低酯果胶在防治或辅助治疗糖尿病中的应用的制作方法

本发明涉及低酯果胶在防治或辅助治疗糖尿病中的应用，属于型糖尿病的预防和治疗技术领域。

背景技术：

糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。糖尿病时长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。所以，控制患者血糖稳定变得尤为重要。

2型糖尿病占糖尿病患者90％以上。患者多在35～40岁之后发病。2型糖尿病患者体内产生胰岛素的能力并非完全丧失，有的患者体内胰岛素甚至产生过多，但胰岛素的作用效果较差，因此患者体内的胰岛素是一种相对缺乏，可以通过某些口服药物刺激体内胰岛素的分泌。但到后期仍有一些病人需要使用胰岛素治疗。目前主要的治疗方案有1)口服降糖类药物如：双胍类、磺脲类、噻唑烷二酮类等；2)以皮下注射方式胰岛素类药物；3)通过控制饮食和运动，也能对2型糖尿病有一定的缓解作用。

1型糖尿病(t1d)是由t淋巴细胞介导，以选择性攻击破坏胰岛β细胞为特征的器官特异性自身免疫性疾病。而胰岛β细胞是唯一能产生胰岛素的细胞，在维持机体血糖稳态中起着极为重要的作用。所以胰岛素缺乏就会导致患者血糖代谢紊乱，一旦发病，患者就需要使用外源胰岛素，因此1型糖尿病也同样被称为胰岛素依赖性糖尿病或者自身免疫性糖尿病。其具体发病机制尚未明确。非肥胖性糖尿病(non-obesediabetic，nod)小鼠是1型糖尿病的动物模型，80％的雌性nod小鼠在出生12周后发生自发性糖尿病。其自发糖尿病的病理过程和人类1型糖尿病的病理过程极为相似，因此目前对于1型糖尿病的诸多理论上的认识，均来自于对nod小鼠的研究结果。如何有效的防治该疾病发生变得尤为重要。目前的治疗的手段有胰岛素及其他药物治疗，胰岛移植，免疫疗法等。

同时，有研究表明，在糖尿病的发生发展过程中，无论1型还是2型糖尿病，都伴随着不同程度的肠道损伤例如肠道紧密链接蛋白表达下降，肠道通透性上升。肠道中的有害微生物透过患者肠道屏障进入体内，对糖尿病患者身体健康造成了很大危害。近年来，通过调节肠道部位的局部免疫、增强肠道屏障，减少有害微生物进入人体成为预防多种高血糖症的研究热点。

果胶是一种高分子聚半乳糖醛酸多糖，是植物细胞壁的一种成分。果胶具有良好的乳化、增稠、稳定和凝胶作用，在食品，纺织，冶金，烟草等领域有着广泛的应用。同时，果胶还有抗菌，抗炎，降血脂，抗辐射，抗癌等生物活性。果胶的酯化度(de)即指果胶半乳糖醛酸残基被一些基团酯化。酯化度指果胶中甲酯化，乙酰化和酰胺化比例的总和。可以将果胶分为2类：高酯果胶(hmp，de＞50％)、低酯果胶(lmp，de＜50％)。根据果胶酯化度的不同分别在食品领域被广泛应用于果冻，果酱，冰淇淋，果糖，乳制品等多数食品的生产上。据报告，nankathrynfuchs等发现果胶的抗癌性质存在于低酯化度果胶中，尤其是当果胶酯化度<10％以下。poppvsv等也发现柑橘果胶具有调节免疫系统和抗炎症作用。salmanh等研究发现柑橘果胶能够调节外周血单核细胞释放细胞因子。另外，果胶在肠道被宿主微生物发酵产生的代谢物如短链脂肪酸等能够调节肠道部位的免疫细胞，同时也能改善肠道绒毛形态，增强肠道屏障，提高宿主对病原菌的抵抗能力。寻找更多能够治疗/辅助治疗/预防糖尿病的药物或者食品，对于糖尿病的发病机制并开发相应的预防和治疗方法尤为重要。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明证明了低酯果胶对高血糖引起的疾病，包括糖尿病，尤其是nod小鼠发挥保护作用，并减少胰岛浸润程度。本发明涉及的低酯果胶，在安全剂量范围内对nod小鼠发挥保护作用，降低胰岛浸润程度，可作为有效成分添加到防治1型糖尿病的膳食中。

本发明中的低酯果胶，是指酯化度(de)＜50％的果胶，例如酯化度为7％的果胶。

本发明的第一个目的是提供一种预防和/或缓解和/或辅助治疗和/或治疗糖尿病的药物或者药物组合物，所述药物或者药物组合物以低酯果胶作为主要有效成分。

在本发明的一种实施方式中，所述药物或者药物组合物还包括药学上可接受的赋型剂。所述药学上可接受的赋型剂是指任何可用于药学领域的稀释剂、辅助剂和/或载体。

在本发明的一种实施方式中，本发明的低酯果胶可以与其他活性成分组合使用，只要它们不产生其他不利的作用，例如过敏反应。

在本发明的一种实施方式中，本发明的药物或者药物组合物可配制成若干种剂型，其中含有药学领域中常用的一些赋形剂；例如，口服制剂(如片剂，胶囊剂，溶液或混悬液)；可注射的制剂(如可注射的溶液或混悬液，或者是可注射的干燥粉末，在注射前加入注射用水可立即使用)；局部制剂(例如软膏或溶液)。

在本发明的一种实施方式中，用于本发明药物组合物的载体是药学领域中可得到的常见类型，包括：口服制剂用的粘合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、稀释剂、稳定剂、悬浮剂、无色素、矫味剂等；可注射制剂用的防腐剂、加溶剂、稳定剂等；局部制剂用的基质、稀释剂、润滑剂、防腐剂等。药物制剂可以经口服或胃肠外方式(例如静脉内、皮下、腹膜内或局部)给药，如果某些药物在胃部条件下是不稳定的，可将其配制成肠衣片剂。

本发明的第二个目的是提供一种预防和/或缓解和/或辅助治疗和/或治疗糖尿病的食品或者饲料，所述食品或者饲料以低酯果胶作为主要有效成分。

在本发明的一种实施方式中，所述食品包括保健食品、饮品、肠内营养制剂、膳食补充剂等。

本发明本发明的第三个目的是提供一种降低糖尿病发病率的制剂，所述制剂是以有效剂量的低酯果胶作为主要活性成分。

本发明的第四个目的是提供一种减少糖尿病胰岛细胞免疫浸润程度的制剂，所述制剂是以有效剂量的低酯果胶作为主要活性成分。

本发明的第五个目的是提供一种降低胰腺组织中促炎症因子tnf-α，il-1β，il-6，提高抗炎症因子tgf-β表达水平的制剂，所述制剂是以有效剂量的低酯果胶作为主要活性成分。

本发明的制剂是指药物、保健食品、饮品、肠内营养制剂、膳食补充剂、兽药或者饲料添加剂等。

发明的第六个目的是提供一种提高肠道紧密链接蛋白zo-2、claudin-1表达水平的制剂，所述制剂是以有效剂量的低酯果胶作为主要活性成分。

发明的第七个目的是提供一种提高胰腺组织中起到免疫抑制作用的免疫细胞比例，所述制剂是以有效剂量的低酯果胶作为主要活性成分。

发明的第八个目的是提供一种降低胰腺组织中起到促进免疫作用的免疫细胞比例，所述制剂是以有效剂量的低酯果胶作为主要活性成分。

发明的第九个目的是提供低酯果胶的新应用。所述应用，是制备预防和/或缓解和/或辅助治疗和/或治疗糖尿病的药物、保健食品、饮品、肠内营养制剂、膳食补充剂、兽药或者饲料添加剂方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用，是制备降低糖尿病发病率，或者降低胰岛免疫浸润，或者降低胰腺组织中促炎症因子tnf-α和/或il-1β和/或il-6表达水平的药物、保健食品、饮品、肠内营养制剂、膳食补充剂、兽药或者饲料添加剂方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用，是制备提高胰腺组织中抗炎症因子tgf-β表达水平的药物、保健食品、饮品、肠内营养制剂、膳食补充剂、兽药或者饲料添加剂方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用，是制备降低促进免疫细胞比例，提高抑制免疫细胞比例的药物、保健食品、饮品、肠内营养制剂、膳食补充剂、兽药或者饲料添加剂方面的应用。

本发明的有益效果：

本发明对1型糖尿病自发模型鼠进行为期22周的低酯果胶喂饲的实验，发现有显著的保护作用，可作为有效的成分添加到防治1型糖尿病的药物当中，降低临床上1型糖尿病的发生发展。

本发明通过低酯果胶对1型糖尿病模型小鼠进行预防性处理，对其胰腺组织及胰岛周围进行病理组织形态观察，小鼠胰腺组织促炎性细胞因子tnfα，il1-β，il-6，抗炎性因子tgf-β进行测定。比较低酯果胶处理组与正常膳食小鼠的各个指标水平，低酯果胶处理组小鼠各项指标显著优于正常膳食组。

附图说明

图1是给1型糖尿病模型小鼠喂饲正常膳食和5％低酯果胶饲料膳食，监测小鼠发病率(图1a)，在22周时处死小鼠对胰腺的胰岛部位进行病理学观察和分析(图1b)，对小鼠胰岛免疫浸润进行评分(图1c)；*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001。

图2是用实时定量pcr检测，小鼠胰腺部位促炎症因子(tnf-α,il-1β,il-6)及抗炎因子(tgf-β)；*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001。

图3是用实时定量pcr检测，小鼠胰腺部位促进炎症致糖尿病t细胞(a)的相对变化量(cd8⁺,ifn-γ⁺)及具有免疫抑制作用的调节性t细胞(b)相对表达量(cd4⁺cd25⁺foxp3⁺)；*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001。

图4是用流式细胞术检测，小鼠胰腺(a)，胰腺淋巴结(b)，肠系膜淋巴结(c)中具有免疫抑制性t细胞(treg)占总t细胞的比例；*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001。

图5是用蛋白免疫印迹的方法检测，小鼠盲肠部位紧密链接蛋白zo-2，claudin-1的蛋白表达水平，选取了管家基因gapdh作为参照。

具体实施方案

下面是对本发明进行具体描述。

实施例1.低酯果胶降低nod小鼠血糖及发病率

将雌性nod小鼠等分为两组，其中一组为正常饲料喂饲，另一组为5％(低酯果胶质量g/饲料总重g，低酯果胶是获自荷兰格罗宁根大学devos,paul教授的酯化度为7的低酯果胶)低酯果胶饲料喂饲。从第十周起对两组nod小鼠进行血糖测量。具体操作为将小鼠禁食12小时后，将罗氏活力型血糖试纸插入对应血糖仪中，待出现滴上血液样本的时候将小鼠尾部毛细管血液样本滴在试纸上，等待5秒钟，读取血糖值。当血糖值大于14.4mmol/l定义为发病小鼠。用kaplan-meier统计方法统计小鼠发病率。经过22周的监测发现，低酯果胶处理组小鼠血糖下降明显且发病率较正常膳食组下降35％(图1a)。

实施例2.低酯果胶显著减少nod小鼠胰岛细胞免疫浸润

用he染色的方法，将正常膳食组和低酯果胶处理组的胰腺经固定、脱水、染色、脱蜡、透明和封片等主要过程，观察胰岛炎症细胞浸润程度。如图1b，结果显示，正常膳食组炎症浸润现象明显，而低酯果胶处理组有明显改善作用并且对同组多个胰岛进行胰岛炎评级发现正常膳食组胰岛炎评分显著高于低酯果胶处理组。胰岛炎评级原则：没有胰岛炎症为0，轻微浸润为1，浸润程度小于50％为2，浸润程度大于50％为3(图1b和c)。

实施例3.低酯果胶显著降低nod小鼠胰腺部位促炎因子的表达

在nod小鼠中，tnf-α，il-1β及il-6是促炎因子。nod小鼠发病前体内炎症水平就已经高于同龄c57等品系小鼠。当nod小鼠发病期间炎症因子剧烈释放并且三者之间协同刺激加重nod小鼠炎症水平。

采用qpcr方法对促炎因子进行定量，首先把小鼠胰腺组织放在液氮中研磨成粉末，将粉末转移到trizol中剧烈混匀，加入氯仿剧烈震荡，高速离心后取上清。加入等体积的异丙醇沉淀上清中的rna，高速离心，用75％的乙醇洗涤一遍rna后，用depc水溶解rna，取2000ngrna进行反转录后，得到cdna进行qpcr，使用2^-^△△ct进行运算得到目的基因的变化量。发现低酯果胶处理组较正常膳食组tnf-α下降48％，il-1β下降58％及il-6下降44％(图2)。

实施例4.低酯果胶显著提高nod小鼠胰腺部位抗炎因子的表达

在nod小鼠中，tgf-β是抗炎因子。在胰腺部位能够提高tgf-β的表达量能够对nod小鼠起到保护作用。发现低酯果胶处理组较正常膳食组tgf-β上升31％(图2)。

实施例5.低酯果胶显著提高nod小鼠胰腺部位起到抑制免疫作用的免疫细胞比例

据报道，调节性t细胞能够保护nod小鼠降低发病率。调节性t细胞表面标记物有cd4，cd25，foxp3。通过定量pcr实验我们发现低酯果胶处理组nod小鼠中的调节性t细胞表面标记物显著高于正常膳食组(图3)。

实施例6.低酯果胶显著降低nod小鼠胰腺部位起到促进免疫作用的免疫细胞比例

普遍认为，cd8⁺、ifn-γ⁺细胞能够识别胰岛β细胞上特异性蛋白igrp206-214并特异性的攻击β细胞导致β细胞受损，所以降低此类致糖尿病cd8⁺t细胞能够有效缓解1型糖尿病。通过定量pcr实验我们发现低酯果胶处理组nod小鼠中此类t细胞表面标记物显著低于正常膳食组(图3)。

实施例7.低酯果胶显著提高nod小鼠胰腺、胰腺淋巴结、肠系膜淋巴结中起到促进免疫作用的免疫细胞比例

本实施例，使用流式细胞术准确描述了小鼠胰腺、胰腺淋巴结、肠系膜淋巴结中调节性t细胞含量。我们发现低酯果胶处理组nod小鼠三个部位中的调节性t细胞含量都有不同程度的显著上升现象(分别为图4a、b及c)。

实施例8.低酯果胶显著提高nod小鼠盲肠紧密链接蛋白zo2，claudin1的表达量

本实施例，使用蛋白免疫印迹的方法测定了小鼠盲肠紧密链接蛋白zo-2，claudin-1的蛋白表达量(上样、跑胶条件相同)。我们发现低酯果胶处理组nod小鼠的盲肠部位的紧密链接蛋白有显著上调的现象(图5)。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。