本公开涉及基于纤维蛋白原的密封剂制剂及其用途。
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：被视为与本发明所公开的主题的
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相关的参考文献列出如下：-美国专利no.8,962,033本文对上述参考文献的承认不应被推论为意味着这些以任何方式与本发明所公开的主题的专利性相关。
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用于止血的纤维蛋白密封剂制剂通常含有两种液体组分，即纤维蛋白原和凝血酶，它们被冷冻储存或以冻干状态储存。美国专利no.8,962,033描述了纤维蛋白基质，并且具体地描述了用于将纤维蛋白基质施用到渗漏组织上的方法，该方法包括将一定量的固体纤维蛋白密封剂共混物施用到组织上，该固体共混物包含能够在与纤维蛋白原反应时形成纤维蛋白的蛋白水解酶；以及随后向固体纤维蛋白密封剂上施用一定量的液体纤维蛋白密封剂制剂。固体纤维蛋白与液体纤维蛋白的组合在该组织上形成纤维蛋白基质。具体实施方式本公开基于在以液体形式储存时保持稳定的密封剂制剂的开发。具体地讲，根据其各方面中的第一方面，本公开提供了密封剂制剂，该密封剂制剂包含含有纤维蛋白原和哺乳动物凝血级联成员的激活剂的共混物，其中所述激活剂对于所述哺乳动物级联为外源的，并且所述成员在哺乳动物凝血级联中位于纤维蛋白原的上游。在一些实施方案中，该密封剂制剂是液体共混物。已发现该液体共混物能够在2℃-8℃下以及室温下稳定至少5天。在一些实施方案中，该激活剂包括毒液、毒液组分或毒液组分的类似物。毒液或毒液组分的示例包括但不限于蛇静脉酶、鲁塞尔蝰蛇毒x因子(rvv-x)、鲁塞尔蝰蛇毒v因子(rvv-v)、noscarin、oscutarin、trocarin、convulxin、botrocetin以及所述毒液组分的任何组合。在一些实施方案中，该激活剂是蛇静脉酶。在一些实施方案中，该激活剂是rvv-x。在一些实施方案中，该激活剂是rvv-v。在一些实施方案中，该激活剂是rvv-x与rvv-v的组合。本公开还提供了施用装置，该施用装置包括容纳本文所公开的密封剂制剂的筒体；以及用于在需要时穿过其中递送密封剂制剂的可重新密封的开口。在一些实施方案中，该施用装置呈容纳液体形式的密封剂制剂的注射器的形式。根据又一个方面，本公开提供了伤口敷料，该伤口敷料包括容纳本文所公开的密封剂制剂的支持基质。根据另外一个方面，本公开提供了用于促进纤维蛋白凝块的形成的方法，该方法包括使血液与所公开的密封剂制剂接触。根据又一个方面，本公开提供了治疗有需要的受试者中的出血伤口的方法，该方法包括向所述伤口的至少一部分上施用一定量的本文所公开的密封剂制剂，所述密封剂制剂的量能有效促进受试者伤口中的凝血。最后，根据另一个方面，本文提供了试剂盒，该试剂盒包括如本文所公开的密封剂制剂，以及使用密封剂制剂促进所述伤口中的凝血的说明，所述说明包括将密封剂制剂施用到所述伤口的至少一部分上。附图说明为了更好地理解本文公开的主题并且举例说明如何可在实践中实施该主题，现在参照附图仅通过非限制性示例来描述各实施方案，其中：图1是示出作为蛇静脉酶浓度的函数的凝结时间的曲线图。图2是示出密封剂制剂在室温下或在2℃-8℃下储存后凝结时间的稳定性的曲线图，该稳定性是添加蛇静脉酶后的时间(分钟)的函数。图3是示出密封剂制剂在室温下或在2℃-8℃下储存后凝结时间的稳定性的曲线图，该稳定性是添加蛇静脉酶后的时间(天)的函数。图4是示出在含或不含rvv-v的情况下作为rvv-x浓度的函数的平均凝结时间的曲线图。图5是示出在含或不含rvv-v的情况下作为rvv-x浓度的函数的平均凝结时间的对数的曲线图。图6是示出作为添加rvv-x后的时间(分钟)的函数的在室温下或在2℃-8℃下储存时凝结时间(秒)的平均值的曲线图。图7是示出作为添加rvv-x后的时间(天)的函数的在室温下或在2℃-8℃下储存时凝结时间的稳定性的曲线图。具体实施方式本发明基于即用型全合一(aio)密封剂制剂的开发。本发明人已开发了可在注射器(单个筒体)中递送而不会出现堵塞(例如，由非期望的凝血引起)的制剂，堵塞是目前可用的密封剂普遍存在的现象。具体地讲，已发现通过将纤维蛋白原与凝血级联中的关键成员之一的激活剂(即，不直接作用于纤维蛋白原的激活剂)组合，即使呈液体形式，组合的共混物也是稳定的。该制剂将为液体稳定的，这是由于该制剂不含凝血所需的任何酶前体，例如凝血酶原、因子x等。在含有该成员(例如酶原)的血液的存在下，凝血将被激活剂快速激活。如非限制性实施例中所示，使用作用于纤维蛋白原上游的凝血级联成员的激活剂，可以将血浆的凝结时间显著减少到不到30秒，而不使用激活剂时需要超过490秒。已发现激活剂与纤维蛋白原的混合物即使在室温(本文定义为等于或介于20-25℃之间的温度)下也能稳定至少5天并且不受冻融的影响。因此，根据第一方面，本文提供了密封剂制剂，该密封剂制剂包含含有纤维蛋白原和哺乳动物凝血级联成员的激活剂的共混物，其中所述激活剂对于所述哺乳动物级联为外源的，并且所述成员在凝血级联中位于所述纤维蛋白原的上游。在本发明的上下文中，术语“密封剂制剂”应当理解为组织粘合剂，该制剂具有的成分在与组织或血液接触时会反应，随后形成为组织粘合剂，从而阻止出血和/或密封例如脑脊液(csf)、淋巴液、胆汁、胃肠道(gi)内容物、肺空气渗漏等的生理渗漏。在本公开的上下文中，应当理解，制剂成分彼此不相互作用并且基本上是惰性的直至它们与激活剂作用于其上的成员进行接触。一旦该成员被激活剂激活，凝血就开始并且形成基于纤维蛋白凝块的组织粘合剂。该密封剂制剂包含至少纤维蛋白原与激活剂的共混物。当提及“共混物”时，其应当理解为至少纤维蛋白原与激活剂的任何形式的混合物、均质和非均质的混合物。该共混物可包含如下进一步详述的其他成分。然而，该制剂不含(即，不存在)被激活剂激活的凝血级联的成员，或所述激活剂下游的凝血级联的任何活性成员。换句话讲，该制剂被设计为仅包含彼此不相互作用的凝血级联的组分。因此，该制剂不包含凝血酶，因为该凝血酶会与纤维蛋白原相互作用。在本公开的上下文中，该共混物是液体共混物。当提及液体共混物时，其应当理解为在室温下为液体的共混物。就此而言，本公开还涵盖冷冻形式的密封剂制剂，使得在使用时，该产品在室温下解冻成其液体状态。该制剂包含促进凝血形成的至少两种组分，一种是纤维蛋白原，另一种是激活剂。在本发明的上下文中，该激活剂是在与血液接触时致使成员发生生物化学变化而变为其活性形式的生物或化学实体。在一些实施方案中，该激活剂对于哺乳动物、特别是对于哺乳动物的凝血级联为外源的。在该上下文中，应当理解，外源激活剂是指能够激活哺乳动物物种的凝血级联但通常不存在于该特定哺乳动物物种中的材料(诸如蛋白质)。例如(但不限于此)通常不存在于哺乳动物的血液中的蛇毒酶蛇静脉酶是人凝血级联成员的激活剂。因此，当使用术语“外源的”时，仅仅是为了将激活剂与哺乳动物凝血级联内通常所含的组分区分开。在一些实施方案中，该激活剂是在哺乳动物凝血级联的所述成员上游具有活性的蛋白水解酶(但对于特定哺乳动物级联为外源的，即不天然参与特定哺乳动物凝血级联)。在一些实施方案中，该激活剂是蛋白酶。在一些实施方案中，该蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。在一些其他实施方案中，该蛋白酶是金属蛋白酶。在一些实施方案中，该激活剂是蛇毒或包含诸如来自蛇毒的蛋白酶的组分，或是毒液组分的类似物，这种蛇毒或类似物对于哺乳动物物种固有地为外源的。类似物可为例如毒液组分的重组形式或其修饰形式，如下进一步讨论。不论是重组的还是修饰的，该类似物均是能保持参与凝血级联的功能性/活性的物质，使得当密封剂制剂与血液进行接触时，该类似物激活凝血级联的成员，达到形成包含纤维蛋白凝块的密封剂的程度。在一些实施方案中，该激活剂能激活凝血酶原。该激活剂可为例如以下的一者或组合：从锯鳞蝰(echiscarinatus)的毒液分离的蛇静脉酶；从澳洲虎蛇(notechisscutatusscutatus)的毒液提取的noscarin；从粗鳞蛇tropidechiscarinatus提取的trocarin；从太攀蛇oxyuranusscutellatus的毒液提取的oscutarin。所述激活剂每一者均被视为本公开的独立实施方案。在一些实施方案中，该激活剂是来自鲁塞尔蝰蛇毒的能激活因子x的rvv因子x激活剂(rvv-x)。在一些实施方案中，该激活剂是也来自鲁塞尔蝰蛇毒(d.russelii)的能激活因子v的rvv-因子v激活剂(rvv-v)；在一些实施方案中，该激活剂作用于血小板并且是以下的任一者或组合：能激活血小板的convulxin；从美洲矛头蝮蛇(bothropsjararaca)分离的引起血小板聚集的botrocetin；从苍黄拟无枝酸菌(amycolatopsislurida)分离的引起血小板聚集的瑞斯托菌素。在又一些实施方案中，该激活剂是不会直接或间接提高凝血酶生成或激活的速率(例如通过血小板聚集的诱导)的物质。在一些实施方案中，该激活剂是凝血酶的重组形式。重组毒液凝血酶原激活剂的示例尤其由annlovgren(“recombinantsnakevenomprothrombinactivators”，bioengineered，第4卷，第3期，第153-157页，2013年，该文献的内容全部并入本文)描述。这些激活剂尤其包括蛇静脉酶、trocarin、oscutarin在一些实施方案中，该激活剂包含或者是蛇静脉酶。在一些实施方案中，该激活剂包含或者是rvv-x。在一些实施方案中，该激活剂包含或者是rvv-v。在一些实施方案中，该激活剂对于哺乳动物物种为外源的，例如属于非人来源，其有时用物质进行修饰，这些物质能掩蔽激活剂，使之不受哺乳动物宿主免疫反应的影响。因此，在本公开的上下文中，当提及激活剂时，其应当理解为还包括为改善激活剂的性能而已被修饰的激活剂本身(即，活性实体本身)。性能的改善可通过增加激活剂在血液中的循环时间、减少对激活剂的免疫反应等实现。并非限于此，但这种修饰的激活剂可包含激活剂本身以及选自聚乙二醇(peg)、碳水化合物或多糖(诸如葡聚糖)的物质。在一些实施方案中，该激活剂用peg进行修饰，即，该激活剂发生聚乙二醇化。就这一点而言，当提及激活剂时，其应当理解为也是指修饰的激活剂。在本公开的上下文中，上面列出的激活剂、其重组形式或功能类似物中的每一者均被视为本公开的独立单个实施方案，即使被叙述为一组激活剂也是如此。如本文所定义，该激活剂能激活哺乳动物凝血级联的成员。在本公开的上下文中，“凝血级联的成员”应当理解为是指参与凝血级联的任何生物物质。该成员应优选地为该级联中的关键参与者，即，当其不存在时，不会发生凝血或发生凝血不足，或形成不足的纤维蛋白基质。在一些实施方案中，该成员是酶原。应当理解，酶原是非活性酶前体，其需要生物化学变化(诸如经水解反应而显露活性位点，或改变构象而显露活性位点)才能变为活性酶。在一些实施方案中，该酶原是丝氨酸蛋白酶的前体。在一些另外的实施方案中，该酶原是凝血酶原、因子x、因子ix、因子xi、因子xii、因子vii中的任一者。在一个实施方案中，该酶原是凝血酶原。在一些实施方案中，该成员是参与凝血级联通路的因子或辅因子。在一些实施方案中，凝血级联的因子或辅因子成员选自因子v和因子viii，但不限于此。因子v和因子viii是凝血级联中加快凝血反应的辅因子。在一些实施方案中，该成员是血小板。在一些实施方案中，当该成员包括血小板时，该激活剂是选自以下的物质：convulxin；botrocetin；瑞斯托菌素。纤维蛋白原和激活剂的量可有所变化。在一些实施方案中，这些量使得这两种组分之间(即，纤维蛋白原与激活剂之间)的摩尔比率在70,000:1和25:1的范围内。该范围尤其基于被证实能有效引起凝血的最低激活剂(例如蛇静脉酶)测试量，所述最低量提供66,094:1的纤维蛋白原与激活剂之比；以及显示出有效的激活剂的最高测试量，从而提供至多约26:1的比率。该制剂可包含促进凝血所需的其他成分。在一些实施方案中，该密封剂制剂包含钙。例如，如以下非限制性实施例中所示，rvv-x需要钙离子的存在以便激活因子x。在一些实施方案中，该激活剂的浓度为至少3mg/ml，有时至少4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml，且至多100mg/ml，有时至多95mg/ml、90mg/ml、85mg/ml、80mg/ml、75mg/ml、70mg/ml、65mg/ml、60mg/ml、55mg/ml、50mg/ml、45mg/ml、40mg/ml、35mg/ml、30mg/ml、25mg/ml、20mg/ml、15mg/ml、10mg/ml。当钙为该制剂的一部分时，其浓度可有所变化。在一些实施方案中，该制剂中的钙浓度为至少3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml或8mg/ml，且至多20mg/ml、19mg/ml5mg/ml、18mg/ml、17mg/ml、16mg/ml、15mg/ml、14mg/ml、13mg/ml、12mg/ml、11mg/ml、10mg/ml或9mg/ml。在一些实施方案中，该密封剂制剂包含可有助于密封剂制剂的性能的其他组分。例如(但不限于此)，该密封剂制剂包含以下的一者或多者：因子xiii、纤溶对抗物(诸如氨基己酸(ε-氨基己酸)、抑肽酶和氨甲环酸)、抗生素、稳定剂诸如精氨酸、赖氨酸、纤连蛋白、血管性血友病因子；rgd肽；生长因子、软骨诱导因子、类骨诱导因子、骨骼生长因子、胶原生长因子；细胞因子；干扰素；激素；治疗剂，诸如抗微生物剂、抗炎剂；抗癌药；化疗剂；止痛药；白介素；矿物质；刺激细胞迁移、附着和/或增殖的分子；酶；神经营养因子，如神经生长因子(ngf)；睫状神经营养因子(cntf)、它们的可药用盐或它们的混合物等，如密封剂制剂领域的技术人员所知的那样选择此类添加剂。可能的密封剂添加剂的列表尤其可见于授予z-medica的美国专利no.8,858,969“hemostaticcompositions,devicesandmethods”；以及授予orthovita的美国专利申请公布no.2014/0271610“gelatinandalginate-basedformulationsforhemostasis”；所述专利的内容以引用方式并入本文。该密封剂添加剂可以从人类或哺乳动物血浆中分离，或可以为重组的。纤维蛋白原天然地为血源性可溶性蛋白质，它可从血浆中纯化并且例如通过凝血酶这种酶转化为纤维蛋白单体。纤维蛋白单体自发地组装成构成血凝块的纤维蛋白聚合体。纤维蛋白原组分可由初始血液组合物制备。血液组合物可为全血或血液级分，即全血制品，诸如血浆。纤维蛋白原可为自体的、人来源(包括汇集血浆)或非人来源。还可能的是，纤维蛋白原通过重组方法来制备或可被化学改性。在本公开的上下文中，当提及纤维蛋白原时，其应当理解为不仅是指经纯化和分离的纤维蛋白原本身，而且是指包含纤维蛋白原的血浆生物活性组分(bac)，即浓缩的、病毒灭活的人血浆冷沉淀物，包括血浆衍生蛋白质的溶液。在一些实施方案中，纤维蛋白原作为生物活性组分(bac)的一部分提供。存在若干种类型的bac。在一些实施方案中，bac是含有作为纤溶对抗物的氨甲环酸的生物活性组分。含有氨甲环酸的bac有时称为产品名quixil(omrix,israel)。在一些其他实施方案中，bac是不含氨甲环酸的生物活性组分。这被视为第二代bac，并且在本领域中称为bac2。bac2被视为bac的稳定形式，其中在其制备期间，去除纤溶酶原(纤溶酶的酶前体，其分解纤维蛋白原和纤维蛋白)。在一个优选实施方案中，bac是bac2，即缺少氨甲环酸的生物活性组分。在ep534178的公开内容中，bac2通常被制备为组分a。例如，其中的组分a由浓缩的冷沉淀物制备，并且通过溶剂去污剂处理和巴氏消毒进行病毒灭活。在一些实施方案中，bac2是主要包含纤维蛋白原的浓缩的、病毒灭活的冷沉淀物，并且去除了纤溶酶原(可如ep1390485中所述的那样执行纤溶酶原的去除)。bac2不含纤溶对抗物。在一些实施方案中，纤维蛋白原是冷沉淀物衍生的抗血友病因子制备物的生物活性组分。如本领域已知，抗血友病因子也称为因子viii浓缩物，它也富含纤维蛋白原。可使用纤维蛋白原的任何其他来源，前提是纤维蛋白原来源不含有外源激活剂作用于其上的成员的酶原(无活性前体)。纤维蛋白原来源的示例包括但不限于重组纤维蛋白原、经纯化的纤维蛋白原，包括evicel(即，bac2)的纤维蛋白原组分、tisseel(含有抑肽酶(一种纤溶对抗物))的纤维蛋白原组分。bac溶液还可包含稳定剂，诸如精氨酸、赖氨酸以及如本领域已知的其他密封剂添加剂。在一些实施方案中，bac和优选的bac2可衍生自冷沉淀物(冷沉淀物衍生的抗血友病因子，其是由血浆制备的冷冻血液制品，如下所解释)，特别是浓缩的冷沉淀物。本文中，除非另外指明，否则当提及bac时，其应当理解为优选但非排他地是指bac2。具体地讲，在本公开的上下文中，术语“冷沉淀物”是指得自由全血制备的冷冻血浆的血液组分。当将冷冻血浆在寒冷条件下(通常在0-4℃的温度下)解冻，导致形成主要含有纤维蛋白原的沉淀物时，可获得冷沉淀物。沉淀物可例如通过离心来收集并溶解于合适的缓冲液中，诸如含有120mm的氯化钠、10mm的柠檬酸三钠、120mm的甘氨酸、95mm的盐酸精氨酸的缓冲液。bac的溶液可包含附加因子，诸如因子xiii、因子viii、纤连蛋白、血管性血友病因子(vwf)、玻连蛋白等。可如us6,121,232和/或wo98/033533中所述的那样制备bac，这些专利的内容以引用方式并入。bac的组合物可包含稳定剂，诸如纤溶对抗物(例如，氨甲环酸)和盐酸精氨酸。bac中的纤溶对抗物(诸如氨甲环酸)的量可为约80至约110mg/ml。在一些实施方案中，从血液衍生得到bac的溶液中的纤溶酶原和/或纤溶酶的浓度被有效降低到等于或少于15μg/ml，有时等于或少于12μg/ml、10μg/ml或甚至5μg/ml或更少纤溶酶原。纤溶酶原和/或纤溶酶的降低可根据us7,125,569、ep1,390,485和wo02/095019中的任何一份专利所述的方法实现，每份专利的内容均以引用方式并入本文。在一些实施方案中，bac含有纤溶酶原和/或纤溶酶。当存在这些物质时，需要纤溶对抗物，例如氨甲环酸或抑肽酶。然而，当纤溶酶原和纤溶酶的浓度被降低到等于或低于15μg/ml时，bac(例如，bac2)可不含纤溶对抗物(因为纤溶酶的浓度将不能有效引起纤维蛋白原降解)。纤维蛋白原也可为市售的物质，诸如如上所述的bac2组分(来自的纤维蛋白原组分)或任何其他含纤维蛋白原的溶液，诸如从人血浆产生的经纯化的纤维蛋白原、重组纤维蛋白原或冷沉淀物。在该上下文中，bac2已知为冷冻无菌溶液ph6.7-7.2，其主要由人纤维蛋白原的浓缩物(55-85mg/ml)和其他成分组成，所述其他成分是盐酸精氨酸、甘氨酸、氯化钠、柠檬酸钠、氯化钙、注射用水(wfi)。密封剂制剂的基本特征是其不含凝血酶或凝血酶样分子(即，具有与凝血级联中的凝血酶相同的生物功能性的分子)。密封剂制剂可为任何物理形式。在一些实施方案中，该制剂为干燥形式，诸如冻干制剂。在一些其他实施方案中，密封剂制剂为液体形式，即，至少激活剂与纤维蛋白原的液体共混物。当呈液体形式时，液体载体通常为缓冲液以将密封剂制剂的ph保持在近中性，例如ph7.0±0.5。不管该制剂的物相如何(例如，液体、冻干等)，该制剂在储存条件下都是稳定的。稳定性被确定为在25℃下储存至少5天后该制剂中不存在纤维蛋白凝块。稳定性还可从储存期间不含可见聚集中明显看出，特别是当该制剂为液体形式时。另外，根据本公开，当提及稳定的密封剂制剂时，其也应当理解为在使用时具有不受其储存温度影响的凝结时间的物质。换句话讲，在使用时，密封剂制剂将在基本上相同的时间段凝结，而不论其是储存在室温下还是储存在较低温度下，例如1℃至室温之间或2℃-8℃。本公开还提供了用于递送密封剂制剂的施用装置。在本公开的上下文中，施用装置是装置。在一些实施方案中，施用装置包括容纳本文所公开的密封剂制剂的筒体，以及穿过其中递送该制剂的可重新密封的开口。在一些实施方案中，施用装置是在注射器的筒体中容纳该制剂的注射器。该制剂可为液体形式或干燥形式，后者要在施用之前润湿(例如，用盐水)。在一些其他实施方案中，施用装置为喷雾器的形式，其被构造成通过喷雾来施用该制剂。施用装置可用于单次使用，即，将在使用全部或一部分密封剂制剂后进行处置；或其可被设计用于多次使用，使得在使用之间重新密封施用装置的开口。在一些其他实施方案中，施用装置为伤口敷料的形式，即容纳密封剂制剂的支持基质。在该实施方案的上下文中，支持基质可为非织造织物，诸如该制剂在其上被吸收、浸渍、溶胀等的湿巾中所使用的那些。具有密封剂制剂的支持基质可容纳在容器内，诸如小袋中，每个小袋在使用前打开。本公开还提供了促进纤维蛋白基质的形成的方法。根据该方法，使有效量的密封剂制剂与血液或血浆进行接触。本公开还提供了治疗伤口的方法，该方法包括向所述伤口的至少一部分上施用有效量的密封剂制剂。该施用或接触可通过任何适用的手段进行，包括但不限于与血液混合，喷雾到出血伤口上，涂抹到出血伤口上，将该制剂滴落到出血伤口上等。在本公开的上下文中，“有效量”是足以促进纤维蛋白基质形成到伤口上的量。在一些实施方案中，该量能够有效地至少抑制伤口的出血，有时制止伤口的出血并减少实现止血所需的时间。该量可取决于各种参数，诸如出血的水平、伤口的尺寸(切口大小和深度)、具有出血伤口的受试者的年龄和状况、以及本领域技术人员可认识到的其他因素。例如，该制剂可在0.01至10ml/cm2的体积范围内施用。在一些实施方案中，该有效量可为将产生快速纤维蛋白凝块(即，在不到61秒内形成纤维蛋白凝块)的量。在一些实施方案中，当该激活剂是rvv-x时，该有效量在约0.001-0.003u/ml之间，有时为约0.002u/ml(u表示单位)；当该激活剂是蛇静脉酶时，该有效量在约0.05-0.2u/ml之间，有时为约0.1u/ml。应当注意，各种可能的激活剂(例如，毒液酶)的单位(u)以不同方式确定(这是由于它们作用于不同底物)。对于蛇静脉酶、rvv-x、rvv-v，如以下列出的那样定义单位。蛇静脉酶单位：一个单位将激活凝血酶原以在37℃、ph8.4下产生一个单位的酰胺水解活性。一个酰胺水解单位将在37℃、ph8.4下每分钟水解1.0μmol的n-对甲苯磺酰基-gly-pro-arg-对硝基苯胺。rvv-x：一个单位是从因子x生成一个国际单位因子xa的rvv-x的量。rvv-v：一个单位是1ml正常血浆中所含的因子v的完全激活所需的rvv-v的活性。此外，本公开了提供了包装(试剂盒)，其包括：a.本文所公开的密封剂制剂；b.使用密封剂制剂促进出血伤口上形成纤维蛋白凝块的说明，所述说明包括将密封剂制剂施用到所述伤口上。在一些实施方案中，密封剂制剂为干燥形式，并且所述说明包括将该制剂以干燥形式(将被血液润湿)施用到伤口上的步骤或在施用到伤口上之前润湿干燥制剂的步骤。在一些实施方案中，该包装还包括密封剂施用装置，该密封剂施用装置被构造成有利于密封剂制剂与伤口的接触。在一些实施方案中，该包装提供有已位于施用装置内的密封剂制剂；在一些其他实施方案中，密封剂制剂在容器中提供并且在使用之前引入到施用装置中。在一些实施方案中，施用装置是注射器，如上文所述。在又一些其他实施方案中，施用装置是伤口敷料的形式，其中该制剂保持在支持基质上，也如上文所述。密封剂制剂可施用到绷带、泡沫、伤口敷料、药棉块和/或基质上/结合到绷带、泡沫、伤口敷料、药棉块和/或基质中。该制剂可从不同的递送剂(诸如绷带、伤口敷料、药棉块、泡沫、海绵和基质)释放进所需的位置中/释放到所需的位置上。所述释放剂可由天然和/或合成材料制成。此类材料的示例包括但不限于聚合物、水凝胶、聚乙烯醇(pva)、聚乙二醇(peg)、透明质酸、硫酸软骨素、明胶、藻酸盐、胶原蛋白基质、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)[phema]、琼脂、氧化再生纤维素(orc)、自组装肽[sap]、聚乙醇酸、聚乳酸、纤维蛋白以及它们的组合。在一些实施方案中，通过喷雾到或滴落到需要密封的组织上来施用本文所公开的密封剂制剂。在一些实施方案中，例如，如果需要密封较大表面区域以免出血，通常将使用喷雾；如果从受限区域发生出血(例如，在活检之后)，则通常将使用滴落。另选地，可在相同规程中使用喷雾和滴落。可基于各种考虑因素诸如所需的密封的类型/范围、开口(需要密封)的类型/尺寸以及医生可认识到的其他考虑因素来确定密封剂的递送模式。如本文所用，术语“一个”、“一种”和“该”包括单数和复数指代，除非上下文另有明确说明。例如，术语“激活剂”包括能够激活凝血级联的一个或多个成员的一种或多种激活剂。此外，如本文所用，术语“包含”旨在意指该制剂包含所述的组分，即纤维蛋白原和(一种或多种)激活剂，但不排除其他成分，诸如生理上可接受的载体和赋形剂以及其他活性剂。术语“基本上由...组成”用于限定包含所述的组分但排除对凝血级联可具有重要意义的其他成分的制剂。因此“由...组成”应意指排除其他成分中超过微量的成分。由这些过渡术语中的每一者定义的实施方案属于本发明的范围。此外，所有数值，例如在涉及构成该制剂的组分的量或范围时，都是近似值，其从所述值改变(+)或(-)至多20％，有时至多10％。尽管没有总是明确说明，但是应当理解，所有数字标识都应在前面加上术语“约”。现在将在根据本发明执行的实验的以下描述中对本发明进行举例说明。应当理解，这些实施例旨在是说明性的而非限制性的。显然，根据上述教导内容可以对这些实施例进行许多修改和改变。因此，应当理解，本发明可以在所附权利要求的范围内按照不同于下文特别描述的无数种可能的方式实施。非限制性实施例材料和方法材料：fact血浆，即得自georgekingbiomedical的因子分析后的血浆，产品号020-1，1ml小瓶蛇静脉酶，即得自enzymeresearchlaboratories的锯鳞蝰(echiscarinatus)凝血酶原激活剂，目录号p116-01-50eu，50eu小瓶rvv-x，即得自enzymeresearchlaboratories的圆斑蝰(viperarusselli)因子x激活剂，目录号p121-07-50u，50u小瓶rvv-v，即得自enzymeresearchlaboratories的圆斑蝰(viperarusselli)因子v激活剂，目录号p121-03-1000u，1000u小瓶得自omrix的bac2纤维蛋白原，即evicel纤维蛋白密封剂(人)的组分经纯化的纤维蛋白原，enzymeresearchlaboratories，目录号fib3纤维蛋白原由二水氯化钙(acs级，99+％，alfaaesar)制备的200mm储备钙溶液，由三(羟甲基)-氨基甲烷(99％，alfaaesar)制备的20mmph＝7.4储备tris缓冲液，方法：使用diagnosticastagostart4凝血分析仪开展多项体外研究，以评估各种酶剂量时的凝血速率、钙需求、稳定性和冻融影响。该分析仪基于一次性比色皿内振荡的不锈钢球的阻抗来测量纤维蛋白凝块制剂的速率。具体地讲，对于以下实施例中所述的凝血研究，将100μl的样品(通常由纤维蛋白原、钙和激活剂组成)添加到分析仪中的比色皿中。为了引发反应，将100μl汇集的正常血浆(pnp，来自多个供体、通常至少20个供体的血浆的混合物，以最大程度减少不同供体的凝血因子水平的变化)添加到比色皿中，并且如上所述的那样测量凝块形成速率。所有凝血测定均在37℃下进行。结果实施例1：没有外源激活剂时的凝结。本实验的目标是确立在没有激活剂时纤维蛋白原、钙和血浆的凝结时间的基线以便确立基线。还确定了最佳钙浓度。从enzymeresearchlabs商购获得的经纯化的纤维蛋白原供各种研究用作纤维蛋白原来源。如表1所示，凝结时间短至使用10mm钙时的494.0秒。在15mm和20mm钙下，凝结时间分别为563.4和683.0秒。在高于20mm的其他钙浓度下，凝结时间未被量程在999秒内的分析仪记录。表1—没有外源激活剂时的凝结时间*分析仪的最大测量时间为999秒实施例2：蛇静脉酶对凝结的效应2a–蛇静脉酶剂量反应本研究的目标是评估各种蛇静脉酶浓度对凝结时间的影响，并且确定适合将来研究的浓度。在存在纤维蛋白原(10mg/ml)、钙(10mm最终浓度)和血浆的情况下测试了在0-5个蛇静脉酶单位/ml(参见表2)范围内的蛇静脉酶的不同浓度。在凝血分析仪的温育孔中(在37℃下)温热纤维蛋白原/钙/蛇静脉酶样品，同时在试剂孔中(在37℃下)温热汇集的正常血浆(pnp)。对于这些研究，将100μl的样品(通常由纤维蛋白原、钙和激活剂组成)与100μl汇集的正常血浆合并于比色皿内，并且测量凝块形成速率。如图1所示，蛇静脉酶显著减少了纤维蛋白原/钙与血浆的凝结时间，即使在最低浓度下也是如此。存在明显的剂量反应–蛇静脉酶浓度增加使得凝结时间减少。在对数尺度上，剂量反应的线性相当好，其中r平方值为0.9952。表2—蛇静脉酶剂量反应最终蛇静脉酶浓度(u/ml)平均凝结时间(秒)5.015.22.519.21.522.71.025.80.532.90.243.00.160.70.0579.90.02116.00.01161.90700.72b：稳定性研究本研究的目的是确定在含纤维蛋白原和钙时蛇静脉酶的稳定性。将纤维蛋白原、钙和蛇静脉酶合并，分别得到10mg/ml、10mm和1u/ml的最终浓度，并且在不同时间和温度下温育。使用分析仪在t0(蛇静脉酶加入到纤维蛋白原/钙之时)之后的各种时间测量血浆的凝结时间。随时间推移的凝结变化用于评估蛇静脉酶/纤维蛋白原/钙混合物的稳定性。在该溶液储存在室温下或2℃-8℃的温度下(冰箱中)时测量稳定性。可在下表3和图2中看出，凝结时间在研究过程中略有变化，但其一般保持在25-42秒的范围内。表3—蛇静脉酶稳定性此外，图3示出了在至多5天的时间段期间的各时间点处基于凝结时间数据得出的蛇静脉酶在含纤维蛋白原和钙的溶液中的长期稳定性。2c：蛇静脉酶钙依赖性研究。本研究的目的是确定在减少纤维蛋白原和血浆的凝结时间中蛇静脉酶的钙依赖性。将蛇静脉酶加入到含和不含钙的纤维蛋白原中，然后测量血浆的凝结时间。如表4所示，纤维蛋白原/钙/蛇静脉酶混合物以与对照样品(即，不含钙的纤维蛋白原和蛇静脉酶)大约相同的速率凝结，因此蛇静脉酶对凝结时间的效应被确定为并非钙依赖性的。表4—蛇静脉酶钙依赖性数据最终蛇静脉酶浓度(u/ml)钙浓度(mm)平均凝结时间(秒)11034.31035.4实施例3：rvv-x和rvv-v对凝结的效应3a：rvv-x和rvv-v凝结时间本研究的目的是确定在与血浆合并时补充有rvv-x和/或rvv-v和钙的纤维蛋白原的凝结时间。测试了含和不含rvv-v的rvv-x的若干浓度以确定剂量反应。具体地讲，rvv-x的浓度在0-5个单位/ml的范围内，并且在加入rvv-v的情况下rvv-v的浓度为10个单位/ml。如表5、图4和图5所示，rvv-x显著减少了纤维蛋白原和钙与血浆的凝结时间，但在大于0.1u/ml的浓度下没有明显的剂量反应，因为凝结时间保持大约相同直至rvv-x处于较低的浓度。不受理论束缚，但这可能是该反应中涉及可能有限速作用的其他因子(可能为磷脂水平)的结果。当在rvv-x存在下添加rvv-v时，略微减少了凝结时间。当不存在rvv-x时，rvv-v将凝结时间从520.1秒显著减少到141.3秒。这指示rvv-v在激活中起到关键作用，并且在存在于该制剂中时可减少凝结时间。表5—rvv剂量反应*rvv-v最终浓度为10u/ml。3b：rvv-x稳定性研究本研究的目的是确定在含纤维蛋白原和钙时rvv-x的稳定性。将纤维蛋白原、钙和rvv-x合并(分别得到10mg/ml、10mm和1个单位/ml的最终浓度)，然后在t0(rvv-x加入到纤维蛋白原/钙之时)之后的各种时间测量血浆的凝结时间。在6天时间段内的凝结时间的变化用于评估rvv-x/纤维蛋白原/钙混合物的稳定性。在该溶液储存在室温下和2℃-8℃的温度下(冰箱中)时测量稳定性。如表6、图6和图7所示，凝结时间在该研究过程中保持在21-27秒的窄范围内。储存在室温下或2-8℃的冰箱中的样品之间没有实质差异。在6天时间段期间的各时间点处基于此处给出的凝结时间数据证实了rvv-x在含纤维蛋白原和钙的溶液中的稳定性。表6—rvv-x稳定性数据3c：rvv-x钙依赖性本研究的目的是确定在减少纤维蛋白原和血浆的凝结时间中rvv-x的钙依赖性。将rvv-x以1u/ml的量加入到含和不含10mm钙的纤维蛋白原(10mg/ml)中，然后测量血浆的凝结时间。如表7所示，纤维蛋白原/钙/rvv-x混合物在大约与基于剂量反应研究预计的相同时间(即，大约20秒)凝结。然而，没有钙的对照样品未在凝血分析仪中凝结，从而指示rvv-x的活性是钙依赖性的。表7—rvv-x钙依赖性最终rvv-x浓度(u/ml)钙浓度(mm)平均凝结时间(秒)11020.610999实施例4：冻融的效应本研究的目的是确定冷冻是否是储存含有作为外源激活剂的rvv-x和/或蛇静脉酶的制剂的可行方法。为此，制备含钙(10mm)和激活剂(1u/mlrvv-x或1u/ml蛇静脉酶)的纤维蛋白原(10mg/ml)溶液，并且使用汇集的血浆进行测试以确定凝结时间。将这些样品的一部分在-70℃下冷冻过夜，第二天解冻，然后再次确定血浆的凝结时间。如表8所示，在冷却前后凝结时间没有显著变化，因此冷冻是用于储存这些溶液的可行方法。表8—冻融的效应外源酶原激活剂初始凝结时间(秒)冻融后的凝结时间(秒)蛇静脉酶31.030.9rvv-x21.321.2当前第1页12