一种治疗和/或辅助治疗骨关节疾病的药物组合物及其制备方法与流程

本发明涉及一种用于治疗和/或辅助治疗骨关节疾病的药物组合物及其制备方法和用途。

背景技术：

膝关节骨性关节炎(koa)是一种多发于中老年人的慢性、进行性骨关节病，随着社会人口的老龄化，其发病率呈上升趋势，在世界范围内居于老年病首位。koa特征性的改变是进行性的软骨退变，病变发展至晚期最终将导致关节功能丧失，严重影响患者的健康及生活质量。

由于koa始发和主要的病变部位在软骨，人们可以推知的是，软骨细胞的病变会对koa产生重要影响，延缓关节软骨退变对于预防和治疗骨关节疾病具有重要意义。

目前临床上治疗koa的药物，疗效仍不够理想，急需新的疗效显著的药物。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种治疗和/或辅助治疗骨关节疾病的药物组合物及其制备方法和用途。

本发明提供了一种治疗和/或辅助治疗骨关节疾病的药物组合物，它是由包含下述重量配比的原料药制备而成：

威灵仙480-720份、白芍480-720份、防己480-720份、黄芪320-480份、延胡索160-240份、全蝎42-78份、蜈蚣2-4份、细辛56-104份、冰片21-39份。

进一步地，它是由下述重量配比的原料制备而成：

威灵仙600份、白芍600份、防己600份、黄芪400份、延胡索200份、全蝎60份、蜈蚣3份、细辛80份、冰片30份。

其中，它是由威灵仙、白芍、防己、黄芪、延胡索、全蝎、蜈蚣、细辛、冰片的原生粉或水或有机溶剂提取物为活性成分，加入药学或保健品上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。

其中，所述制剂为口服制剂。

其中，所述口服制剂为胶囊剂、口服液、颗粒剂、丸剂、片剂、膏剂、散剂。

本发明还提供了上述组合物的制备方法，它包括如下步骤：

a、称取各重量配比的原料；

b、将全蝎、蜈蚣、防己、延胡索加乙醇浸泡，滤过，滤液回收乙醇并浓缩成流浸膏，备用；同时收集滤渣；

c、取步骤b的滤渣，加入威灵仙、白芍、黄芪、细辛，加水浸泡，煎煮二次，合并煎液，滤过，减压浓缩至相对密度为1.20～1.25(80℃)的清膏，备用；

d、合并步骤b的流浸膏和步骤c的清膏，烘干，加入冰片，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成。

本发明还提供了上述组合物在制备治疗和/或辅助治疗骨关节疾病的药物中的用途。

其中，所述骨关节疾病是指骨关节退变。

其中，所述骨关节疾病是指膝关节骨性关节炎。

本发明提供的组合物，配伍合理，具有祛风通络止痛，益气养血活血的效果，可用于头、胸胁、腰脊、四肢关节疼痛及外伤、术后引起的疼痛、肢体麻木、震颤等；本发明组合物改善骨关节退变的效果显著，可以有效的延缓、控制膝关节骨性关节炎，为临床提供了一种新的药物选择。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为正常细胞图，圆钝、完整、密集(×50)。

图2为退变细胞图，多角形并有衰老、死亡细胞(×50)。

图3为24h各组中各浓度之间od值情况图。

图4为48h各组中各浓度之间od值情况图。

图5为72h各组中各浓度之间od值情况图。

图6为本发明药物组的ii型胶原免疫组化染色图，细胞强阳性着色(免疫组化×200)。

图7为本发明药物组的ii型胶原免疫组化染色图，胞质、胞膜呈棕黄色(免疫组化×400)。

图8为氨糖美辛组的ii型胶原免疫组化染色图，细胞为阳性着色(免疫组化×200)。

图9为氨糖美辛组的ii型胶原免疫组化染色图，胞质、胞膜呈黄色(免疫组化×400)。

图10为生理盐水组的ii型胶原免疫组化染色图，细胞为弱阳性着色(免疫组化×200)。

图11为生理盐水组的ii型胶原免疫组化染色图，胞质、胞膜呈淡黄色(免疫组化×400)。

图12为本发明药物组的mmp-13免疫组化染色图，细胞为弱阳性(免疫组化×200)。

图13为本发明药物组的mmp-13免疫组化染色图，细胞核呈淡黄色(免疫组化×400)。

图14为氨糖美辛组的mmp-13免疫组化染色图，细胞为阳性着色(免疫组化×200)。

图15为氨糖美辛组的mmp-13免疫组化染色图，细胞核呈黄色(免疫组化×400)。

图16为生理盐水组的mmp-13免疫组化染色图，细胞为强阳性着色(免疫组化×200)。

图17为生理盐水组的mmp-13免疫组化染色图，细胞核呈棕黄色(免疫组化×400)。

具体实施方式

下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。

实施例1本发明组合物的制备

处方：威灵仙600g、白芍600g、防己600g、黄芪400g、延胡索200g、全蝎60g、蜈蚣3g、细辛80g、冰片30g。

制备工艺：

(1)按处方称取各原料药；

(2)将全蝎、蜈蚣、防己、延胡索4味药，用5倍量60％的乙醇浸泡7日，滤过，滤液回收乙醇并浓缩成流浸膏，备用；

(3)取4味药的滤渣，加入威灵仙、白芍、黄芪、细辛，加7倍量水浸泡0.5小时，煎煮二次，每次1小时。合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度1.02～1.05(80℃)，静置12小时，过滤，滤液减压浓缩至相对密度1.20～1.25(80℃)的清膏，备用；

(4)合并步骤(2)的流浸膏和步骤(3)的清膏，100℃烘干，加入冰片，粉碎成细粉，混匀，装入胶囊，制成1000粒，即可。

性状：本品为硬胶囊，内容物为灰褐色的粉末；气微辛，味苦。

实施例2本发明组合物的制备

处方：威灵仙480g、白芍480g、防己480g、黄芪320g、延胡索160g、全蝎78g、蜈蚣4g、细辛104g、冰片39g。

制备工艺：同实施例1的制备工艺。

实施例3本发明组合物的制备

处方：威灵仙720g、白芍720g、防己720g、黄芪480g、延胡索240g、全蝎42g、蜈蚣2g、细辛56g、冰片21g。

制备工艺：同实施例1的制备工艺。

实施例4本发明组合物的制备

处方：同实施例1的处方。

制备工艺：按处方称取各原料药，粉碎，过筛，混合均匀，分装，即得。

以下用试验例的方式说明本发明的有益效果：

试验例中，我们选用h2o2诱导退变成功的c518大鼠膝关节软骨细胞株，而不直接选择koa患者的膝关节软骨细胞，除了所获取的人退变软骨组织有不同程度的病变、无法很好地保证细胞的单一性等因素外，主要是考虑到临床上koa患者有一定时间的用药史，软骨中可能已含有不明药物成分，这对实验结果的准确性会产生重大影响。

因此，我们选用细胞活性、纯度都比较高的c518大鼠膝关节软骨细胞株，同时，在制备含药血清时，我们也选用大鼠作为血清采集对象，这样，在给细胞株加入含药大鼠血清干预时，尽可能地减少了细胞对异种血清的排斥性，降低了细胞的死亡率，有利于实验的顺利进行。

具体试验例如下：

试验例1本发明组合物用于膝关节退变软骨细胞增殖的实验

一、实验材料及仪器

1、实验对象

c518大鼠膝关节软骨细胞株由上海中医药大学脊柱病研究所提供。sd大鼠由昆明医科大学动物实验中心提供。

2、药品及试剂

本发明药物：实施例1制备的药物组合物；阳性药氨糖美辛肠溶片：由泸州医学院附属中医医院药剂科提供。青-链霉素、0.25％胰蛋白酶、高糖dmem培养基、胎牛血清(fbs)、噻唑蓝(mtt)、二甲基亚砜(dmso)均购于giblo公司。

3、仪器

shellab细胞培养箱、thermo超净工作台、leica倒置显微镜、thermo离心机、美国bio-tek全自动酶标仪。

二、实验方法

1.含药血清制备方法：将15只sd大鼠随机分为本发明药物组、氨糖美辛组和生理盐水组，每组5只，本发明药物组sd大鼠以本发明药物组合物灌胃，氨糖美辛组sd大鼠以氨糖美辛肠溶片溶于同体积蒸馏水灌胃，生理盐水组sd大鼠以生理盐水灌胃。用量和浓度按大鼠与人用药量比进行换算(meehrubner公式)，连续3d，末次灌胃2h后麻醉状态下腹主动脉采血，4℃静置过夜后离心，取血清56℃灭活30min，过滤除菌，分装，-20℃冰箱保存备用。

2.正常细胞复苏、培养：将c518大鼠膝关节软骨细胞株冻存管在37℃水浴箱中融化。将复苏的细胞移至15ml离心管中，1000r/min，离心5min，弃除上清液，再加入含1％青-链霉素和10％fbs的dmem培养基摇匀装入培养瓶中，置于细胞培养箱中培养。每3d更换1次培养液，同时观察细胞贴壁、繁殖情况。

3.诱导细胞退变：用含500μlh2o2的培养基dmem培养正常细胞3～5d，同时通过显微镜观察细胞形态，确认诱导的细胞已经退变成功。

4.mtt实验：将h2o2诱导退变成功的细胞以每孔1.0×10⁵cell/ml细胞种植于3个96孔培养板中，继续用无血清培养基培养24h，分为3组：本发明药物组[含本发明药物含药血清(2.5％、5％和10％)的培养基]、氨糖美辛组[含氨糖美辛含药血清(2.5％、5％和10％)的培养基]、生理盐水组[含生理盐水含药血清(2.5％、5％和10％)的培养基]，每组中每个浓度培养4孔，每组12孔，1个96孔板培养36个孔，继续培养，分别在24h、48h和72h后，分别每孔加入20μlmtt溶液(5mg/ml，即0.5％mtt)，继续培养4h。终止培养，吸去培养液，每孔加入150μldmso，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在全自动酶标仪波长为490nm处测量各孔的吸光值。

三、统计学分析

用spss17.0软件处理数据，mtt结果为计量资料，属正态分布，方差齐，用多组间均数两两比较的方差分析(lsd检验)，双侧α＝0.05为统计学检验水准。

四、实验结果

1.细胞退变结果：见图1-2。其中，正常软骨细胞复苏后置于培养瓶中培养时，可见细胞基本呈圆形漂浮状，分布均匀，无聚集成团现象，细胞膜完整、光滑，具有折光性(图1)。诱导退变后的退变软骨细胞呈散在分布，繁殖缓慢，分布稀疏，出现衰老、死亡细胞，呈圆形、透亮、白泡样。细胞呈长梭形或多角形，细胞质可向外突出，突出随退变程度加重而逐渐伸长，可出现聚集成团样(图2)。

可见，诱导的细胞已经退变成功。

2、mtt增殖结果

见表1、图3～5。

表1三组药物对c518大鼠膝关节退变软骨细胞增殖的影响(mtt值，)

注：在同一时间点的不同浓度中，各组之间都有统计学差异(p＜0.01)。在同一时间点的灵仙通络胶囊、氨糖美辛组中，各浓度之间都有统计学差异(p＜0.01)。在生理盐水组中，各浓度之间都无统计学差异(p＞0.05)

由表1、图3～5可见，生理盐水组的三个浓度间都无统计学差异(p＞0.05)，这证实了生理盐水对细胞并无增殖效应，起到了空白对照组的作用。

在同一时间点上，三个浓度(2.5％、5％、10％浓度)下，氨糖美辛组较生理盐水组mtt都有统计学差异(p＜0.01)，阳性药促进细胞增殖的效果明显；而本发明药物组较氨糖美辛组、生理盐水组都有统计学差异(p＜0.01)，说明本发明药物促进细胞增殖的效果更好，显著高于阳性药氨糖美辛。

另外，在同一时间点上，本发明药物组、氨糖美辛组中，高浓度与低浓度(10％与5％浓度；5％与2.5％浓度)的效果均有统计学差异(p＜0.01)，说明各药物对c518大鼠膝关节退变软骨细胞的增殖有浓度作用。

因此，本发明组合物对c518大鼠膝关节退变软骨细胞有良好的促进增殖作用，从而治疗关节软骨退变，减轻膝关节骨性关节炎koa，而且效果显著优于阳性药氨糖美辛。

试验例2本发明组合物对c518大鼠膝关节退变软骨细胞ii型胶原和mmp-13表达的影响

一、实验材料及仪器

1、实验对象

同试验例1。

2、药品及试剂

本发明药物：实施例1制备的药物组合物；阳性药氨糖美辛肠溶片：由泸州医学院附属中医医院药剂科提供。青-链霉素、0.25％胰蛋白酶、高糖dmem培养基、胎牛血清(fbs)均购于giblo公司。ⅱ型胶原、mmp-13的ⅰ抗以及ⅱ抗均购于美国santacruz公司。

3、仪器

shellab细胞培养箱、thermo超净工作台、leica倒置显微镜。

二、实验方法

1.含药血清制备方法：将sd大鼠分为本发明药物组、氨糖美辛组和生理盐水组，本发明药物组sd大鼠以本发明药物组合物灌胃，氨糖美辛组sd大鼠以氨糖美辛肠溶片溶于同体积蒸馏水灌胃，生理盐水组sd大鼠以生理盐水灌胃。用量和浓度按大鼠与人用药量比进行换算(meehrubner公式)，各组大鼠按1ml/100g体重灌胃，药物浓度为1g/ml。连续3d，末次灌胃2h后麻醉状态下腹主动脉采血，4℃静置过夜后离心，取血清56℃灭活30min，过滤除菌，分装，－20℃冰箱保存备用。

2.正常细胞培养：将c518大鼠膝关节软骨细胞加入含1％青-链霉素和10％fbs的dmem培养基培养。每3d更换1次培养液，观察细胞瓶中培养液的颜色变化以及细胞贴壁、繁殖情况。当细胞铺满细胞瓶底时，进行传代。

3.诱导细胞退变：将正常细胞先用含1％青-链霉素和10％fbs的dmem培养液培养6h，然后再用含500μlh2o2的培养基dmem培养3～5d，同时通过显微镜观察细胞形态，确认诱导的细胞已经退变成功。

4.药物干预后的退变软骨细胞免疫组化染色：将清洁盖玻片放置于6孔板内，将h2o2诱导退变成功的软骨细胞以每孔1.0×105cell/ml细胞分别种植于培养板内的盖玻片上，6h后等细胞贴壁后再用含3组浓度为10％含药血清的培养基同时培养细胞72h，然后分别用磷酸盐缓冲液(pbs)冲洗盖玻片，加入4％多聚甲醛室温固定30min，pbs冲洗3次。85％、95％、100％乙醇依次梯度脱水，pbs冲洗，0.3％h2o2浸泡20min，pbs洗涤细胞3次，封闭液37℃封闭20min，吸去封闭液，根据染色的不同分别滴加ⅰ抗(ⅱ型胶原、mmp-13)(1∶100稀释)，4℃冰箱内放置过夜。第二天用pbs冲洗，滴加ⅱ抗37℃孵育30min，pbs冲洗，滴加抗生蛋白链菌素10min，pbs冲洗，显色液显色，在显微镜下观察，待其显色，pbs冲洗终止反应。滴加苏木素1min，双蒸水冲洗，盐酸乙醇分化，95％、100％乙醇依次梯度脱水，树胶封片后放置在倒置显微镜下观察，并用图像分析系统采片。

5.免疫组化结果统计：每张切片随机在倒置显微镜下取5个高倍视野(×400)观察，记录每张切片的染色程度以及染色范围。其中，染色程度分为弱(+)、中(++)、强(+++)3个等级。染色范围分为染色范围占视野＜1/4(+)、1/4～2/4(++)、2/4～3/4(+++)、＞3/4(++++)。然后将染色程度和染色范围换算成染色指数，染色指数＝染色程度×染色范围，其中，将+、++、+++、++++分别按1、2、3、4分计算。

三、统计学分析

用spss17.0软件统计处理数据，免疫组化染色结果为等级资料，不属正态分布，方差不齐，用非参数检验中的多个独立样本比较的kruskal-wallis检验，双侧α＝0.05为显著性检验水准。

四、实验结果

ii型胶原免疫组化染色的结果：见表2、图6-11。

表2ii型胶原免疫组化染色的kruskal-wallis检验

可知，在ii型胶原免疫组化染色中，阳性药氨糖美辛组较生理盐水组有显著性差异(p＜0.01)，而本发明药物组较氨糖美辛组、生理盐水组均有显著性差异(p＜0.01)。

说明本发明组合物药物具有良好的上调软骨细胞ii型胶原表达水平的效果，并且效果显著优于氨糖美辛(染色指数χ²为17.33，df为2，p＜0.01)。

mmp-13免疫组化染色的结果：见表3、图12-17。

表3mmp-13免疫组化染色的kruskal-wallis检验

可知，在mmp-13免疫组化染色中，阳性药氨糖美辛组较生理盐水组有显著性差异(p＜0.01)，而本发明药物组较氨糖美辛组、生理盐水组均有显著性差异(p＜0.01)。

说明本发明组合物药物具有良好的下调软骨细胞mmp-13表达水平的效果，并且效果显著优于氨糖美辛(染色指数χ2为55.04，df为2，p＜0.01)。

ⅱ型胶原和mmp-13的表达水平是软骨细胞退变的代谢标志物，其中，ⅱ型胶原是正常关节软骨的主要胶原，它的存在能够维持关节软骨正常的组织形态，ⅱ型胶原的减少使组织易患koa。mmp-13(基质金属蛋白酶-13)是由关节软骨细胞产生的，裂解ⅱ型胶原作用最强的酶，在koa关节软骨中高表达。

本实验中，在退变的c518大鼠膝关节软骨细胞中，ⅱ型胶原呈现低表达，而mmp-13呈现高表达。而本发明药物具有调节c518大鼠膝关节退变软骨细胞中ⅱ型胶原、mmp-13表达水平的作用，从而减轻膝关节骨性关节炎，而且效果显著优于阳性药氨糖美辛。

综上所述，本发明组合物改善骨关节退变的效果显著，可以有效减轻膝关节骨性关节炎，为临床提供了一种新的药物选择。