苯醌衍生物在制备抗肝纤维化药物中的应用的制作方法

本发明属于医药技术领域，具体涉及苯醌衍生物(2,5-二甲基对苯醌或叔丁基对苯醌)在制备抗肝纤维化药物中的应用。

背景技术：

肝纤维化是肝脏对许多慢性炎症刺激的损伤修复反应，肝纤维化是很多肝病终末期阶段复杂病症发生的基础。如不及时治疗则可能进展成为肝硬化并出现各种终末期肝病并发症，肝硬化及其并发症已经成了全球发病与死亡的主要因素。

在肝纤维病变阶段，肝星状细胞(HSC)是主要的效应细胞,活化后的HSC发生形态和功能上的变化,转化为成纤维细胞或肌成纤维细胞样细胞(myofibroblasts,MFB),表达大量的α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA).同时HSC增殖、分化能力增强，大量分泌胶原,导致细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的降解与沉积失衡，肝内汇管区和肝小叶内以Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维为主的纤维组织增生、沉积,引起肝纤维化的发生和发展。

肝纤维化的发生和发展机制十分复杂，其中肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSC)的激活、增殖是肝纤维化发生的中心环节，因此抑制HSC的激活，减少HSC的增殖、活化是抗肝纤维化治疗的关键步骤。近年来对肝星状细胞激活的各种信号转导途径进行了深入的研究,干扰其主要的信号转导途径为肝纤维化治疗带来了新的曙光，对于找出能作为抗肝纤维化潜在的药物来缓解肝纤维化病情具有重要的临床意义。

技术实现要素：

为了克服现有制备抗肝纤维化药物的不足，本发明提供苯醌衍生物(2,5-二甲基对苯醌及叔丁基对苯醌)在制备抗肝纤维化药物中的新用途，即在制药中的新应用。

本发明的目的是提供苯醌衍生物(2,5-二甲基对苯醌及叔丁基对苯醌)在制备抗肝纤维化药物中的应用。

为了研究苯醌衍生物在制备抗肝纤维化药物中的应用，本发明选用人肝星状细胞LX-2作为实验模型，用脂多糖(LPS)处理人肝星状细胞LX-2后引发细胞内ROS含量升高而使其活化，使其具有肝纤维化细胞特性。

因醌类化合物是一类具有不饱和环二酮结构的化合物，其醌的结构可以被还原为酚羟基而具有抗氧化作用，因此我们利用醌类化合物这样的性质-其抗氧化性能而发挥2,5-二甲基对苯醌及叔丁基对苯醌的抗肝纤维化活性。

在本发明中利用循环伏安法测试了2,5-二甲基对苯醌及叔丁基对苯醌的抗氧化性能。结果发现其醌→半醌→氢化醌的两个还原过程清晰；说明其具有较好的还原性而使得其能够消除具有肝纤维化特性的细胞中过量的ROS，从而利用其抗氧化性能而发挥抗肝纤维化的作用。

在生物学实验中，CCK-8实验结果表明两种苯醌衍生物在80uM以下均显示低的细胞毒性，因此在后续的生物实验中选择50uM以下的浓度进行试验，并发现具有较好的效果。从5uM起具有一定的生物活性(有效地引起LX-2细胞凋亡及引发LX-2细胞线粒体膜电位去极化)。

从CCK-8试验、凋亡实验、线粒体膜电位测试、及利用流式细胞仪测定细胞中ROS含量、蛋白质印迹分析法分别检测了2,5-二甲基对苯醌及叔丁基对苯醌对于LPS处理后人肝星状细胞LX-2的抑制作用。结果表明，2,5-二甲基对苯醌及叔丁基对苯醌均可利用其化合物本身的抗氧化性能来消除细胞内由于LPS刺激而升高的ROS，从而抑制TLR4信号通路，减少LPS受体蛋白CD14和TLR4及干扰p-PI3K及p-AKt蛋白的表达来抑制LPS引起LX-2细胞的活化，同时通过降低Pro-caspase3，Bcl-2/Bax，XIAP,FILP蛋白的表达促使活化的LX-2细胞凋亡；通过降低α-SMA及CollagenⅠ的表达而具有一定的抗肝纤维化的活性。同时2,5-二甲基对苯醌及叔丁基对苯醌均表现为低毒性，这使得将其开发成抗肝纤维化药物提供了一定的理论基础。

进一步地，所述的苯醌衍生物为2,5-二甲基对苯醌或叔丁基对苯醌。

苯醌衍生物2,5-二甲基对苯醌及叔丁基对苯醌的结构式如下：

进一步地，所述的苯醌衍生物为2,5-二甲基对苯醌或叔丁基对苯醌的摩尔浓度范围为5-80uM。

更进一步地，所述的苯醌衍生物为2,5-二甲基对苯醌或叔丁基对苯醌的摩尔浓度为5-50uM。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、两种苯醌衍生物在80uM浓度范围内均表现为低毒性，并且在小浓度范围内发挥很好的效果(50uM以下)。

2、利用醌在生物体内通过一系列还原酶被还原为具有抗氧化能力的氢化醌结构而使其发挥抗氧化性能而消除具有肝纤维化特性的细胞中过量的ROS调节细胞内氧化还原平衡从而发挥抗肝纤维化活性。

附图说明

图1为利用循环伏安法测试2,5-二甲基对苯醌及叔丁基对苯醌的氧化还原电势图；

其中，Dime-Q为2,5-二甲基对苯醌；tBu-Q为叔丁基对苯醌；

图2为2,5-二甲基对苯醌及叔丁基对苯醌对于人肝星状细胞的毒性的影响；

其中，Dime-Q为2,5-二甲基对苯醌；tBu-Q为叔丁基对苯醌；

图3为2,5-二甲基对苯醌及叔丁基对苯醌作用LX-2细胞后线粒体膜电位图；

其中，a为空白对照组、b为2,5-二甲基对苯醌的摩尔浓度为5uM、c为2,5-二甲基对苯醌10uM、d为2,5-二甲基对苯醌20uM、e为2,5-二甲基对苯醌40uM、f为2,5-二甲基对苯醌50uM；A为空白对照组、B为叔丁基对苯醌5uM、C为叔丁基对苯醌10uM、D为叔丁基对苯醌20uM、E为叔丁基对苯醌40uM、F为叔丁基对苯醌50uM；

图4为利用流式细胞仪测定化合物引起LX-2细胞凋亡的示意图。

其中，a为空白对照组、b为2,5-二甲基对苯醌的摩尔浓度为5uM、c为2,5-二甲基对苯醌10uM、d为2,5-二甲基对苯醌20uM、e为2,5-二甲基对苯醌40uM、f为2,5-二甲基对苯醌50uM；A为空白对照组、B为叔丁基对苯醌5uM、C为叔丁基对苯醌10uM、D为叔丁基对苯醌20uM、E为叔丁基对苯醌40uM、F为叔丁基对苯醌50uM；

图5为利用流式细胞仪检测2,5-二甲基对苯醌及叔丁基对苯醌作用于LPS处理后的LX-2，细胞中ROS含量的变化结果；

其中，a为空白对照组、b为用LPS(11ug/ml)处理24h，c为先用LPS(1ug/ml)处理1h后再加入40uM 2,5-二甲基共同孵育24h、d为先用LPS(1ug/ml)处理1h后再加入40uM叔丁基对苯醌共同孵育24h、e为a-d对应的荧光强度数值；

图6为2,5-二甲基对苯醌及叔丁基对苯醌对于LPS受体蛋白表达的影响；

其中，a为CD14蛋白表达条带灰度值、b为TLR4蛋白表达条带灰度值；

图7为2,5-二甲基对苯醌及叔丁基对苯醌分别对于促肝纤维化蛋白表达的影响；

其中，c为PI3K总蛋白表达及磷酸化p-PI3K蛋白表达条带灰度值比值、d为Akt总蛋白表达及磷酸化Akt蛋白表达条带灰度值比值、e为胶原蛋白I(CollagenI)蛋白表达条带灰度值、f为α-平滑肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达条带灰度值；

图8为2,5-二甲基对苯醌及叔丁基对苯醌分别对于凋亡相关蛋白表达的影响；

其中，g为FILP蛋白表达条带灰度值、h为XIAP蛋白表达条带灰度值、i为Pro-Caspase3蛋白表达条带灰度值、j为Bax蛋白及Bcl-2蛋白表达条带灰度值比值。

具体实施方式

实施例1：循环伏安法测2,5-二甲基对苯醌及叔丁基对苯醌氧化还原电势。

将2,5-二甲基对苯醌及叔丁基对苯醌分别溶解在乙腈中使其浓度为2mM，四丁基六氟磷酸铵作为电解质，使其浓度为100mM；利用三电极体系进行测试，其中，工作电极为玻碳电极，对电极为铂电极，参比电极为Ag-Ag/Cl电极，扫速为50mv/s。实验结果表明，2,5-二甲基对苯醌及叔丁基对苯醌从醌→半醌→氢化醌的两个还原过程清晰，说明其具有很好的抗氧化能力，如图1所示。

实施例2：CCK-8细胞毒性试验

在96孔板中接种100μL(约1×10⁴cell)的LX-2细胞悬液。将培养板在37℃，5％CO₂的条件下(细胞培养箱中气体环境是95％的空气和5％的CO₂)预培养24小时，细胞增殖至80％(细胞密度)。去掉就培养基，向培养板中分别加入100μL含有不同浓度梯度(5，10，20，40，60，80uM)待测样品2,5-二甲基对苯醌及叔丁基对苯醌的完全培养基，在培养箱中继续培养24h。每孔加入10μL CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育4小时。最后用酶标仪测定在450nm处的吸光度，设置3个平行孔，测定结果取其平均值。实验结果显示，2,5-二甲基对苯醌及叔丁基对苯醌对于LX-2细胞基本没有毒性，存活率基本在80％以上。表明化合物促使LX-2细胞凋亡是通过影响其细胞内相关通路蛋白而并非通过化学物质引起的单纯细胞杀伤事件，如图2所示。

实施例3：线粒体膜电位变化检测

将LX-2细胞接种到六孔板中，将其置于在37℃，5％CO₂的条件下预培养24小时，细胞增殖至80％后，用不同浓度的2,5-二甲基对苯醌及叔丁基对苯醌(5，10，20，40，50uM)分别处理，继续培养24h后，加入Rh123溶液，终浓度为5μM，37℃避光培养30min，0.25％(浓度百分比)的胰酶消化收集细胞；预冷PBS溶液洗细胞(3000r，5min)，收集细胞；500μL PBS重悬细胞，轻轻吹打成单细胞悬液。30min内进行流式细胞仪分析(FL-1H通道检测)。结果表明2,5-二甲基对苯醌及叔丁基对苯醌均引起了活化的LX-2细胞线粒体膜电位的降低，且具有一定的浓度依赖性，因线粒体膜电位降低是凋亡发生的早期事件，说明在某种程度上，2,5-二甲基对苯醌及叔丁基对苯醌都可以引起活化LX-2细胞的凋亡，如图3所示。

实施例4：PI单染测细胞凋亡

在6六孔板中接种LX-2细胞1×10⁵个/mL，于37℃培养箱培养使其贴壁培养24h；待细胞增殖至80％-90％左右时，分别加入不同浓度的2,5-二甲基对苯醌及叔丁基对苯醌(5，10，20，40，50uM)作用24h后，用0.25％的胰蛋白酶消化并收集细胞。PBS清洗3遍；1000r下离心去上清液收集细胞，用70％的乙醇于4℃固定4h以上；弃去固定液，PBS重悬细胞，并调整细胞浓度为1×10⁴个/mL，加入PI染料染色(50μg/mL),避光孵育20min后重悬细胞，最后用流式细胞仪进行检测。实验结果表明，2,5-二甲基对苯醌及叔丁基对苯醌分别作用LX-2细胞，使其依赖于凋亡机理而降低其存活率，如图4所示。

实施例5：ROS测试

将LX-2细胞接种到六孔板中，密度为1×10⁵个/mL，于37℃培养箱培养使其贴壁培养24h；待细胞增殖至90％时，加入LPS(1ug/ml)作用24h(图5中b)或加入LPS(1ug/ml)预处理1h后再分别加入药物2,5-二甲基对苯醌及叔丁基对苯醌(图5中c、d)作用24h后，加入检测活性氧探针DCFH-DA，37℃孵育30min，用0.25％的胰蛋白酶消化并收集细胞。PBS清洗3遍，500ulPBS重悬，用流式细胞仪进行检测，如图5所示。

实验结果表明，化合物2,5-二甲基对苯醌及叔丁基对苯醌都能够有效降低由于LPS刺激细胞而引起的活性氧含量的升高，进一步说明2,5-二甲基对苯醌及叔丁基对苯醌由于其自身具有很好的抗氧化性能而使其能够很好的消除细胞中由于LPS刺激而升高的ROS。

实施例6：2,5-二甲基对苯醌及叔丁基对苯醌引起LPS受体蛋白的表达情况。

实验结果表明，LPS刺激后的的实验组与未经处理的对照组相比较，从蛋白条带灰度值可以看出TLR4及CD14的表达量明显升高，当用药物处理后，其表达量降低,说明药物显著抑制LPS受体蛋白的表达。如图6所示。

实施例7：2,5-二甲基对苯醌及叔丁基对苯醌对于促肝纤维化蛋白表达的影响。

当纤维化发生时，活化的肝星状细胞会分泌过量促纤维化蛋白，例如α-SMA及CollagenⅠ。从结果中，可以看出LPS处理后α-SMA及CollagenⅠ蛋白显著增加，而用2,5-二甲基对苯醌及叔丁基对苯醌处理后其表达量明显降低，同样PI3K及Akt蛋白的磷酸化程度受到抑制，说明2,5-二甲基对苯醌及叔丁基对苯醌都能够有效地抑制促肝纤维化相关蛋白的表达，如图7所示。

实施例8：2,5-二甲基对苯醌及叔丁基对苯醌对于凋亡相关蛋白表达的影响

促使活化的人肝星状细胞凋亡是治疗肝纤维化的有效手段，从实验结果中看出，2,5-二甲基对苯醌及叔丁基对苯醌都可以有效的活化Caspase3蛋白及上调促凋亡蛋白Bax及下调抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白和XIAP及FLIP蛋白的表达而促使活化的LX-2细胞凋亡，如图8所示。