本发明涉及水产养殖动物疾病防治领域，具体涉及一种组合物杀菌剂及其在水产养殖中的应用。
背景技术：
水霉病是水产养殖中常见的疾病，是由多种水生真菌引起的一种常见继发性疾病，对水产动物的种类没有严格的选择，且难以治愈，是一种世界性分布且对养殖鱼类危害较大的疾病，也是鱼类病害防治中最棘手的一个难题。
过去针对水霉病较为有效的防治药物是孔雀石绿，然而，因孔雀石绿对动物细胞具有致畸变作用，为此2002年5月中国已将孔雀石绿列入水产养殖(食用动物)禁用药物。但自孔雀石绿开始禁用以来，一直没有研发出能够取代孔雀石绿的有效防治药物，不仅导致水霉病的防治遇到了极大的困难，也使得孔雀石绿屡禁不止，给水产食品安全带来了极大的隐患。
技术实现要素：
针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种组合物杀菌剂及其在水产养殖中的应用，能够有效防治水霉病，提高水产食品安全。
为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：
一种组合物杀菌剂，所述组合物杀菌剂包括邻苯二甲醛和溴菌清，所述邻苯二甲醛和溴菌清的质量份之比为1∶8～20∶1。
在上述技术方案的基础上，所述邻苯二甲醛和溴菌清的质量份之比为1：1～10：1。
在上述技术方案的基础上，所述邻苯二甲醛和溴菌清的质量份之比为4：1。
在上述技术方案的基础上，所述组合物杀菌剂还包括无水乙醇和OP-10，按质量份之比，所述组合物杀菌剂为：
一种组合物杀菌剂在水产养殖中的应用，所述组合物杀菌剂用于防治水产养殖的水霉真菌性疾病或/和车轮虫寄生原生动物疾病。
在上述技术方案的基础上，当所述组合物杀菌剂用于防治水产养殖的水霉真菌性疾病时，其使用量为0.4mg/L—0.8mg/L。
在上述技术方案的基础上，当所述组合物杀菌剂用于防治水产养殖的车轮虫寄生原生动物疾病时，其使用量为0.3mg/L—0.6mg/L。
在上述技术方案的基础上，当所述组合物杀菌剂用于防治水霉真菌性疾病和车轮虫寄生原生动物疾病时，其使用量为0.5mg/L—1.0mg/L。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明的组合物杀菌剂的杀菌作用较强，对水产养殖动物真菌性病害有很好的防治效果；同时，还可防治养殖动物细菌性疾病及由寄生原生动物引起的疾病。
(2)本发明的组合物杀菌剂的两种成分无明显的交互抗性，复配制剂具有明显的增效作用，有效降低了使用成本；
(3)本发明的组合物杀菌剂的毒副作用小，对环境友好，对养殖动物安全。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。
本发明实施例提供一种组合物杀菌剂，该组合物杀菌剂包括邻苯二甲醛和溴菌清，其中，邻苯二甲醛和溴菌清(1,2-二溴-2,4-二氰基丁烷)的质量份之比为1∶8～20∶1，该组合物杀菌剂可以为液体制剂、固体粉剂或其他状态。
在实际生产中，邻苯二甲醛和溴菌清的质量份之比可以根据实际需要确定，本实施例中，邻苯二甲醛和溴菌清的质量份之比可以为1：1～10：1，最优为邻苯二甲醛和溴菌清的质量份之比为4：1。
本实施例中，当组合物杀菌剂为液体制剂时，可以使用无水乙醇和OP-10(一种化工原料，成分是烷基酚聚氧乙烯醚)作为溶剂和乳化剂，此时，组合物杀菌剂的具体组成为：
本发明还提供一种组合物杀菌剂在水产养殖中的应用，组合物杀菌剂用于防治水产养殖的水霉真菌性疾病或/和车轮虫寄生原生动物疾病。
当组合物杀菌剂用于防治水产养殖的水霉真菌性疾病时，其使用量为0.4mg/L—0.8mg/。
当组合物杀菌剂用于防治水产养殖的车轮虫寄生原生动物疾病时，其使用量为0.3mg/L—0.6mg/L。
当组合物杀菌剂用于防治水霉真菌性疾病和车轮虫寄生原生动物疾病时，其使用量为0.5mg/L—1.0mg/L。
下面，通过15个实施例对本发明进行详细说明。
本发明实施例采用的水霉为常规水霉菌，按照本领域的常规方式进行培养。
实施例1
具体的实验方法为：
S1、试验浓度设计：先对不同杀菌剂进行预试，预试浓度设计参考该杀菌剂有关杀菌效力资料，然后按等10倍关系稀释成不同浓度梯度，根据预试结果从各药剂对病菌菌丝生长抑制率达10％～90％的范围内设计5个浓度梯度，作为药剂母液，进行精确试验。
S2、对各药剂母液用定量无菌水稀释至10倍于各试验浓度，然后与PDA(Potato DextroseAgar，马铃薯葡萄糖琼脂培养基)培养基按1+9比例加入到已冷至50℃～60℃的PDA培养基中，充分搅匀，倒皿，制成含不同浓度药剂的含药培养皿，每质量浓度3皿；同时，以加入等体积无菌水的PDA平板作为对照组(药剂的配比及浓度参见表1)。
S3、待培养基凝固后，用灭菌打孔器(Φ5mm)制取已培养好的菌饼，菌丝面朝下，接种于含药培养基中央，置于25℃的恒温培养箱内培养72h后，用十字交叉法测量供试病菌在含不同药剂浓度的培养基上菌落直径与对照比较，计算各药剂处理对菌落扩展的生长抑制率，并以质量浓度的对数值x及平均抑菌率的机率值(y)求毒力回归方程，计算相关系数(r)、中浓度EC50。
抑菌率％＝[(对照菌落直径-菌碟直径)-(处理菌落直径–菌碟直径)]×100/(对照菌落直径-菌碟直径)
S4、计算混配制剂共毒系数：混配制剂的联合毒力采用孙云沛的共毒系数方法表示。
根据上述方法测出各单剂及混剂对水霉菌菌丝的EC50，并按照下述公式计算毒力指数，将A的毒力指数(TIA)设为100，然后按下述公式分别求出B的毒力指数(TIB)、混剂的实际毒力指数(ATI)和理论毒力指数(TTI)，再计算共毒系数(CTC)。
B的毒力指数(TIB)＝A的EC50/B的EC50×l00
混配制剂的实测毒力指数ATI＝标准药剂A的EC50/供试药剂EC50×100。
混配制剂的理论毒力指数TTI＝Σ(某药的毒力指数ATI×在混剂中该药有效成分的百分率)。
混配制剂的共毒系数CTC＝混配制剂实际毒力指数ATI/混配制剂的理论毒力指数TTI×100。
共毒系数CTC大于120时为增效作用，小于80时为拮抗作用，介于80～120之间时为加和作用。
上述测试浓度和相关结果见表1。
表1不同配比的邻苯二甲醛和/或溴菌清及对水霉菌丝抑制作用共毒系数的测定结果。
从上述数据可以看出，当邻苯二甲醛与溴菌清以不同比例复配时，配方的共毒系数(CTC)均大于120，表明复配制剂对水霉病的防治具有明显的增效作用，其中邻苯二甲醛与溴菌清在10:1～1:1之间的增效最为显著，最优配比为4:1；可见邻苯二甲醛与溴菌清复配制剂可成为防治水霉病的理想药剂。
通过室内生测试验确定邻苯二甲醛与溴菌清两种有效成分复配有很好的增效作用，能有效防治水霉病。
实施例2～12
实施例2至12中的任一配方作为杀菌剂杀灭水霉病时，均具有明显的增效作用和防治效果。
实施例13：
A、选择实施例5制备的试剂进行防治水霉病的应用试验，检验其防治效果；同时通过与邻苯二甲醛、溴菌清单剂进行效果对比，验证复配后的增效作用。
活性成分重量百分比为25％；对照单剂的重量百分比浓度根据实施例5及单剂EC50确定。
邻苯二甲醛单剂重量百分比浓度＝实例5中邻苯二甲醛重量百分比20％+实例5中溴菌清重量百分比5％×邻苯二甲醛的EC50/溴菌清的EC50＝20％+5％×0.83/0.3＝33.8％；
溴菌清单剂重量百分比浓度＝实例5中邻苯二甲醛重量百分比20％×溴菌清的EC50/邻苯二甲醛的EC50+实例5中溴菌清重量百分比5％＝20％×0.3/0.83+5％＝12.2％。
上述单剂中的其余组分为常规助剂，最终重量百分比之和为100％。
B、选择试验用草鱼、鲫鱼，均购自市场，规格为鲫鱼：体重24—29g/尾、体长12—13cm；草鱼：体重30—37g/尾、体长14—16cm/尾，体表和解剖观察健康，暂养一周后试验。
水霉为常规水霉菌，按照本领域的常规方式进行培养。
用玻璃水族箱(60×30×50cm)饲养，增氧器24h增氧；水源为经曝气、消毒和去氯处理后的自来水，pH值为6.5～6.8，平均水温25℃，溶氧9～12mg/L，其它指标符合渔业水质标准。
C、草鱼、鲫鱼水霉病的人工感染：
挑取保藏于试管内的水霉菌丝转接于霉菌培养基上，25℃培养96h使其铺满整个培养皿。取适量培养好的水霉用研钵研碎倒入用于感染的玻璃缸水中。将若干事先用水煮开裂的玉米粒放入该玻璃缸水体内观察72h，观察到90％玉米粒有水霉生长，即判断玻璃缸水体中有水霉存在，待用于感染试验。
感染鱼的人工处理：用手术刀片将草鱼、鲫鱼背鳍下方两侧鳞片去掉，在肌肉处刮开1cm左右的小口，将刮伤后的草鱼、鲫鱼分别放入有水霉存在的玻璃缸中，每个感染缸放入10尾草鱼或鲫鱼。养殖水温由25℃下降到18±1℃，进行水霉病的人工感染。
C、草鱼、鲫鱼水霉病的预防试验
C1、泼洒方式用药(试验鱼长时间生活在含药养殖水体中)预防水霉病
对实施例5及各单剂设置2个试验浓度：0.8mg/L、1.6mg/L，每个药物浓度设三个平行组，同时设置三个空白平行组。每个组放养用于感染的草鱼或鲫鱼l0尾，观察一周。
C2、浸泡方式用药(对试验鱼进行短时间高浓度药物浸泡后再转入不含药的养殖水体)预防水霉病
对实施例5及各单剂设置2个浸泡试验浓度：4mg/L、8mg/L，每次浸泡1h，每天浸泡两次，每个药物浓度设三个平行组，同时设置三个空白平行组。每组放养用于感染的草鱼或鲫10尾，观察一周。
D、草鱼、鲫鱼水霉病治疗效果试验
D1、泼洒方式用药治疗水霉病
选取感染有水霉病的草鱼、鲫鱼分别进行泼酒用药治疗试验。对实施例5及各单剂设置2个试验浓度：0.8mg/L、1.6mg/L，每个药物浓度设三个平行组，同时设置三个空白平行组。每个组放养感染成功的草鱼或鲫鱼l0尾，观察一周。
D2、选取感染有水霉病的草鱼、鲫鱼分别进行药物浸泡治疗试验。对实施例5及各单剂设置2个试验浓度：4mg/L、8mg/L，每次浸泡1h，每天浸泡两次。每个药物浓度设三个平行组，同时设置三个空白平行组。每组放养感染成功的草鱼或鲫10尾，观察一周。
E、数据分析
根据农业部《渔药临床实验技术规范》进行药效(保护率或治愈率)评价，保护率公式如下：
保护率＝(阳性对照组发病死亡数—试验药物组发病死亡数)/阳性对照组发病死亡数×100％。
表3：实施例5与各单剂泼洒方式用药对草鱼、鲫鱼水霉病的预防效果
表4：实施例5与各单剂浸泡方式用药对草鱼、鲫鱼水霉病的预防效果
表5：实施例5与各单剂泼洒方式用药对草鱼、鲫水霉病的治疗效果
表6：实施例5与各单剂浸泡方式用药对草鱼、鲫水霉病的治疗效果
从表3泼洒方式用药的结果可看出，实施例5中制备的杀菌组合物在用药浓度为0.8mg/L对草鱼、鲫鱼的水霉病平均保护率分别为93％、86.7％，对照单剂33.8％邻苯二甲醛在用药浓度为0.8mg/L对草鱼、鲫鱼的水霉病平均保护率分别为43.3％、36.7％，对照单剂12.2％溴菌清在用药浓度为0.8mg/L对草鱼、鲫鱼的水霉病平均保护率分别为36.7％、33.3％。
从表4浸泡方式用药的结果可看出，实施例5中制备的杀菌组合物在用药浓度为4mg/L对草鱼、鲫鱼的水霉病平均保护率分别为100％、96.7％，对照单剂33.8％邻苯二甲醛在用药浓度为4mg/L对草鱼、鲫鱼的水霉病平均保护率分别为67.7％、60％，对照单剂12.2％溴菌清在用药浓度为4mg/L对草鱼、鲫鱼的水霉病平均保护率分别为63.3％、53.3％。
从表5泼洒方式用药的结果可看出，实施例5中制备的杀菌组合物在用药浓度为0.8mg/L对草鱼、鲫鱼的水霉病平均治愈率分别为70％、63,3％，对照单剂33.8％邻苯二甲醛在用药浓度为0.8mg/L对草鱼、鲫鱼的水霉病平均治愈率分别为36.7％、33.3％，对照单剂12.2％溴菌清在用药浓度为0.8mg/L对草鱼、鲫鱼的水霉病平均治愈率分别为33.3％、26.7％。
从表6浸泡方式用药的结果可看出，实施例5中制备的杀菌组合物在用药浓度为4mg/L对草鱼、鲫鱼的水霉病平均治愈率分别为86.7％、83.3％，对照单剂33.8％邻苯二甲醛在用药浓度为4mg/L对草鱼、鲫鱼的水霉病平均治愈率分别为43.3％、40％，对照单剂12.2％溴菌清在用药浓度为4mg/L对草鱼、鲫鱼的水霉病平均治愈率分别为36.7％、33.3％。
综合上述预防和治疗试验结果表明：实施例5中制备的杀菌组合物无论是泼洒还是浸泡方式用药对草鱼、鲫鱼的水霉病均有较好的预防和治疗作用，与单剂邻苯二甲醛和溴菌清(1,2-二溴-2,4-二氰基丁烷)的用药效果比较，无论是泼洒还是浸泡用药对草鱼、鲫鱼的水霉病的预防与治疗都具有明显的增效作用。
实施例14：
对车轮虫等寄生原生动物疾病防治效果的试验：试验药物的制备同实施例5。
将普遍感染有车轮虫的黄颡鱼放入盛有池塘水的塑料桶中，然后加入不同浓度的实施例5中制备的杀菌组合物，分别在加药后4h、8h两个时间点，显微镜下观察鱼鳃上的车轮虫数量、死亡情况及活力并与空白组作对比来判断药物作用效果。
结果表明：试验8h结束时，该杀菌组合物在浓度0.2ppm时，对寄生车轮虫的杀灭效果可达到62％；在浓度0.4ppm时，对寄生车轮虫的杀灭效果可达到96％；通过在湖北、安徽等地大塘应用试验，该杀菌组合物在浓度0.4ppm时，对车轮虫等寄生原生动物疾病的防治效果可达到90％。
实施例15：
安全性试验：
根据农业部《渔药临床试验技术规范》的要求和技术方法，选择以上实施例5中制备的杀菌组合物进行安全性试验，并进行统计分析。
安全性试验：选择了草鱼、白鲢、鲫鱼、鳊鱼、鲤鱼、罗非鱼、鳜鱼、鲈鱼、黄颡鱼、鮰鱼等目前主要养殖鱼类作为受试鱼，进行一般毒性安全试验。在水体中投入实施例5中制备的杀菌组合物，当水体中本产品的浓度在4ppm时(高于实施例5中制备的杀菌组合物实际大塘应用浓度0.8ppm的5倍，48h内受试鱼活动正常，没有出现应激现象(如抽搐、浮游等)，无中毒死亡现象发生，且不会导致动物细胞畸变，比较安全。
本发明不局限于上述实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围之内。本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。