一种用于治疗妇科炎症的益生菌组合物的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，特别涉一种用于治疗妇科炎症的益生菌组合物。
背景技术：
：妇科炎症是指妇女生殖系统感染所引起的疾病，妇科炎症在日常生活中是个常见疾病也是个顽固疾病，尤其在已婚妇女中病发率高，常见的症状有月经不调、痛经、附件炎、盆腔炎、宫颈炎、子宫内膜炎、阴道分泌物异常有异味等，有的甚至引起不孕不育。妇科炎症患病率高，复发率高，严重影响着女性的身心健康。多种女性下生殖道疾病是由于阴道微生态系统平衡失调所致,如细菌性阴道炎，霉菌性阴道炎，滴虫性阴道炎等。目前治疗阴道感染的措施主要是运用抗生素、灭滴灵、雌激素以及酸化阴道的制剂等来杀灭阴道内的病原微生物。但是，上述疗法在某种程度上会抑制正常的菌群,引起致病菌或条件致病菌的过度繁殖,从而造成反复感染或多重感染,增加治疗的的难度和成本。药物使用时间过长就会产生耐药性，对肝肾功能有一定的副作用，对患者危害较大。而使用中药或中成药治疗时间长，治疗效果不甚理想。目前，调节生殖道菌群，如果使用益生菌，一般是通过内用栓剂，口服品种较少，使用不方便。技术实现要素：技术问题：为了解决现有技术的缺陷，本发明提供了一种用于治疗妇科炎症的益生菌组合物。技术方案：本发明提供的一种用于治疗妇科炎症的组合物，包括以下重量份的组份：抗性糊精30-40份，菊粉40-60粉，水苏糖2-8份，鼠李糖乳杆菌tr08(0.1-10)×1012cfu，罗伊氏乳杆菌tr02(0.1-10)×1012cfu。作为改进，包括以下重量份的组份：抗性糊精35份，菊粉50粉，水苏糖5份，鼠李糖乳杆菌tr081012cfu，罗伊氏乳杆菌tr021012cfu。本发明还提供了上述用于治疗妇科炎症的组合物的制备方法，分别称取抗性糊精、菊粉、水苏糖，混匀；再加入鼠李糖乳杆菌tr08、罗伊氏乳杆菌tr02，混匀，即得。本发明还提供了上述组合物在制备治疗妇科炎症药物中的应用。本发明还提供了上述组合物和抗生素在在制备治疗妇科炎症联合用药物中的应用。所述应用，所述抗生素包括克拉霉素、阿莫西林、阿奇霉素、青霉素、头孢呋辛，四环素、甲硝唑中的一种或几种。有益效果：本发明提供的组合物制备工艺简单、原料来源广泛、成本低廉、使用方便，治疗妇科炎症效果好。附图说明图1为罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)tr02的菌落图。图2为罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)tr02的菌落放大图。图3为鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)tr08的菌落图。图4为鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)tr08的菌落放大图。图5为实施例的多样性指数图。图6为实施例的益生菌组血清样本中的lgg、iga、igm浓度图。图7为与甲硝唑(metronidazole)联合治疗细菌性阴道炎组的随机双盲对照试验结果图。具体实施方式水苏糖购自山东西王集团菊粉购自山东百龙创园生物科技股份有限公司抗性糊精购自山东百龙创园生物科技股份有限公司罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)tr02，其分类命名为罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)tr02，在中国典型培养物保藏中心(简称cctcc)保藏，保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学，邮政编码为430072，其保藏编号为：cctccno.2016546，保藏日期为2016年10月10日。菌株的分离1、菌种和培养基和培养条件(1)菌源来自中国某军区健康士兵粪便。(2)培养基平板培养基：1000ml蒸馏水，蛋白胨10g，葡萄糖20g，酵母粉9g，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三铵2g，半胱氨酸0.5g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温1ml，琼脂粉15-20g，ph5.5-6.5。2、菌株的分离和鉴定(1)菌株的分离预先经灭菌处理后的手套箱中取适量新鲜粪便置于盛装有无菌培养基的无菌试管中，充分震荡涡旋混匀；以上述充分震荡涡旋混匀的粪便溶液为原液，做十倍梯度稀释至合适梯度，取100μl均匀涂布于mrs+0.05％半胱氨酸固体平板培养基上，随后取出置于厌氧罐中，37℃厌氧培养过夜。次日可见平板上长有形态大小各异的菌落，结合罗伊氏乳杆菌典型菌落形态特征，挑取若干有代表性的菌落作二代划线纯化处理，平板厌氧活化1天，得培养物，随后做菌株鉴定。(2)菌株的鉴定革兰氏染色形态学鉴定：a、涂片：取灭过菌的载玻片于实验台上，在玻片上用记号笔做记号，便于观察，随后将玻片倒置，然后用移液器吸取10μl无菌生理盐水均匀涂布在记号处，继而用移液枪挑取纯培养物均匀溶于生理盐水中，涂布面不宜过大。b、干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。c、固定：固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰处尽快的来回通过2-3次，共约2-3秒种，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜(不超过60℃)，放置待冷后，进行染色。d、初染：在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。e、水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。f、媒染：用100-1000ul移液枪吸取约300ul碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆盖涂片，染色约1min。g、水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。h、脱色：斜置载玻片，滴加95％乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，大约需时20-30s，随即水洗。i、复染：在涂片薄膜上滴加沙黄染液1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。j、水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。k、干燥、观察：用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后滴一滴浸油在玻片上，用油镜观察细菌的形态及颜色，紫色的是革兰氏阳性菌，红色的是革兰氏阴性菌。结果显示：该菌株为革兰氏阳性菌。16srrna序列的测定：16srrna基因的pcr扩增使用的引物是一般细菌的引物——8f(5′-cacggatccagagtttgat(c/t)(a/c)tggctcag-3′)和1510r(5′-gtgaagcttaggg(c/t)taccttgttacgactt-3′)产物委托有资质的第三方实验室进行sanger测序。应用blast算法在genbank数据库中把序列和16srrna基因进行比较，应用mega4.0程序建立邻接树。blast分析(如seqidno.1所示)表明tr02菌十分接近罗伊氏乳杆菌(99％亲缘性)。鼠李糖乳杆菌(l.rhamnosus)tr08，其分类命名为鼠李糖氏乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)tr08，在中国典型培养物保藏中心(简称cctcc)保藏，保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学，邮政编码为430072，其保藏编号为：cctccno.m2016548，保藏日期为2016年10月10日。菌株的分离1、菌种和培养基和培养条件(1)菌源来自中国某军区健康士兵粪便(2)培养基平板培养基：1000ml蒸馏水，蛋白胨10g，葡萄糖20g，酵母粉9g，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三铵2g，半胱氨酸0.5g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温1ml，琼脂粉15-20g，ph5.5-6.5。2、菌株的分离和鉴定(1)菌株的分离预先经灭菌处理后的手套箱中取适量新鲜粪便置于盛装有无菌培养基的无菌试管中，充分震荡涡旋混匀；以上述充分震荡涡旋混匀的粪便溶液为原液，做十倍梯度稀释至合适梯度，取100μl均匀涂布于mrs+0.05％半胱氨酸固体平板培养基上，随后取出置于厌氧罐中，37℃厌氧培养过夜。次日可见平板上长有形态大小各异的菌落，结合乳杆菌典型菌落形态特征，挑取若干有代表性的菌落作二代划线纯化处理，平板厌氧活化1天，得培养物，随后做菌株鉴定。(2)菌株的鉴定革兰氏染色形态学鉴定：a、涂片：取灭过菌的载玻片于实验台上，在玻片上用记号笔做记号，便于观察，随后将玻片倒置，然后用移液器吸取10μl无菌生理盐水均匀涂布在记号处，继而用移液枪挑取纯培养物均匀溶于生理盐水中，涂布面不宜过大。b、干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。c、固定：固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰处尽快的来回通过2-3次，共约2-3秒种，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜(不超过60℃)，放置待冷后，进行染色。d、初染：在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。e、水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。f、媒染：用100-1000ul移液枪吸取约300ul碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆盖涂片，染色约1min。g、水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。h、脱色：斜置载玻片，滴加95％乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，大约需时20-30s，随即水洗。i、复染：在涂片薄膜上滴加沙黄染液1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。j、水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。k、干燥、观察：用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后滴一滴浸油在玻片上，用油镜观察细菌的形态及颜色，紫色的是革兰氏阳性菌，红色的是革兰氏阴性菌。结果显示：该菌株为革兰氏阳性菌。16srrna序列的测定：16srrna基因的pcr扩增使用的引物是一般细菌的引物——8f(5′-cacggatccagagtttgat(c/t)(a/c)tggctcag-3′)和1510r(5′-gtgaagcttaggg(c/t)taccttgttacgactt-3′)产物委托有资质的第三方实验室进行sanger测序。应用blast算法在genbank数据库中把序列和16srrna基因进行比较，应用mega4.0程序建立邻接树。blast分析(如seqidno.2所示)表明tr02菌十分接近鼠李糖乳杆菌(99％亲缘性)。实施例1用于治疗妇科炎症的组合物，包括以下重量份的组份：抗性糊精30份，菊粉60粉，水苏糖2份，鼠李糖乳杆菌tr080.1×1012cfu，罗伊氏乳杆菌tr0210×1012cfu。实施例2用于治疗妇科炎症的组合物，包括以下重量份的组份：抗性糊精40份，菊粉40粉，水苏糖8份，鼠李糖乳杆菌tr0810×1012cfu，罗伊氏乳杆菌tr020.1×1012cfu。实施例3用于治疗妇科炎症的组合物，包括以下重量份的组份：抗性糊精35份，菊粉50粉，水苏糖5份，鼠李糖乳杆菌tr081×1012cfu，罗伊氏乳杆菌tr021×1012cfu。检测实施例1至3的组合物的营养成分，见表1。表1实施例1至3的组合物用于治疗妇科炎症。实验一：治疗细菌性阴道炎和霉菌性阴道炎。将待测试人群分为若干组：健康组(healthy)：bv组(细菌性阴道炎组)：安慰剂组1(placebo)：采用安慰剂治疗28天；益生菌组1(probiotic)：采用本发明实施例3的组合物治疗28天；vvc组(霉菌性阴道炎组)：安慰剂组2(placebo)：采用安慰剂治疗28天；益生菌组2(probiotic)：采用本发明实施例3的组合物治疗28天。结果显示：(1)测试各组的多样性指数，见图5；bv组使用安慰剂治疗基本无效，而采用实施例3的组合物治疗多样性大大降低，疗效很好；vvc组使用安慰剂和实施例3的组合物均有效。(3)测试益生菌组血清样本中的lgg、iga、igm浓度(g/l)，见图6；个体口服益生菌28天内，血清中lgg、igm浓度均比不食用浓度低，iga均比不食用益生菌偏高。实验二：辅助抗生素治疗霉菌性阴道炎。将待测试人群分为若干组：抗生素益生菌联合治疗组：接受克拉霉素(或阿莫西林、阿奇霉素、青霉素、头孢呋辛、四环素)治疗10d；同时接受实施例3的组合物治疗21d；抗生素安慰剂联合治疗组：接受克拉霉素(或阿莫西林、阿奇霉素、青霉素、头孢呋辛、四环素)治疗10d；同时接受安慰剂治疗21d；第0天、第30天取阴道拭子nugent评分，结果见表2。表2结果显示：实施例3的组合物可显著改善抗生素所致vmb菌群紊乱，预防vvc/bv(p<0.05)。实验三：与甲硝唑(metronidazole)联合治疗细菌性阴道炎组的随机双盲对照试验。细菌性阴道炎(bv)妇女分为两组：lacto组：49人使用甲硝唑和实施例3的组合物联合治疗；placebo组：57人使用安慰剂和甲硝唑联合治疗。用nugent评分和唾液酸酶法，评估bv治疗后续30天bv复发率的跟踪。结果，见图7，显示：甲硝唑联合益生菌治疗，显著降低bv复发率(p<0.001)。实验四：实施例1至3的组合物用于治疗细菌性阴道炎对照组1：口服甲硝唑片，每日3次，连用10天。对照组2：口服对照药物2，每日3次，连用10天；其中，对照药物2为包括以下重量份的组份的组合物：抗性糊精35份，菊粉50粉，水苏糖5份，鼠李糖乳杆菌tr082×1012cfu；对照组3：口服对照药物3，每日3次，连用10天；其中，对照药物3为包括以下重量份的组份的组合物：抗性糊精35份，菊粉50粉，水苏糖5份，罗伊氏乳杆菌tr022×1012cfu；治疗组1：口服本发明实施例1的组合物，每日3次，连用10天。治疗组2：口服本发明实施例1的组合物，每日3次，连用10天。治疗组3：口服本发明实施例1的组合物，每日3次，连用10天。疗效判断标准：治疗对象均在治疗1疗程后2周及下次月经干净后复查阴道分泌物。痊愈：bv诊断标准中4项均阴性，临床症状消失。显效：bv诊断标准中仅1项阳性，临床症状消失。有效：bv诊断标准中仅2项阳性，临床症状明显改善。无效：bv诊断标准中3项阳性，临床症状无改善。治疗结果：见表3。表3总疗效比较注：治疗组疗效优于对照组。两组复发率比较：表4组别对照组1对照组2对照组3治疗组1治疗组2治疗组3复发率％6/819/788/800/951/950/95sequencelisting<110>天益健康科学研究院（镇江）有限公司<120>一种鼠李糖乳杆菌及其应用<130>sc20161008002<160>2<170>patentinversion3.3<210>1<211>1490<212>dna<213>lactobacillusreuteri<220><221>misc_feature<222>(1)..(1490)<400>1gggtacgcggcggtgtgctatacatgcaagtcgtacgcactggcccaactgattgatggt60gcttgcacctgattgacgatggattaccagtgagtggcggacgggtgagtaacacgtagg120taacctgccccggagcgggggataacatttggaaacagatgctaataccgcataacaaca180aaagccacatggcttttgtttgaaagatggctttggctatcactctgggatggacctgcg240gtgcattagctagttggtaaggtaacggcttaccaaggcgatgatgcatagccgagttga300gagactgatcggccacaatggaactgagacacggtccatactcctacgggaggcagcagt360agggaatcttccacaatgggcgcaagcctgatggagcaacaccgcgtgagtgaagaaggg420tttcggctcgtaaagctctgttgttggagaagaacgtgcgtgagagtaactgttcacgca480gtgacggtatccaaccagaaagtcacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgt540aggtggcaagcgttatccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggttgcttaggt600ctgatgtgaaagccttcggcttaaccgaagaagtgcatcggaaaccgggcgacttgagtg660cagaagaggacagtggaactccatgtgtagcggtggaatgcgtagatatatggaagaaca720ccagtggcgaaggcggctgtctggtctgcaactgacgctgaggctcgaaagcatgggtag780cgaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgatgagtgctaggtgttggag840ggtttccgcccttcagtgccggagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacgacc900gcaaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggttt960aattcgaagctacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcttgcgctaaccttagagat1020aaggcgttcccttcggggacgcaatgacaggtggtgcatggtcgtcgtcagctcgtgtcg1080tgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgttactagttgccagcattaa1140gttgggcactctagtgagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggacgacgtcaga1200tcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacggtacaacgagtcg1260caagctcgcgagagtaagctaatctcttaaagccgttctcagttcggactgtaggctgca1320actcgcctacacgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatac1380gttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtttgtaacgcccaaagtcg1440gtggcctaacctttatggagggagccgcctaaggcggacagagactgggt1490<210>2<211>1474<212>dna<213>lactobacillusrhamnosus<220><221>misc_feature<222>(1)..(1474)<400>1cgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgaacgagttctgattattgaaaggtgcttg60catcttgatttaattttgaacgaatggcggaagggtgaataacccgtgggtaacctggcc120ttaaatgggggataacctttggaaaccgaagctaataccgcataaatcccaaaaccgcat180ggttcttggctgaaagatggggtaaactatcccttttggatggacccccggcgtattaac240ttgttggtgaggtaacggctccaccagggaatgatacctaacccaactgaaaggttgatc300ggccaccttgggactgagacccggcccaaactcctaccggagggagcaatagggaatctt360ccccaatggacgccagtctgaaggaacaaccccccgtgggtgaaaaagggtttccggtcc420taaaactctgttgttggaaaaaaatggtccgcaaaataactggtggccgcgtggccgtat480ccaacccgaaagccacggctaactacctgcccagcaccgcggtaataccgaggtggcaag540cgttatccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaagcgggttttttagtctgatgggaa600agccctcggcttaaccgaagaagtgcatcggaaactgggaaacttgaatgcagaagaaga660cagtggaactccatgtgtagcggtgaaatgcctagatatatggaagaacaccagtggcga720aagccgctgtctggtctgtaactgacgctgaagctccaaagcctgggtagcgaacaggat780tagataccctgggagtccatgccgtaacgatgaatgctagtggtggaaggtttccgccct840tcaatgccgagcttacgcaataagcaatccgcctgggggaatacgaccggcaggttgaaa900cttcaaagaatttgaccggggccgcacaagccggtggagcattgtggtttaattcgaagc960acgcgaagaacttaccaggtcttgacatcttttgatcacttgaagatcaagtttcccttc1020gggcaaatgacagtggtgcatggttgtcgtcagctccgtgtcgtgagatgttgggttaag1080tcccgcaacgagcgcaacccttatgactagttgccagcatttagttgggcactctagtaa1140gactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatg1200acctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaacgagttgcgagaccgcgaggtcaa1260gctaatctcttaaagccattctcagttcggactgtaggctgcaactcgcctacacgaagt1320cggaatcgctagtaatcgcggatcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtac1380acaccgcccgtcacaccatgagagtttgtaacacccgaagccggtggcgtaaccctttta1440gggagcgagccgtctaaggtggacaaatgatact1474当前第1页12