一种基于二聚体前药结构的高载药聚合物纳米粒及其制备方法与流程

本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种基于二聚体前药结构的高载药聚合物纳米粒的制备方法，尤其是基于二聚体结构的疏水性药物高载药聚合物纳米粒的制备方法

背景技术

近年来，纳米给药系统用于肿瘤药物递送系统的研究屡见报道。研究显示，与传统化疗相比，纳米给药系统可有效改变药物药动学性质，通过被动靶向或主动靶向的策略，将药物有效传输至肿瘤组织或细胞，降低不良反应，提高化疗药物的治疗效果。常见的纳米粒主要通过物理包封和共价修饰的方法载药，但实践显示，所述两种方法的载药量都很低，基本在20％以下。为达到靶组织靶细胞的有效药物浓度，传统纳米粒在给药过程中不可避免的会引入大量载体材料，存在对人体产生潜在安全隐患的缺陷。

因此，本领域研究人员有意寻找一种具有高载药，体内外稳定性好的聚合物纳米粒，以提高药物的治疗效率。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种基于二聚体前药结构的高载药聚合物纳米粒及其制备方法，尤其是基于二聚体结构的疏水性药物高载药聚合物纳米粒及其制备方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于，为解决现有技术存在的问题，提供一种基于二聚体前药结构的高载药聚合物纳米粒及其制备方法，尤其是基于二聚体结构的疏水性药物高载药聚合物纳米粒及其制备方法。

本发明中，基于抗肿瘤药物需要在靶细胞内以原形药物释放，以达到肿瘤杀伤作用；由于肿瘤组织细胞内相较于胞外生理条件具有更高的还原环境，因此，在高载药聚合物纳米粒的化学结构设计中，本发明引入氧化还原敏感化学键二硫键，当高载药聚合物纳米粒进入肿瘤细胞内部，肿瘤细胞内高浓度的谷胱甘肽和glut酶等可以有效地切除二硫键，游离的巯基可环化并进一步通过电子转移将游离疏水小分子抗癌药物以原型药物释放出来，进一步提高药物的靶细胞特异杀伤能力。

本发明提供了一种高载药二聚体聚合物纳米粒制剂，其包括含硫喜树碱二聚体前药(cptd)，含药两亲性聚合物材料cptd-peg，以及多肽(nt)。所述纳米粒粒径为50～500nm。

本发明中，所述二聚体前药为含硫喜树碱二聚体前药。此二聚体前药包含可被胞内高还原环境及glut酶切除的二硫键，游离的巯基可通过环化和电子回攻，将原形药物释放出来。

本发明中，所述含药两亲性聚合物材料由含硫喜树碱二聚体前药和亲水段聚乙二醇(peg)通过化学键合连接，所用peg分子量范围为500～10000。

本发明中，所述的多肽为一段可以与肿瘤细胞表面的神经降压素多肽受体1特异性结合的配体分子，即nt肽，序列为pglu-leu-tyr-glu-asn-lys-pro-arg-arg-pro-tyr-tyr-ile-leu-cys。将其修饰在高载药二聚体聚合物纳米粒制剂表面，可将药物主动靶向递送至肿瘤细胞内。

本发明中，纳米粒的制备采用了特殊的“药包药”的纳米粒制备方式：二聚体前药直接作为两亲性聚合物材料疏水端，通过疏水作用将二聚体前药通过纳米共沉淀方式包裹在纳米粒内部。由于二聚体前药的特殊结构，其分子间作用力可阻止药物直接形成水不溶性沉淀，缓慢将疏水前药包裹于两亲性含药聚合物材料内，制备一种超高载药的纳米制剂。

第一方面，本发明提供了一种含硫二聚体前药的合成步骤，其合成方法如图1所示。

第二方面，本发明提供了一种前药-聚乙二醇两亲性聚合物化学键合的合成方法，其合成方法如图2所示。nt肽修饰的前药-聚乙二醇两亲性聚合物的合成方法如图2所示。所用聚乙二醇分子量范围包括500～10000。

第三方面，本发明提供了一种二聚体前药高载药聚合物纳米粒的制备方法，包括以下步骤(附图3)：

(1)制备质量浓度为10～100mg/ml的含硫二聚体前药储备液，所用溶剂包含二甲基甲酰胺(dmf)、二甲亚砜(dmso)、丙酮等与水互溶溶剂。

(2)制备质量浓度为0～100mg/ml的nt肽修饰前药-聚乙二醇两亲性聚合物及非修饰前药-聚乙二醇两亲性聚合物，所用溶剂包含二甲基甲酰胺(dmf)、二甲亚砜(dmso)、丙酮等与水互溶溶剂。

(3)将步骤(1)与步骤(2)的储备液以一系列比例混合，所述含硫二聚体前药与前药-聚乙二醇两亲性聚合物质量比范围为20:1～1:20，nt肽修饰前药-聚乙二醇两亲性聚合物比例范围为0～100％。

(4)将步骤(3)制备混合液在搅拌的条件下缓慢滴入去离子水或pbs7.4中。所用搅拌转速范围为100rpm～8000rpm。所得纳米粒溶液通过分子量3500透析膜透析将残余有机溶剂除去。

优选的，本发明提供了一种利用三阴性乳腺癌靶向多肽修饰的含硫二聚体高载药聚合物纳米粒体系；本发明中，将含硫二聚体前药直接与亲水性聚合物peg5000化学连接，制备两亲性聚合物材料，进一步将含硫二聚体前药直接通过共沉淀方法将其包封于两亲性聚合物材料内，制备一种高载药，可实现药物可控性释放的聚合物纳米粒。该聚合物纳米粒可有效增强药物的体内外稳定性，从而增加药物的有效递送和靶部位蓄积，发挥抗肿瘤疗效。

本发明的实施例中，为进一步提高药物在三阴性乳腺癌肿瘤部位的蓄积，综合三阴性乳腺癌的分子生物学特征，采用具有特异型识别该肿瘤细胞的靶向配体对其进行修饰，神经降压素受体1在乳腺癌中高表达，因此采用巯基化修饰的神经降压素多肽的片段pglu-leu-tyr-glu-asn-lys-pro-arg-arg-pro-tyr-tyr–ile–leu-cys，将其修饰到含硫高载药聚合物纳米粒表面，达到靶向修饰目的。

本发明的优点与效果：

1.设计合成的含硫二聚体喜树碱前药可实现药物在肿瘤细胞内的响应性释放，达到药物可控性释放的目的。

2.特殊的二聚体前药结构通过其分子间作用力，可制备高载药聚合物纳米粒。利用二聚体前药的疏水性，将其与亲水材料peg直接连接，通过“药包药”策略，可进一步增加纳米粒的载药量。

3.通过纳米共沉淀方法制备纳米粒，该制备工艺简单可行，且制得纳米粒粒径分布均一。

4、采用nt肽修饰的含硫二聚体前药高载药聚合物纳米粒，粒径为50～500nm，注射机体后血液循环保持稳定，实现长循环，进而通过nt肽的肿瘤靶向作用，将装载的治疗药物有效递送到肿瘤部位，增加药物在肿瘤组织中的蓄积，提高药物的抗肿瘤疗效。

附图说明

图1为含硫喜树碱二聚体的制备方法路线图。

图2为前药-聚乙二醇两亲性材料及nt肽修饰的前药-聚乙二醇两亲性材料合成路线。

图3为含硫二聚体前药高载药聚合物纳米粒的制备方法示意图。

图4为含硫二聚体前药高载药聚合物纳米粒的粒径分布图及透射电镜照片，其中a为纳米粒的粒径分布图，b为纳米粒的透射电镜照片。

图5为含硫二聚体前药高载药聚合物纳米粒的体外释放行为图。

图6为大鼠尾静脉注射不同纳米颗粒后药动学行为图。

图7为荷瘤小鼠尾静脉注射不同纳米颗粒24h后的肿瘤部位荧光图，其中a为活体照片，b为3d模拟照片，c为离体组织照片。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1：含硫二聚体喜树碱前药的合成，其制备方法如图1所示，包括以下步骤：

(1)化合物1(2g,11.9mmol)与咪唑(2.02g,29.7mmol)溶解于10ml无水dmf中，叔丁基二甲基硅烷(4.5g,29.7mmol)溶解于5ml无水dmf中，冰浴缓慢加入，反应液恢复室温搅拌过夜，通过tlc板确定反应完成后，反应液悬干后通过柱色谱将产物分离纯化得到化合物2；

(2)化合物4(9.45g,100mmol)溶解于150ml水溶液中加入nan3(9.75g,150mmol)加热回流反应22h，产物通过二氯甲烷萃取3次，无水硫酸镁干燥，悬干得到无色油状化合物5；

(3)化合物5(1.13g,11.2mmol)溶解于5ml无水二氯甲烷中，冰浴缓慢加入到光气溶液中(15wt％,30ml,45mmol)，室温搅拌18h后抽去溶剂及未反应的光气得到化合物5中间体。二硫代二乙二醇(8.64g,56mmol)和4-二甲基氨基吡啶(dmap,2.8g,23mmol)溶于的40ml无水dmf溶液中，上述中间体复溶于10ml无水二氯甲烷中，缓慢加入。室温反应2h，产物通过柱色谱分离得到化合物6；

(4)化合物2(110mg,0.28mmol)和dmap(88mg,0.7mmol)溶于2ml二氯甲烷中。三光气(29mg,0.09mmol)加入到上述溶液，反应20min后，2ml化合物6(77mg,0.28mmol)加入到反应液中。室温反应6h后，tlc板确定反应完成后，通过柱色谱将产物分离，纯化得到化合物7；

(5)化合物7(110mg)溶解于二氯甲烷/甲醇混合溶剂中，加入100mgamberlyst-15反应过夜。柱色谱快速分离得到化合物8；

(6)喜树碱(63.5mg,0.182mmol)、dmap(49mg,0.4mmol)和三光气(18.9mg,0.064mmol)溶解于3ml无水二氯甲烷中，室温反应15min，待固体逐渐溶解后，化合物8溶解于1ml无水二氯甲烷中，缓慢滴加入上述反应液中，tlc检测反应完成后，柱层析纯化含硫喜树碱二聚体前药化合物9(cptd)。

实施例2：合成nt肽修饰前药-聚乙二醇两亲性聚合物及非修饰前药-聚乙二醇两亲性聚合物，其制备方法如图2所示

1)合成前药-聚乙二醇两亲性聚合物

(1)nah(7.2mg,0.3mmol)缓慢冰浴加入到mpeg5000(500mg,0.1mmol)10ml无水thf溶液中，1h后，炔丙基溴(35.7mg,0.3mmol)缓慢加入到反应液中搅拌过夜，tlc检测反应完成后，加入30ml甲醇终止反应，反应液滴加入冰乙醚中得到白色沉淀炔基化peg5000；

(2)含硫二聚体前药cptd(12mg,0.01mmol)，炔基化peg5000(50mg,0.01mmol)，cubr(2mg)，pmdta(2μl)溶解于2mldmf溶液中，室温反应24h，产物在edta溶液中透析1d，去离子水中透析1天后冻干，得到白色前药-聚乙二醇两亲性聚合物(cptd-peg5000)；

2)合成nt肽修饰的前药-聚乙二醇两亲性聚合物

(1)双功能化的聚乙二醇(mal-peg-alkyl)溶解于pbs7.0中，加入2倍当量nt肽，室温反应24h，产物通过分子量5k透析袋透析冻干，得到化合物nt-peg5000-alkyl；

(2)将化合物nt-peg5000-alkyl、cptd、cubr和pmdta溶解于2mldmf溶液中室温反应24h，产物在edta溶液中透析1天，去离子水中透析1天后冻干，得到nt肽修饰的前药-聚乙二醇两亲性聚合物(nt-peg5000-cptd)。

实施例3：制备nt肽修饰高载药二聚体前药聚合物纳米粒(nt-cptdnps)

(1)将含硫二聚体喜树碱前药cptd，含药两亲性聚合物材料cptd-peg5000和nt肽修饰的含药两亲性聚合物材料nt-peg5000-cptd分别溶于dmf中配制质量浓度为10mg/ml储备液；

(2)分别吸取10μlcptd储备液,4μlcptd-peg5000储备液和1μlnt-peg5000-cptd储备液混合均匀；

(3)将上述混合液滴入到1ml高速搅拌的去离子水中(转速6000rpm)，通过纳米共沉淀方法得到澄清透明的nt肽修饰的高载药二聚体前药聚合物纳米粒(nt-cptdnps)。该纳米粒为球形粒子，具有明显的核壳式结构，内核为致密的前药聚集体。该纳米粒粒径分布均一，平均粒径在100nm左右(如图4所示)；

通过体外释放实验对制备的含硫前药高载药聚合物纳米粒进行考察，结果显示在释放介质中加入模拟胞内还原条件的dtt后，累计药物释放量显著增加，说明该纳米粒具有氧化还原敏感释放的特性(如图5所示)；并且通过给大鼠尾静脉注射不同的喜树碱制剂，考察其药动学行为的区别，结果显示nt肽修饰的含硫二聚体高载药聚合物纳米粒明显延长了药物在体内的平均滞留时间，改善了喜树碱的药动学行为(如图6所示)，通过体内靶向性实验显示，nt肽修饰的含硫二聚体高载药聚合物纳米粒可明显提高药物在肿瘤部位的蓄积，增强治疗效率(如图7所示)。