本发明涉及医药技术领域，具体地涉及一种抑制剂在制备治疗囊型包虫病药物方面的用途。
背景技术：
细粒棘球绦虫(e.granulosus,e.g)和多房棘球绦虫(e.multilocularis,e.m)两种寄生虫感染所致囊型包虫病(cystisechinococcosis,ce)和泡型包虫病(alveolarechinococcosis,ae)。我国包虫病的高发区主要流行于高山草甸地区及气候寒冷、干旱少雨的牧区及半农半牧区，以新疆、西藏、甘肃、宁夏等地区较为严重，而新疆是包虫病高发地区之一。
犬、狐常以鼠类为食，而鼠类又易食入被狐等动物粪便虫卵污染的植被，使其生活史得以完成。狐等吞食带有泡球蚴的鼠类或动物脏器后，约经45天原头蚴发育为成虫，并有孕节、虫卵随粪便排出，人由于误食虫卵受染。随着现在社会的发展，人口流动也随之增加，宠物犬和狐狸数量增多，包虫病地区逐渐蔓延，将会严重影响人类健康。大多数(>90％)的包虫病都是由细粒棘球绦虫幼虫感染引起的囊型包虫病，根据who-iwge提到囊型包虫病的治疗和管理有四种方法：手术、药物化疗、微创式和观察。
目前包虫病的治疗仍以外科手术为首选，药物治疗能够提高手术治愈率和降低复发率的临床效果也不断得到了肯定。化疗药物治疗包虫病的首选药物为苯并咪唑类药物，代表药物有：甲苯咪唑和阿苯达唑，这两种药物是唯一被批准上市的苯并咪唑类药物，这类药物是针对寄生虫的β微管蛋白，但寄生虫的β微管蛋白与人类的β微管蛋白高度相似，在一些研究中显示服用阿苯达唑可能对肝脏的分泌排泄功能及合成功能造成轻度的影响，并且对肝脏造成轻度的损伤，阿苯达唑乳剂在212例和116例临床疗效显示临床疗效超过当前包虫病药物的最好水平，且疗效可靠稳定，但仍然各种不良反应致使临床疗效欠佳。
因此开发新靶点的化学药物是刻不容缓的。因此，对于防治包虫病而积极寻找新药物及其作用靶点和非手术治疗方法的意义重大。近年来，治疗包虫病药物的研发从不同角度切入，主要从发现新药等方面进行研究。
目前研究证实,细胞内广泛存在许多去泛素化酶(deubiquiti2natingenzymes,dubs),主要分为以泛素羧基末端水解酶家族和泛素特异性加工酶家族为主的5种类型。这些不同类型的去泛素化酶均能水解底物蛋白上的泛素链之间的链接,起到去泛素化的作用,对蛋白降解进行反向调节,从而影响蛋白质的功能。如去泛素化酶可以影响或调节细胞的生长发育、信号转导和神经病变或肿瘤等许多细胞生理和病理过程。然而具有抗肿瘤药效的dub抑制剂(如degrasyn)尚未见报道其可应用于治疗囊型包虫病。
egfr(epidermalgrowthfactorreceptor)是上皮生长因子(egf)细胞增殖和信号传导的受体。egfr属于erbb受体家族的一种，该家族包括egfr(erbb-1)、her2/c-neu(erbb-2)、her3(erbb-3)和her4(erbb-4)。egfr也被称作her1、erbb1，突变或过表达一般会引发肿瘤。egfr是一种糖蛋白，属于酪氨酸激酶型受体，细胞膜贯通，分子量170kda。egfr位于细胞膜表面，靠与配体结合来激活，包括egf和tgfα(transforminggrowthfactorα)。研究表明在许多实体肿瘤中存在egfr的高表达或异常表达，从而达到治疗肿瘤的作用，但egfr在包虫病的研究尚未开展。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种抑制剂(如去泛素化酶抑制剂degrasyn和/或egfr抑制剂tyrphostin9)在制备治疗囊型包虫病药物方面的用途。
本发明的第一方面，提供了一种抑制剂的用途，用于制备治疗囊型包虫病的药物；
并且所述抑制剂为选自下组的抑制剂：去泛素化酶抑制剂、egfr抑制剂、或其组合。
在另一优选例中，所述去泛素化酶抑制剂为式a所示化合物、或其异构体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐，
其中，吡啶环上的br任选地被选自下组的卤素取代：f、cl、i，吡啶环上的h任选地被选自下组的卤素取代：f、cl、br、i，吡啶环上的卤素取代基的个数为1-4个(如1、2、3、4个)。
在另一优选例中，所述去泛素化酶抑制剂为
在另一优选例中，所述egfr抑制剂为选自下组的化合物、或其酯、或其异构体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐，
在另一优选例中，所述囊型包虫病为细粒棘球绦虫感染所致的疾病。
在另一优选例中，所述细粒棘球绦虫选自下组：细粒棘球绦虫幼虫、细粒棘球绦虫胚性细胞、细粒棘球绦虫生发层、或其组合。
在另一优选例中，所述细粒棘球绦虫幼虫为细粒棘球绦虫原头蚴。
本发明的第二方面，提供了一种用于治疗囊型包虫病的制剂，所述制剂包含：
1)作为第一药物活性成分的式a所示化合物、或其异构体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐，
其中，吡啶环上的br任选地被选自下组的卤素取代：f、cl、i，吡啶环上的h任选地被选自下组的卤素取代：f、cl、br、i，吡啶环上的卤素取代基的个数为1-4个(如1、2、3、4个)；和/或
2)作为第二药物活性成分的选自下组的化合物、或其酯、或其异构体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐，
3)任选的第三药物活性成分，所述第三药物活性成分不同于所述第一药物活性成分和所述第二药物活性成分，且用于治疗囊型包虫病；和
4)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述第三药物活性成分选自下组：单抗、脂质体、微乳、微乳液、或其组合。
在另一优选例中，所述制剂的剂型选自下组：片剂、颗粒剂、胶囊、口服液、注射剂。
本发明的第三方面，提供了一种体外杀灭细粒棘球绦虫的方法，将第一组分和/或第二组分与细粒棘球绦虫接触，从而杀灭细粒棘球绦虫；
其中，所述第一组分为式a所示化合物、或其异构体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐，
其中，吡啶环上的br任选地被选自下组的卤素取代：f、cl、i，吡啶环上的h任选地被选自下组的卤素取代：f、cl、br、i，吡啶环上的卤素取代基的个数为1-4个(如1、2、3、4个)；
所述第二组分为选自下组的化合物、或其酯、或其异构体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐，
在另一优选例中，所述细粒棘球绦虫自下组：细粒棘球绦虫幼虫、细粒棘球绦虫胚性细胞、细粒棘球绦虫生发层、或其组合。
在另一优选例中，所述细粒棘球绦虫幼虫为细粒棘球绦虫原头蚴。
在另一优选例中，所述方法是体外非治疗性的方法。
本发明的第四方面，提供了一种治疗囊型包虫病的方法，所述方法包括步骤：对所需患者施用治疗有效量的第一组分和/或第二组分；其中，所述第一组分为式a所示化合物、或其异构体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐，
其中，吡啶环上的br任选地被选自下组的卤素取代：f、cl、i，吡啶环上的h任选地被选自下组的卤素取代：f、cl、br、i，吡啶环上的卤素取代基的个数为1-4个(如1、2、3、4个)；
所述第二组分为选自下组的化合物、或其酯、或其异构体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐，
在另一优选例中，所述“所需患者”包括人和非人哺乳动物(如小鼠、大鼠)。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
本发明人经过长期而深入的研究，意外地发现去泛素化酶抑制剂(如degrasyn)和/或egfr抑制剂(如tyrphostin9)具有优异的杀灭细粒棘球绦虫的活性，因此可用于制备治疗囊型包虫病的药物，为囊型包虫病的治疗提供了一种新的选择。在此基础上，发明人完成了本发明。
去泛素化酶抑制剂
去泛素化是指由去泛素化酶介导的一种蛋白质泛素化的负向调节过程，对细胞内环境自稳态的维持、蛋白的稳定或降解以及细胞内的信号转导通路起着极其重要的作用。人类肿瘤中，去泛素化酶抑制剂，通过干预其活性，抑制肿瘤的生长，并成为开发新型抗肿瘤药物的热点。
本发明提供了一种去泛素化酶抑制剂在制备治疗囊型包虫病的药物方面的用途，所述去泛素化酶抑制剂为式a所示化合物、或其异构体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐，
其中，吡啶环上的br任选地被选自下组的卤素取代：f、cl、i，吡啶环上的h任选地被选自下组的卤素取代：f、cl、br、i，吡啶环上的卤素取代基的个数为1-4个(如1、2、3、4个)。
一种典型的去泛素化酶抑制剂是degrasyn，其结构式为
egfr抑制剂
本发明提供了一种egfr抑制剂在制备治疗囊型包虫病的药物方面的用途，所述egfr抑制剂为选自下组的化合物、或其酯、或其异构体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐，
在本发明中，五种化合物afatinib(bib2992)、ag-490(tyrphostinb42)、pelitinib(ekb-569)、ag-1478(tyrphostinag-1478)、cnx-2006均为egfr抑制剂，在对原头蚴的初次杀伤实验，24小时后，原头蚴死亡率均达到95％以上。
一种典型的egfr抑制剂为tyrphostin9，其结构式为
囊型包虫病
包虫病又称棘球蚴病，是一种人畜共患的寄生虫病,其中囊型包虫病呈世界性分布，是通过误食虫卵，而传播中间宿主包括人、有蹄类动物、鼠类等，从而感染包虫病。全身多个脏器均可发生，其中以肝、肺多见。早期可无任何临床症状，肺包虫病的临床症状为感染早期一般无明显症状，囊肿长大压迫肺组织与支气管，患者可出现胸痛、咳嗽、血痰、气急，甚至呼吸困难。临床表现为阵发性呛咳，呼吸困难。可伴有过敏反应，甚至休克。若大血管破裂，可出现大咯血。囊型包虫病潜伏期约1至30年，病程根据棘球蝴囊占位所在的器官不同而长短不一。一般认为治疗以手术为主，药物作为重要的辅助手段也越来越被重视。
与现有技术相比，本发明具有以下主要优点：
(1)本发明提供了一种去泛素化酶抑制剂(如degrasyn)和/或egfr抑制剂(如tyrphostin9)在制备治疗囊型包虫病药物方面的用途，为囊型包虫病的治疗提供了一种新的选择；
(2)包含所述去泛素化酶抑制剂(如degrasyn)和/或egfr抑制剂(如tyrphostin9)的制剂可有效杀灭会导致囊型包虫病的寄生虫(如细粒棘球绦虫)的原头蚴。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1药物筛选的药效学实验
1.实验内容
1.1细粒棘球绦虫原头蚴体外杀伤
采集原头蚴：从乌鲁木齐屠宰场采购患有肝包虫绵羊的羊肝，带回到实验室。先用水将附着在羊肝表面的血清洗干净，再用剪刀尽可能除去羊肝表面的脂肪组织。用75％的酒精擦拭羊肝表面，用50ml注射器将包囊中囊液吸取出来，置于50ml离心管中，再用眼科剪沿包囊和肝脏组织衔接处剪一个约2cm的可视窗。用镊子小心的将包囊的内囊剥离出来，放到装有生理盐水的平皿中。收集从囊液中自然沉降和内囊壁上洗涤下来的原头蚴，用纱布除去沉淀中的宿主组织，按照体积1:10的原头蚴和1％的胃蛋白酶(ph2.0)，在37℃恒温水浴锅中消化30min，肉眼观察原头蚴呈现出细沙状，倒至显微镜下观察无小微囊，即为消化完全。
用生理盐水洗涤消化好的原头蚴，一般用原头蚴沉淀10倍体积的生理盐水洗涤10次。配置含有20％胎牛血清的1640培养基(所用胎牛血清、1640培养基、青链霉素等试剂均购自hyclon公司)，用配置好的培养基稀释原头蚴，终浓度为250个/ml。用200ul排枪把混匀的原头蚴加到圆底的96孔板中，在镜下观察每个孔原头蚴数量是否均匀，如果有个别多或者少需要进行调整。
abz组作为阳性对照药物(阿苯达唑购自美国sigma公司)，设置3个重复孔。dmso作为阴性对照药物，同样设置3个重复孔。把378种不同的小分子药物加到对应的孔中，药物加完后，要立即将药物混匀，以免出现药物包裹原头蚴而使原头蚴立即死亡的情况。
观察2小时、4小时、6小时、12小时、24小时的存活状况，并拍照记录。24小时后，用0.01％的亚甲基蓝染料，染色1min后，洗涤原头蚴至背景透明，拍照记录。
观察结束后，统计原头蚴的死亡数，并计算出原头蚴的死亡率。得到死亡率大于阳性对照组的药物，用低浓度的药物重复操作上述步骤一次。
1.2药物ld50(即半数致死量)计算
在96孔板中将筛选出的药物用dmso作连续10倍的稀释，从高浓度到低浓度的药物加到对应的孔中，每个孔用8孔排枪加入100μl培养基，使药物在培养基中充分混匀。原头蚴用培养基稀释到500个/ml，摇匀后用排枪在每孔中加入100μl的培养基，使每孔原头蚴的数量在50个左右。在37℃5％co2恒温培养箱中培养24小时，用亚甲基蓝染色，记录观察原头蚴生存状况。
统计每个浓度下的原头蚴的死亡率，结果的计算按reed-muench两氏法。
24小时后染色1min，观察拍照统计,可知，浓度10μm时，给药degrasyn组原头蚴死亡率几乎达到100％，死亡率远远高于阿苯达唑组。当浓度调至5μm时，degrasyn组死亡率约为95％，杀伤效果仍然较阿苯达唑组效果好。浓度低至1μm时，阿苯达唑组杀伤效果仍然不如degrasyn组。
随后测定degrasyn杀伤原头蚴的ld50，染色观察后，得到degrasyn对细粒棘球绦虫原头蚴的ld50为2.5μm，实验得到degrasyn杀伤细粒棘球绦虫原头蚴的体外效果比阿苯达唑要好。
此外，观察统计还得到，药物浓度为10μm，tyrphostin9组死亡率远远大于阿苯达唑组。浓度为5μm，tyrphostin9组原头蚴死亡率约95％，比阿苯达唑死亡率高。最终将浓度调到1μm，tyrphostin91μm组死亡率仍然高于阿苯达唑组原头蚴死亡率。
tyrphostin杀伤原头蚴ld50计算得到，tyrphostin9药物对细粒棘球绦虫原头蚴的ld50低至2μm，说明tyrphostin9对细粒棘球绦虫原头蚴具有一定的杀伤作用，且tyrphostin9体外杀伤效果比阿苯达唑好。
实施例2包囊的体外杀伤(degrasyn)
将原头蚴直接注射给鼠类中间动物的腹腔、肝门静脉或肝脏实质，或将体外培养原头蚴转变后的包囊注射给鼠类中间动物。解剖小鼠，取出包囊。将无菌且完整的包囊分配到6孔板中，加入不同浓度degrasyn。一周内动态观察包囊是否破裂、塌陷及生发层脱落等，确定药物的体外疗效。
取直径范围在5mm～9mm的包囊，实验得到浓度在20ug/ml，阿苯达唑组包囊死亡率是0％，而degrasyn的死亡率高达60％。包囊的体外实验说明degrasyn的体外杀伤包囊较阿苯达唑效果好。
实施例3包囊的体外杀伤(tyrphostin9)
将原头蚴直接注射给鼠类中间动物的腹腔、肝门静脉或肝脏实质，或将体外培养原头蚴转变后的包囊注射给鼠类中间动物。解剖小鼠，取出包囊。无菌并完整的包囊(直径范围5mm～10mm)分配到6孔板中，加入不同浓度tyrphostin9。一周内动态观察包囊是否破裂、塌陷及生发层脱落等，确定药物的体外疗效。
实验观察得到，药物浓度为20ug/ml时，tyrphostin9组的包囊死亡率为60％，而阿苯达唑组仅为0％。说明tyrphostin9比阿苯达唑体外杀伤包囊的效果好。
实施例4小鼠体内实验(degrasyn和/或tyrphostin9)
将原头蚴直接注射给鼠类中间动物的腹腔、肝门静脉或肝脏实质，或将体外培养原头蚴转变后的包囊注射给鼠类中间动物。在接种后1-10月后，将不同浓度的药物(degrasyn和/或tyrphostin9)经口服或注射给这些实验动物，给动物服药1-50周后，解剖实验动物，通过包囊数量的减少、包囊大小或包囊结构的变化，确定药物的疗效。
综上所述，本发明首次公开了dub抑制剂(如degrasyn)和/或egfr抑制剂(如tyrphostin9)作为制备治疗囊型包虫病药物的研究。
通过体内外实验数据可知，degrasyn对原头蚴有体外杀伤作用，且degrasyn对原头蚴的杀伤效果优于阿苯达唑对原头蚴的杀伤效果，对包囊也有明显的杀伤作用，说明dub抑制剂degrasyn对囊型包虫病具有治疗效果，即说明dub抑制剂能够作为囊型包虫病的新型的抗包虫病药物，从而为囊型包虫病的治疗提供了新途径。
此外，上述结果也表明：degrasyn对细粒棘球绦虫原头蚴在低浓度短时内即具有显著杀伤作用，为囊型包虫病的治疗提供了一种新的途径。
此外，通过体外实验数据可知：tyrphostin9对原头蚴有体外杀伤作用，说明egfr抑制剂对囊型包虫病具有治疗效果，即说明egfr抑制剂能够作为囊型包虫病的新型的抗包虫病药物，从而为囊型包虫病的治疗提供新途径。
此外，上述结果也表明：tyrphostin9对细粒棘球绦虫原头蚴在低浓度短时内具有显著的杀伤作用，为囊型包虫病的治疗提供了一种新的途径。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。