp120不能完全酶促地去糖基化(除非其变性)，因此png酶f处理导致天然折叠的gp120的部分去糖基化。然而，每组抗体的反应性可能因png酶f对gp120的部分去糖基化而不同，从而可能降低abv1-9抗体的结合活性。使用经endoh处理的yu-2gp120进行类似的实验，该endoh切割高甘露糖n-聚糖而不切割复合型n-聚糖，并且可能相对于abv1-9抗体更多地影响其他抗体的结合。
n-聚糖微阵列可能揭示，多种abv1-9抗体显示出可检测到的与各种复合型单触角或双触角n-聚糖的结合。通过竞争性elisa，用每组的两个代表性成员进行表位作图实验。抗体可能会显示出交叉竞争。为了进一步将靶向的表位作图，使用了抗gp120抗体，该抗体识别v3环冠部、cd4b、共受体结合位点、一组高甘露糖n-聚糖(2g12)或v3环和在位置301和332处的n-连接聚糖。抗v3冠部抗体可以抑制这些抗体中一些抗体的结合，但不抑制其他抗体。
实施例9–广泛和有力的hiv中和
为了评价abv1-9变体的中和活性，使用包括r1166.cl在内的病毒毒株来测试abv1-9变体抑制tzm-b1细胞hiv感染的能力，该r1166.cl在gp120位置332处缺乏pngs。abv1-9变体中和假病毒并且不中和对照。中和活性与hiv刺突的亲和力有关。pgt121/10-1074抗体克隆型的代表性种系形式(gl)不能结合gl20/gl40或不能中和组中的任何病毒，这意味着结合和中和需要体细胞突变。将gl轻链与突变重链配对不能挽救结合或中和，从而表明两个突变链都有助于抗体互补位的正确组装。
进行下一步测定以比较abv1-9针对难中和假病毒的扩展组的中和活性。如同预期，在gp120位置332和/或334(跨越asn332-x-ser334/thr334pngs)处带有氨基酸变化的大多数病毒耐受中和。此pngs处的突变占耐受中和的病毒中的大多数。观察到abv1-9的igg和fab形式的可比的中和活性，从而表明二价对其活性并不关键。
为了评价hiv包膜上的复合型n-聚糖在abv1-9中和时的潜在作用，以两种不同方式产生了仅高甘露糖的病毒体：通过在经几夫碱处理的细胞中组装假病毒(其导致man9glcnac2n-连接的聚糖)，或通过在hek293sgnti-/-细胞中组装(其导致man5glcnac2n-连接的聚糖)。abv1-9中和3株几夫碱衍生的毒株中的2株，该中和与其在野生型细胞中产生的对应物相当。在gnti-/-细胞中产生的两种病毒毒株与其在野生型细胞中产生的对应物相当地对abv1-9敏感。与复合型n-聚糖部分地保护cd4结合位点免受抗体结合的先前报道一致，在gnti-/-细胞中产生的病毒对cd4结合位点抗体更敏感。
实施例10–新传播的hiv-1
通过使用从在1985年至1989年间(历史上，n＝14)或在2003年至2006年间(当代，n＝25)血清转化的个体组中分离的进化枝b病毒，在基于外周血单核细胞(pbmc)的测定中评价中和来测试abv1-9对传播的原始(founder)病毒的活性。将abv1-9与抗cd4bbnab和包括vrco1、pg9/pg16、bl2、2g12、4e10和2f5在内的其他bnab进行比较。中和活性的聚类分析显示分为两组；一组含有最活跃的hiv中和剂，包括抗cd4b和pg9抗体。abv1-9对此进化枝b病毒组显示出优异的中和效力。
实施例11–abv1-9和gl的晶体结构
为了研究abv1-9抗体之间差异的结构决定簇，确定了abv1-9的fab片段和代表性种系前体(gl)的晶体结构。在三个fab之间重链和轻链可变域(vr和vl)的叠加显示出骨架结构的保守性，差异限于亲和力成熟的fab的cdrh3和cdrl3环相对于gl的小位移。
与识别asn332gp120-连接聚糖和asn301gp120-连接聚糖和v3的抗体的结构进行了比较，并且该抗体的结构被解析为在不能产生复合型n-聚糖修饰蛋白的细胞中表达的具有外部结构域/小v3环gp120的复合体。
实施例12–abv1-9–聚糖复合体的晶体结构
使用在包括na2的条件下获得的晶体来解析与复合型唾液酸化双触角聚糖缔合的abv1-9的结构。
实施例13–接触聚糖的抗体残基的置换影响中和
为了评价由配体结合的abv1-9结构鉴别的接触复合型n-聚糖的残基的贡献，生成了设计用于交换接触复合型聚糖的残基的突变抗体。如通过spr测量的，糖工程化抗体表现出对yu-2gp120/gpl40的近野生型表观亲和力，从而表明置换不破坏与衍生自被两种abv1-9中和的病毒毒株的包膜刺突的结合。与野生型abv1-9不同，abv1-9gm在微阵列实验中未显示出聚糖结合。接着，使用基于tzm-bl的测定来比较野生型抗体和糖工程化抗体的中和。测试病毒毒株。
实施例14–抗hiv-1中和mab的体内被动转移
将abv1-9抗hiv中和单克隆抗体施用至恒河猴(rhesusmacaques)，并在24小时后用两种不同shiv中的任一种在直肠内攻击它们。通过将从60只受攻击的动物获得的结果相结合，在50％暴露的猴子中，血浆中防止病毒获取的保护性中和滴度约为1:100。
动物实验
本研究中使用的猕猴对于mhci类mamu-a*01等位基因是阴性的。用对应于shivad8eo的5'和3'半部的引物进行的r5-趋向性(tropic)shivdh12-v3ad8pcr诱变的构建被用于使用platinumpfxdna聚合酶(invitrogen)将这些v3序列引入pshivdh12_cl7分子克隆的遗传背景中。凝胶纯化后，用t4多核苷酸激酶(gibcobrl)处理pcr产物并平端连接，用于转化感受态细胞。
病毒
如下制备病毒原液：首先使用lipofectamine2000(invitrogen,carlsbad,ca)用shivad8eo或shivdh12-v3ad8分子克隆对293t细胞进行转染。48小时后收集培养物上清液，并将等分试样储存在-80℃下直至使用。通过离心接种(spinoculation)1小时，用转染的细胞上清液将伴刀豆球蛋白a刺激的恒河猴pbmc(500μl中的2x106个细胞)感染，将其与相同数目/体积的经激活pbmc混合，并将培养物维持至少12天，每日更换培养基。在峰值rt产生时间附近合并上清液培养基的样品以制备单个病毒原液。
抗体
分离并产生了11种单克隆抗体(vrcol、nih45-46、45-46g54w、45-46m2、3bnc117、12a12、1nc9和8anc195、10-1074、pgt121以及pgt126)。将一种登革病毒ns1特异性人igg1单克隆抗体——den3，或对照人igg用作该研究中的阴性对照抗体。在病毒攻击前24小时静脉内施用选择用于暴露前被动转移的单克隆抗体。
血浆病毒rna水平的定量
通过实时逆转录pcr(abiprism7900ht序列检测系统；appliedbiosystems)来确定血浆中的病毒rna水平。
血浆中的抗体浓度
使用重组hiv-1jrflgp120(progeniespharmaceuticals)或hiviiib(advancedbiotechnologyinc.)通过酶联免疫吸附测定(elisa)来确定猴血浆中所施用的单克隆抗体的浓度。简言之，将微量滴定板用hiv-1gp120(2μg/ml)包被并在4℃下温育过夜。该板用pbs/0.05％tween-20洗涤并用1％(vol/vol)bsa封闭。封闭后，将抗体或血浆样品的连续稀释液添加至该板并在室温下温育1h。用与碱性磷酸酶(pierce)偶联的山羊抗人iggf(ab)2片段检测结合，并用sigmafastopd(sigma-aldrich)进行可视化。通过基于在抗体施用后第5天或第7天开始的血浆浓度的单指数衰减公式来计算中和单克隆抗体的衰减半衰期。
中和测定
通过两种类型的中和测定来评估存在于从恒河猴收集的血浆样品中的中和活性和每种mab的体外效力和；1)用假型攻击病毒进行tzm-bl进入测定，或用能够复制的病毒进行14天pbmc复制测定。对于tzm-bl测定，将连续稀释的mab或血浆样品与假型病毒一起温育，从而表达源自shivad8eo或shivdh12_v3ad8并通过用表达各自包膜蛋白的pnlenv1和pcmv载体共转染293t细胞制备的env基因。50％>中和抑制剂量(ic50)滴度被计算为导致相对发光单位(rlu)与减去细胞对照rlu后的病毒对照孔中的水平相比50％>降低的稀释度。通过使用来自队列研究的血浆样品的tzm-b1细胞测定来确定shivdh12_v3ad8分子克隆的中和表型(滴度水平)，该血浆样品对亚型bhiv-1显示出广泛的中和活性。
动物保护性滴度的确定和统计分析。
进行了血浆中针对每种r5shiv的中和滴度的计算，得到防止了50％或80％的受病毒攻击动物中的病毒获取。使用probit回归来模拟在全部使用被动免疫猴子的情况下赋予体内消除性免疫所需的血浆中滴度与基于似然比检验的该模型的p值之间的关系。从概率单位模型估计来确定不同水平体内保护(33％、50％、80％、90％和95％>)所需的血浆滴度，并使用自举法(bootstrapping)构建90％>的置信区间。
用于被动转移实验的方案是静脉内施用递减量的中和mab，并在24小时后在直肠内攻击动物。目标是阻断病毒获取，结合向单个猕猴反复施用人源化抗hivmab可能降低其效力并且/或者可能诱导过敏反应的这一知识，选择大小足以在单次接种后建立体内感染的shiv攻击剂量。
作为第一个被动转移实验的对照，向动物静脉内施用抗登革病毒ns1igg1mab，在24h后用shivad8eo攻击该动物。vrco1是第一个对针对病毒获取的保护而测试的抗hiv-1中和mab，并将其以50mg/kg的剂量向两只猕猴施用。两只接种的猕猴中的一只(degf)完全被保护而免受shivad8eo攻击。50mg/kgvrco1(deh3)的另一个接受者变得感染，但血浆病毒血症达到峰值。向两只额外的猕猴施用较低量(20mg/kg)的vrco1，其没有得到保护而免受shivad8eo攻击。类似地评价了vrco1和abv1-9mab阻断shivdh12-v3ad8获取的能力。
通过hiv-1gp120elisa分析了各个时间从被动转移的猕猴收集的血浆样品以确定中和mab浓度。通常，攻击时(抗体施用后24小时)每种mab的血浆浓度与所施用抗体的剂量相关。
在已用shivad8eo或shivdh12-v3ad8攻击猕猴时，在mab施用后24小时收集的血浆样品上测量了中和滴度。然后计算在50％受攻击的猴中防止病毒获取所需的在血浆中测得的中和滴度。
实施例15：向慢性感染的hiv体内模型施用中和mab
最初在针对shivad8eo的tzm-bl细胞系统中测定了针对shivad8eo的广泛作用中和mab的中和活性。通过监测血浆病毒载量和细胞相关病毒核酸来评估它们阻断病毒获取或控制在用r5-趋向性shivad8eo攻击的慢性感染动物中的血浆病毒血症的能力；通过流式细胞术测量cd4+t细胞亚群的水平。循环病毒变体的sga分析和血浆中抗体水平的测定。通过测量针对仅对10-1074或3bnc117敏感的hiv-1假病毒制剂的中和活性来确定nab的血浆浓度。
实施例16–454测序文库制备
用10μl总rna和2μlrt引物混合物(50μm寡核苷酸-dt和25μm随机六聚体)进行逆转录。将混合物在95℃下加热1分钟、在65℃下加热5分钟，然后在冰上冷却1分钟。对于每个反应，用4μl5xfs缓冲液、1μl10mmdntp混合物、1μl0.1mdtt、1μlrna酶抑制剂(enzymatics)和1μlsuperscriptiiirt(invitrogen)来制备混合物。将此混合物添加至反应，并在25℃下温育10分钟、在35℃下温育5分钟、在55℃下温育45分钟并在85℃下温育5分钟。通过添加4μl大肠杆菌rna酶h(enzymatics)来去除rna/dna杂合体。使用13.75μl水、5μlcdna、5μl5xhf缓冲液、0.5μl10mmdntp、0.25μl各100μm引物原液和0.25μlphusionhotstart来组建pcr反应。以98℃(60s)、在98℃(10s)、62℃(20s)和72℃(20s)的24个循环，以及在72℃下的最终延伸(5分钟)来循环该反应。样品在qiaquick柱上纯化并在2％琼脂糖e-凝胶上运行。将所需条带用qiagenminelute凝胶提取试剂盒纯化，用10μleb缓冲剂洗脱两次，并在2100bioanalyzer上定量。将样品送到seqwright以供按照制造商的说明书进行454测序。
实施例17：假病毒产生和中和分析
为了产生假病毒，用转染试剂fugene6(promega)将编码env的质粒与env缺乏的基因组骨架质粒(psg3δenv)以1:2的比率一起共转染。转染后72小时收获假病毒用于中和测定。如前所述，使用单轮复制假病毒测定和tzm-bl靶细胞来评估中和活性。
实施例18–人类样本
从供体17获得外周血单核细胞(pbmc)，供体17是来自队列的感染hiv-1的供体。所有人类样本都根据适当机构审查委员会批准的临床方案在知情同意下收集。
实施例19–细胞分选和rna提取
将10x106个pbmc的冷冻小瓶解冻并洗涤，之后用全部来自bdbiosciences的pacificblue标记的抗cd3(ucht1)、pacificblue标记的抗cd14(m5e2)、fitc标记的抗cd19(hib19)、pe-cy5标记的抗cd10(hi10a)、pe标记的抗cd27(m-t271)和apc标记的抗cd21(b-ly4)染色。在高速bdfacsaria上进行分选，分选到mirvana裂解缓冲液(ambion)中。使用先前描述的标志物31将未成熟的b细胞、耗尽的组织样记忆b细胞、激活的成熟b细胞、静息的记忆b细胞和短寿命的外周浆母细胞染色。然后根据制造商的说明书使用mirvanarna提取试剂盒(ambion)提取来自细胞的总rna，并将其在2100bioanalyzer(agilent)上定量。
实施例20–抗体和蛋白质的表达和纯化
合成抗体序列并将其克隆到先前描述的重链和轻链载体中。分别使用fugene6(promega)或293fectin(invitrogen)将质粒转染(比率为1:1)到hek293t或293freestyle细胞中。根据制造商的方案进行转染，并在转染后四天收获抗体上清液。通过elisa对293t细胞中产生的抗体进行定量，并直接用于中和测定。通过蛋白a柱进一步纯化在293freestyle细胞中产生的抗体。使用quikchange定点诱变试剂盒(stratagene)通过定点诱变引入突变。使用293fection(invitrogen)将重组gp120蛋白质转染到293freestyle细胞中，并用雪花莲(galanthusnivalis)凝集素柱以及随后使用superdex30026/60(gehealthcare)的大小排阻将其纯化。
实施例21–细胞表面结合测定
将滴定量的mab添加到hiv-1env转染的293t细胞中，并在4℃下于1xpbs中温育1h。洗涤后，在室温下用2％pfa(polysciences)将细胞固定20min。然后洗涤细胞，并在室温下用1:200稀释的藻红蛋白偶联的山羊抗人iggf(ab’)2(jackson)将其染色1h。使用流式细胞术对结合进行分析。在添加产生ic70所需的浓度的生物素化抗体并随后用藻红蛋白标记的链霉亲和素(invitrogen)测量结合之前，通过滴定量的竞争性单克隆抗体来进行结合竞争。使用flowjo软件进行数据解释。
实施例22–elisa测定
进行通过elisa的结合。简言之，将板用山羊抗人iggfc(pierce)或用gp120包被，并使用与碱性磷酸酶(pierce)偶联的山羊抗人iggf(ab’)2来检测结合。对于与从裂解的病毒体提取的gp120的结合，将板用5ng/μl的绵羊d7324抗gp120抗体(aaltobio试剂)包被。使用最终浓度为1％的np-40裂解病毒上清液并将其在37℃下于包被的板上温育2h。使用与碱性磷酸酶偶联的山羊抗人iggf(ab’)2来测量检测(pierce)。通过使用纯化igg蛋白的标准浓度曲线的线性回归来计算抗体浓度。
实施例23–abv1-9种系fab表达、纯化、结晶和x射线衍射分析
在hek293t细胞中产生abv1-9种系fab并将其纯化。简言之，在用重链和轻链基因转染后三天，收获表达培养基，并通过抗人λ轻链亲和基质(captureselectfabλ；bac)来纯化分泌的fab，随后进行阳离子交换色谱法和大小排阻色谱法。在含有ph为6.5的0.2m乙酸镁、20％w/vpeg8000、0.1m二甲胂酸钠的条件下获得x射线衍射质量晶体。在于液氮中固定并骤冻晶体之前，将母液补充20％的甘油以供冷冻保护。收集完整的数据集。使用xds进行数据处理。使用在空间群p212121中的phaser以pgt123fab结构为搜索模型来解析pgt121种系结构。使用phenix和coot的组合进行细化。
实施例24–原始数据处理：vdj比对和克隆定义
使用以python编写的内部工具处理原始测序数据。读取被分成条码、大小过滤并与imgt的种系vdj参考数据库比对。对于非常高度突变的序列，得分保持较低。首先比对v区，然后将其去除，然后比对j，然后将其出去，随后比对d。然后提取每个读取的imgt定义的cdr3序列。将该cdr3序列按丰度排序并与usearch5.1聚簇。最后，将每个cdr3序列与abv1-9的靶抗体序列比对以确定来自这些抗体的发散值。
实施例25–抗体变体鉴别和分析
使用发散-突变图作为鉴别与已知抗体相似的读取的工具。手动鉴别高于背景的序列和簇的高度一致性簇，并将其用作用immunitree进行系统发育推理的输入。immunitree执行克隆的体细胞超变的贝叶斯模型(包括shm和测序错误的概率模型)并在树结构、亚克隆的出生/死亡时间、出生/死亡、突变，和测序错误率、亚克隆共有序列以及读取至节点的分配上实施马尔可夫链蒙特卡洛理论。该树结构还用于多次计算和覆盖不同的信息。使用baseline算法估计给定节点已经经历的选择压力。通过比较节点共有序列的cdr/fwr中所观察到的替换/沉默突变的数目来进行选择压力的贝叶斯估计。
实施例26：从hivelite控制器回收已知的低频率vhvl对
作为测定的配对灵敏度和准确度的进一步验证，对样品进行处理，其中几个罕见(10,000个细胞中<1个细胞)的天然vhvl配对是已经公开已知的。获得来自hivelite控制器患者的外周b细胞，近年来针对展示hiv中和活性的抗体大量甄选了该hivelite控制器的记忆b细胞。处理350,000个b细胞以生成总共38,620个过滤的vhvl对。有趣的是，该个体显示出比先前的健康样品(图3a)或典型健康外周b细胞组库更大的igg比例。将来自该数据集的vh序列与来自该个体(包括pgt121)的所有报道的广谱中和抗体(bnab)进行比较，发现八个接近或相同的vh序列，表明该bnab家族代表少于0.03％的循环b细胞。至关重要的是，与这些重链配对的所有轻链均属于所预期且类似罕见的bnab谱系，其展示出与先前报道相同的igλ-v3-21/j3重排和标志性三联密码子插入，这支持我们方法的高精确度和高灵敏度。此外，在来自该个体的所有已知和新生成的pgt121样vhvl对的系统树上(图3b)，vh和vl树显示出惊人相似的拓扑结构，其中配对的vh和vl序列占据镜样位置，这可能反映了共享系统发生史。本文发现的变体对很符合这个规则。有趣的是，两个公开的抗体pgt122和pgt123表现为例外；没有发现对这两种配对的支持，反而发现了pgt122vh:pgt123vl样配对和pgt123vh:pgt122vl样配对，对应于原始报告中的未经证实的配对。合成了编码8个新型pgt样vhvl对的完整v(d)j区的dna，将抗体表达为完全igg并测试其中和多个hiv假毒株的能力(图6c)。该抗体表达良好，并且均显示出对该病毒的强中和活性，证明了我们的方法在从相关生物样品快速生成天然配对的功能性抗体变体方面的实用性。
实施例27：人类样品
在个人基因组计划(personalgenomeproject)的批准下收集了用于健康组库验证的血液样品。用于hivbnab实验的pbmc从供体17中获得，供体17是来自iaviprotocolg队列的hiv-1感染供体。根据由卢旺达国家伦理委员会(therepublicofrwandanationalethicscommittee)、埃默里大学机构审查委员会(theemoryuniversityinstitutionalreviewboard)、赞比亚大学研究伦理委员会(theuniversityofzambiaresearchethicscommittee)、查林十字研究伦理委员会(thecharingcrossresearchethicscommittee)、uvri科学与伦理委员会(theuvriscienceandethicscommittee)、新南威尔士大学研究伦理委员会(theuniversityofnewsouthwalesresearchethicscommittee)、圣文森特医院和东悉尼地区卫生服务机构(st.vincent’shospitalandeasternsydneyareahealthservice)、肯雅塔国家医院伦理研究委员会(kenyattanationalhospitalethicsandresearchcommittee)、开普敦大学研究伦理委员会(universityofcapetownresearchethicscommittee)、国际机构审查委员会(theinternationalinstitutionalreviewboard)、玛希隆大学伦理委员会(themahidoluniversityethicscommittee)、沃尔特里德陆军研究所(wrair)机构审查委员会(thewalterreedarmyinstituteofresearch(wrair)institutionalreviewboard)和象牙海岸“国家生命科学和健康伦理”委员会(cnesvs)(theivorycoastcomite“nationald’ethiquedessciencesdelavieetdelasante”(cnesvs))批准的临床方案，在书面知情同意的情况下收集所有人类hiv样品。根据irb批准的方案，在知情同意的情况下从conversantbiologics获得来自单个供体的冷冻保存的、解离切除的卵巢腺癌。
实施例28–抗hiv嵌合抗原受体(car)t细胞
通过合成重链和轻链的密码子优化序列(被连接体如(ggggs)3连接体分隔开)来产生抗hiv单链可变片段(sfv或scfv)形式的abv-1–9的基因。对于每种抗hiv抗体，scfv基因被包含在编码car的载体，如编码这样的car的载体中，该car包含与cd3ζ信号传导结构域融合的4-1bb衍生的信号传导结构域以产生抗hivcar编码载体，如慢病毒载体。用抗hivcar编码载体转导原代cd4+和cd8+t细胞。
表达抗hivcar的t细胞的表征
测试了富集的抗hivcar转导的t细胞响应于感染hiv-1的细胞而增殖的能力。用celltraceviolet标记抗hivcar转导的t细胞，然后将其与感染hiv-1nl4-3的细胞(如jurkat、supt1、hek293t或hela细胞)共培养。通过流式细胞术测量抗hivcar转导的t细胞的增殖，并且显示该增殖相对于未转导的t细胞是增加的。
测试了富集的抗hivcar转导的t细胞介导感染hiv-1的细胞的特异性杀伤的能力。当抗hivcar转导的t细胞与感染hiv-1的靶细胞共培养时，在铬释放实验中测定抗hivcar转导的t细胞。测量感染hiv-1的细胞的特异性裂解，并且显示特异性裂解由于抗hivcar转导的t细胞而发生。
用表达car的t细胞治疗
用抗hivcar载体转导来自感染hiv的受试者的t细胞以表达抗hivcar。向该受试者施用抗hivcar转导的t细胞。表达抗hiv-car的靶抗原的细胞被抗hivcar转导的t细胞杀死，这在受试者中减少或清除了hiv感染，并且/或者减轻其症状。