黄檗叶中黄柏苷抗肺癌中的医用用途的制作方法

本发明公开一种黄檗叶中黄柏苷抗肺癌中的医用用途，尤其涉及黄柏苷在制备抗肺癌药物中的应用，属于中医制药技术领域。

背景技术：

癌症泛指恶性肿瘤，是世界第二大死亡原因。癌症的诱因有很多，多年的流行病学研究及实验和临床观察，发现环境与行为对人类癌症的发生有重要影响。据估计约80%以上的癌症与环境因素有关。各种环境和遗传致癌因素可能以协同或序贯的方式引起细胞非致死性的dna损害，从而激活原癌基因或灭活肿瘤的抑制基因，加上凋亡调节基因和dna修复基因的改变，使细胞发生转化。被转化的细胞可先呈多克隆性增生，经过一个漫长的多阶段演进过程，其中某个克隆相对无限制扩增，通过附加突变，选择性形成不同特点的亚克隆，从而获得浸润和转移能力，形成恶性肿瘤即癌症。

目前，癌症的治疗方法主要包括：手术治疗移除肿瘤细胞；化学或放射线治疗杀死肿瘤细胞及抑制肿瘤细胞生长和分裂；靶向治疗以特异性对抗癌细胞。大部分治疗方法的机理为诱导细胞凋亡，破坏细胞遗传物质，调控细胞周期，控制细胞增殖。

在全球，肺癌是最常见的癌症之一，并且是导致癌症相关的死亡率的主要原因。非小细胞肺癌（nsclc）占所有肺癌病例的80％以上。最广泛使用的nsclc疗法是化疗，放疗和手术。尽管疗法有进步，但约85％的患者在诊断的5年内出现死亡，三分之一的iv期疾病患者的2年存活率<20％。因此，寻求有效的治疗肺癌的方法迫在眉睫。

黄檗，是一种被称为阿穆尔软木树的芸香科阔叶树，目前主要分布在中国东北，内蒙古，俄罗斯远东，南方萨哈林，韩国和日本。黄檗树高10-20米，树皮呈灰褐色至黑灰色，叶柄纤细，卵状披针形叶片，花序顶生，果呈圆球形。黄檗的树皮具有发达的木栓层，柔软而坚韧，质地美观，是制造软木塞的材料，亦可用于制作家具和工业艺术品。黄檗树皮还是一种具有显着药用价值的中药，在中国、日本和韩国被广泛使用多年。许多报道表明，黄檗提取物具有抗炎和免疫刺激活性，同时，还起到降血压、降血糖和保护心脏的作用。黄柏苷是一种广泛分布于黄檗树叶中的黄酮苷化合物。目前还没有文献公开过黄柏苷的抗肺癌应用。

技术实现要素：

本发明公开了黄檗叶中黄柏苷抗肺癌中的医用用途，黄柏苷作为天然产物，毒性低、副作用小，故本研究为天然产物在抗肿瘤领域的应用提供了新的选择。

黄柏苷在抗肺癌药物中的应用。所述的黄柏苷结构式为:

。

本发明所述的黄柏苷为能够抑制a549细胞增殖的药物。

本发明所述的黄柏苷为能够使细胞周期停滞在g2/m期的药物。

本发明所述的黄柏苷为能够诱导a549细胞凋亡的药物。

本发明所述的黄柏苷为能够破坏a549细胞内氧化-还原平衡的药物。

本发明所述的黄柏苷为能够上调细胞内bax/bcl-2相对表达水平的药物。

本发明所述的黄柏苷为能够降低细胞内线粒体膜电位的药物。

本发明所述的黄柏苷为能够激活细胞内caspase3活性的药物。

本发明的积极效果在于：提供了黄柏苷具有抗肺癌活性，公开了其新的医用用途，为黄柏苷这一天然产物在抗肺癌领域的应用提供了参考，具有良好的应用前景。同时，对于黄檗叶的利用还降低了其由于自身的化感作用对环境产生的不良影响，对保护黄檗种群具有积极作用。

附图说明

图1黄柏苷对a549细胞增殖能力的影响；

图2黄柏苷对a549细胞周期的影响-流式图（空白对照组）；

图3黄柏苷对a549细胞周期的影响-流式图（黄柏苷250μm）；

图4黄柏苷对a549细胞周期的影响-流式图（黄柏苷1000μm）；

图5黄柏苷对a549细胞周期的影响-流式图（黄柏苷2000μm）；

图6黄柏苷对a549细胞周期的影响；

图7黄柏苷对a549细胞凋亡的影响-流式图（空白对照组）；

图8黄柏苷对a549细胞凋亡的影响-流式图（黄柏苷250μm）；

图9黄柏苷对a549细胞凋亡的影响-流式图（黄柏苷1000μm）；

图10黄柏苷对a549细胞凋亡的影响-流式图（黄柏苷2000μm）；

图11黄柏苷对a549细胞凋亡的影响；

图12黄柏苷对a549细胞sod活力的影响；

图13黄柏苷对a549细胞gsh含量的影响；

图14黄柏苷对a549细胞mda含量的影响；

图15黄柏苷对a549细胞bax和bcl-2蛋白表达的影响-免疫印迹图；

图16黄柏苷对a549细胞bax蛋白表达的影响；

图17黄柏苷对a549细胞bcl-2蛋白表达的影响；

图18黄柏苷对a549细胞bax/bcl-2相对表达量的影响；

图19黄柏苷对a549细胞线粒体膜电位的影响（黄柏苷0h）；

图20黄柏苷对a549细胞线粒体膜电位的影响（黄柏苷6h）；

图21黄柏苷对a549细胞线粒体膜电位的影响（黄柏苷12h）；

图22黄柏苷对a549细胞线粒体膜电位的影响（黄柏苷24h）；

图23黄柏苷对a549细胞caspase3活力的影响。

具体实施方式

实施例1

1.细胞培养

a549细胞于含10%（v/v）胎牛血清的dmem高糖培养基中，在37℃，5%co2，饱和湿度的培养箱中培养。根据不同的实验要求分别培养于96孔板和6孔板中。

2.细胞药物处理

将细胞用250μm，1000μm和2000μm的黄柏苷处理48h，用于mtt、细胞周期、细胞凋亡、sod、mda、gsh、caspase3活力和免疫印迹检测。将细胞用2000μm的黄柏苷分别处理6h、12h和24h，用于线粒体膜电位检测。

3.相关结果

（1）黄柏苷对a549细胞增殖起抑制作用。

mtt比色法是检测细胞活力的一种常见方法，由于细胞活力与细胞数量呈正相关，因此，mtt法也常用于检测细胞的增殖情况。如图2所示，黄柏苷可以显著抑制a549细胞的增殖，且这种抑制作用的强度对药物呈现出剂量依赖性。当药物浓度为2000μm时，黄柏苷对a549细胞的抑制率达到70.87%。

（2）黄柏苷阻滞a549细胞周期于g2/m期。

碘化丙啶（pi）可以与细胞内的dna和rna结合，当采用rna酶将rna消化后，通过流式细胞术检测到的与dna结合的pi染料的荧光强度就直接反映了细胞内dna含量的多少。细胞周期各时相的dna含量不同，通常细胞在g1/g0期具有二倍体细胞的dna含量，在g2/m期具有四倍体细胞的dna含量，而在s期的dna含量介于二倍体和四倍体之间。因此，在用pi染色法检测细胞周期分布时，可以通过软件计算得到各时相细胞的百分率。

如图1-图6所示，用黄柏苷处理a549细胞48h后，对细胞进行pi染色，通过流式细胞术检测细胞周期分布情况后发现，细胞在g2/m期的比例显著上升，并且随着药物浓度的增加，g2/m期的细胞所占比例也逐渐增加，各组数据间具有统计学差异，即黄柏苷可以诱导a549细胞周期停滞在g2/m期，从而阻断肺癌细胞分裂过程，使得细胞产生增殖障碍。

（3）黄柏苷诱导a549细胞凋亡。

在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（ps）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（ps）由脂膜内侧翻向外侧。annexinⅴ是一种ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的ps高亲和力特异性结合。将annexinⅴ与pi匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。坏死细胞可以同时与annexinv-fitc和pi结合显色，凋亡晚期的细胞也同时被fitc和pi结合染色呈现双阳性，而pi由于不能透过完整的细胞膜则被排除在活细胞和早期凋亡细胞之外。

如图7-图11所示，用黄柏苷处理a549细胞48h后，对细胞进行annexinⅴ与pi双染色，通过流式细胞术检测发现，细胞出现不同程度的凋亡现象。并且随着药物浓度的增加，细胞的凋亡率也逐渐上升，当黄柏苷浓度为250μm、1000μm和2000μm时，a549细胞的凋亡率分别为13.27%、25.59%和84.32%，各组数据间具有显著统计学差异。可见黄柏苷能诱导a549细胞发生凋亡，且这种诱导作用均具有剂量依赖性。

（4）黄柏苷破坏a549细胞内氧化-还原平衡。

超氧化物歧化酶（sod）和谷胱甘肽（gsh）是细胞内重要的抗氧化剂和自由基清除剂，丙二醛（mda）是脂质氧化的终产物。这三种物质可以直观的反映出细胞内的氧化-还原平衡状态。一旦机体内氧化与抗氧化作用失衡，产生大量氧化中间产物，导致一体化氧化速度超出机体抗氧化能力，便会造成机体组织损伤。

如图12-图14所示，通过比色法检测，被黄柏苷处理48h后的a549细胞内sod活力显著下降，gsh含量明显降低，mda含量有所升高。且这种变化随黄柏苷浓度的增加愈发明显，最终sod活力下降至对照组的一半，gsh含量降低为对照组的三分之二，而mda含量升高至对照组的1.6倍。这说明黄柏苷可以破坏a549细胞内的氧化-还原平衡状态，干扰细胞正常代谢，导致细胞氧化损伤，致使其产生氧化应激，进而导致细胞凋亡。

（5）黄柏苷上调a549细胞内bax/bcl-2相对表达水平。

在细胞凋亡的机制中，bcl-2家族是最著名的一方面，该家族包括抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白两个主要成员。bcl-2是一种抗凋亡蛋白，它抑制细胞凋亡。bax是bcl-2家族的另一个成员，它是一种促凋亡蛋白，它诱导细胞凋亡。bax不仅可以本身形成同型二聚体，而且易与bcl-2蛋白形成异二聚体，从而使bcl-2失活，bax/bcl-2比率通常作为确定凋亡的指标。

如图15-图18所示，当a549细胞用黄柏苷处理48h后，利用免疫印迹法检测了细胞内bax和bcl-2两种因子的表达量变化，结果显示细胞内bax蛋白的表达量明显升高，同时，bcl-2蛋白的表达量显著下降，且药物浓度越大，此变化趋势越明显，当黄柏苷浓度为2000μm时，bax的表达量升高了3.3倍，而bcl-2的表达量却下降了86%。由此可知，黄柏苷能够使a549细胞内bax蛋白和bcl-2蛋白表达量的比值呈剂量依赖性上升，进而导致细胞发生凋亡。

（6）黄柏苷降低a549细胞线粒体膜电位。

线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。jc-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位的理想荧光探针。可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。在线粒体膜电位较高时，jc-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，可以产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，jc-1不能聚集在线粒体的基质中，此时jc-1为单体，可以产生绿色荧光。这样就可以方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。

如图19-图22所示，通过jc-1染色和荧光显微镜观察发现，在对照组中，由于正常细胞的线粒体膜电位较高，因此大多呈现红色荧光，当对a549细胞用2000μm黄柏苷处理不同时间后，细胞的绿色荧光逐渐增多，即细胞的线粒体膜电位开始下降，且这种作用呈现出时间依赖性增强。因此，黄柏苷可以明显降低a549细胞的线粒体膜电位。

（7）黄柏苷激活a549细胞内caspase3活性。

已有研究证实胱天蛋白酶是凋亡途径的中心执行者，在细胞凋亡的启动和执行中起中心作用。其中caspase3被鉴定为哺乳动物细胞凋亡的关键介质，出现在凋亡的最后阶段。

如图23所示，通过比色法检测发现，经黄柏苷处理的a549细胞内caspase3活性显著升高，且药物浓度越大，caspase3活性越高，与对照组相比，经2000μm黄柏苷处理后的细胞caspase3活性提高了31%。由此可见，黄柏苷可以激活a549细胞内caspase3活性，从而诱导细胞凋亡。

4.结论

（1）黄柏苷能够抑制a549细胞增殖，阻滞细胞周期，干扰细胞分裂，损伤细胞遗传物质。

（2）黄柏苷能够上调a549细胞内bax因子的表达，同时下调bcl-2因子的表达，并且激活caspase3，引起细胞凋亡。

（3）黄柏苷能够降低a549细胞内抗氧化酶活性使细胞处于氧化应激状态，影响线粒体氧化呼吸链的功能，降低线粒体膜电位，导致细胞无法进行正常代谢活动，最终发生凋亡。

通过以上实验结果证明，黄柏苷能够诱导a549细胞凋亡，具有显著的抗肺癌活性，并且作为天然产物，具有毒性低、副作用少的优点，因此本发明为天然产物在抗肿瘤领域的应用提供了新的选择。