本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种三氯取代的ii型卤化聚酮类化合物的应用，尤其涉及一种三氯取代卤化ii型聚酮类化合物zunyimycinc的应用。
背景技术：
链霉菌来源的天然产物往往具有很好的生物活性和成药潜力，是抗生素的重要来源。但随抗生素的滥用，许多“超级细菌”的出现，给临床上病原菌感染等疾病的治疗带来巨大的挑战，有些超级细菌出现了无药可医的现象。鉴于当前日益严峻的抗菌形势，加大抗生素研发力度，探索和研发新抗生素成为当务之急，也是解决抗生素耐药问题有效途径。
链霉菌来源的卤化天然产物具有结构新颖、活性良好等特点。如：具有抗白血病活性的氯化聚酮neocarzillina；对小鼠肿瘤细胞具有抑制作用的be－19412a及其甲基化产物；对人体不同肿瘤细胞具有抑制作用的聚酮chinikomycinsa；对多耐药结核分枝杆菌有杀菌作用的chlorophenazine。此外临床上抗感染的万古霉素，替考拉宁以及2014年美国fda批准上市的抗耐药菌感染抗生素新药达巴万星，奥利万星及泰地唑胺，它们都属于卤化天然产物。
本申请人前期从贵州特殊生境梵净山土壤中分离鉴定一株命名为streptomycessp.fjs31-2菌株(菌株保藏号：cgmcc4.7321)，并通过次级代谢产物研究，分离鉴定得到新型氯化聚酮系列的化合物zunyimycina、zunyimycinb、zunyimycinc，如中国专利cn106167495a公开的一种卤化ii型聚酮类抗生素化合物、制备方法及其应用，该卤化ii型聚酮类抗生素化合物即为化合物zunyimycinc，
但是由于制备方法的缺陷，获得的产量较小，得率也低，同时因为此产量很少(每个化合物大约7mg左右)，所以只做了耐药金黄色葡萄球菌活性，为了进一步获得其他抗菌活性，申请人对制备方法进行了研究，最终获得高生物量的制备方法，并对其他抗菌活性进行了研究。
技术实现要素：
本发明意在提供一种三氯取代的ii型卤化聚酮类化合物其他抗菌活性的研究。
三氯取代的ii型卤化聚酮类化合物的应用，所述三氯取代的ii型卤化聚酮类化合物的结构式为：
该化合物用于抗革兰氏阳性菌、抗革兰氏阴性菌或者抗真菌活性。
该三氯取代的ii型卤化聚酮类化合物的制备方法，包括以下步骤：步骤一、菌株的活化：从-80℃冰箱中取出保存的分类名为：链霉菌streptomycessp.fjs31-2菌株，菌株的保藏编号为cgmccno.4.7321，保藏日期为2016年6月2日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，活化时：以无菌接种环挖取菌株的孢子，十字划线接种于基础培养基的平板上，28℃下静置培养3d，挑取单菌落传代至第三代后放大培养；
步骤二、发酵产物的发酵培养：选用改良gyd固体培养基发酵培养，培养基中加入琼脂粉，28℃，静置培养17d，菌体连同培养基捣碎，加入乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，减压浓缩，得到发酵产物；
步骤三、发酵产物纯化分离：a、发酵产物用丙酮溶剂溶解后，与硅胶粉混合后采用氯仿-丙酮按照纯氯仿；30:1；15:1；10:1；5:1；2:1；纯丙酮，依次7个梯度洗脱收集洗脱剂，洗脱剂旋转蒸发减压回收后，用展开剂展开，合并365nm荧光显黄绿色、8％硫酸乙醇显黄色、迁移值(rf)在0.5的点，合并后称量得到f5；
b、f5采用正相硅胶柱色谱分离，丙酮溶剂溶解f5组分后，与硅胶粉混合采用石油醚-丙酮按照6:1；4:1；2:1依次3个梯度洗脱，收集洗脱溶剂，洗脱溶剂旋转蒸发减压回收后，用展开剂展开，合并365nm荧光显黄绿色、8％硫酸乙醇显黄色、迁移值(rf)在0.5的点，合并后称量得到f5-3；
c、f5-3用丙酮溶解后，采用薄层层析方法，将365nm荧光下显黄绿色荧光的硅胶粉刮下来，将刮下来的硅胶粉磨均匀，装入分离柱，采用丙酮洗脱，回收丙酮溶剂，得到zunyimycinc化合物。
其中，改良gyd培养基配方：葡萄糖4g/l，麦芽抽提物4g/l，酵母粉4g/l，碳酸钙2g/l，微量元素预混液0.5ml，10g/l无水乙醇浸泡24h的腐殖酸b，加入去离子水定容至1000ml，121℃高压灭菌30min。
微量元素预混液：znso4·7h2o2g、feso4·7h2o2g、mncl2·4h2o2g、cuso4·5h2o2g、na2b4o4·10h2o2g和(nh4)6mo7·4h2o2g，用双蒸水定容至1l配制而成。
进一步，所述革兰氏阳性菌为表皮葡萄球菌或者枯草芽孢杆菌。
进一步，所述革兰氏阴性菌为变形杆菌、布氏杆菌活性或者产生超广谱β-内酰胺酶的大肠杆菌。
进一步，所述真菌为白色念珠菌。
本发明的优点：
1)该化合物zunyimycinc为链霉菌生物碱，来源于streptomycessp.fjs31-2菌株次级代谢产物，该菌株是从贵州特殊生无环境梵净山分离得到。目前该菌株除了保藏在本实验室外，还保藏在中国普通菌种保藏中心(保藏号：cgmcc4.7321)。通过活化培养即可得到化合物zunyimycinc，因此采用原料特殊、容易获取且对环境没有任何污染，也不会造成资源不可逆破坏。
2)化合物zunyimycinc具有较好的抗菌活性，试验研究发现该化合物具有广谱抗菌活性、抗革兰氏阳性菌、抗革兰氏阴性菌或者抗真菌活性。该化合物的制备分离鉴定，为抗生素的研发提供化合物来源，也为其他有生物活性化合物的合成提供先导物。
附图说明
图1为zunyimycinc分离流程图；
图2为zunyimycinc抗表皮葡萄球菌活性图；
图3为zunyimycinc抗变形杆菌活性图；
图4为zunyimycinc抗布氏杆菌活性图；
图5为zunyimycinc抗白色念珠菌活性图；
图6为zunyimycinc抗枯草芽孢杆菌活性图；
图7为zunyimycinc抗mrsa活性图；
图8为zunyimycinc抗esbl活性图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：
1、链霉菌streptomycessp.fjs31-2菌株的活化
从-80℃冰箱中取出甘油斜面保存的菌种，以无菌接种环挖取1环菌株streptomycessp.fjs31-2的孢子，十字划线接种于直径11cm的基础培养基平板，28℃静置培养3d，挑取单菌落传代至第三代可放大培养。
2、发酵产物的发酵培养
链霉菌streptomycessp.fjs31-2菌株选用改良gyd固体培养基发酵培养，在规格500ml三角烧瓶装150ml发酵培养基，每瓶按琼脂粉质量与发酵培养基体积的1.8％加入琼脂粉。每瓶接种量为培养平板上面积1×1cm2的活化菌种量，28℃，静置培养至17d，菌体连同培养基捣碎，加入乙酸乙酯萃取两次，每次在130rpm振荡萃取24h，合并萃取液，40℃减压浓缩，得到发酵产物。重复以上操作，共计发酵培养100l合并发酵产物得38g。
改良gyd培养基配方：葡萄糖4g/l，麦芽抽提物4g/l，酵母粉4g/l，碳酸钙2g/l，微量元素预混液0.5ml，10g/l无水乙醇浸泡24h的腐殖酸b，加入去离子水定容至1000ml，121℃高压灭菌30min。
微量元素预混液：znso4·7h2o2g、feso4·7h2o2g、mncl2·4h2o2g、cuso4·5h2o2g、na2b4o4·10h2o2g和(nh4)6mo7·4h2o2g，用双蒸水定容至1l配制而成。
3、发酵产物纯化分离
(1)用丙酮溶剂的溶解32g的发酵产物，与硅胶按质量比约1:1.5(即32g发酵产物中加100-200目硅胶粉48g)混合均匀，待溶剂挥发后得到河沙状样品，该样品作为上柱的样品；称取100～200目硅胶粉1200g与氯仿溶剂混合均匀(在此过程中不能产生气泡)装入长为975mm，内径为120mm分离柱中，让硅胶粉缓缓下沉直至不再下沉时加入上柱样品，采用氯仿-丙酮[纯氯仿；30:1；15:1；10:1；5:1；2:1；丙酮]，依次7个梯度洗脱，每个梯度洗脱3-4个(大约每个柱体积洗脱7.2l-9.6l洗脱溶剂)柱体积，每1000ml洗脱溶剂为一份进行收集，共收集80份，每份经旋转蒸发仪减压回收后，加入10ml丙酮溶解后移到规格为20ml西林瓶中，薄层层析(tcl)点板，用石油醚：丙酮＝2:1、氯仿：丙酮＝5:1或氯仿：甲醇＝10：1展开剂展开，在常规紫外可见光分析仪下观察是否具254nm或365nm荧光，再用8％硫酸乙醇显色的颜色剂显色；合并365nm荧光显黄绿色，8％硫酸乙醇显黄色，迁移值(rf)在0.5的点，合并后称量得到f53.124g。
(2)f53.124g进一步纯化分离，采用正相硅胶柱色谱分离。丙酮溶剂的溶解3.124g的组分，与硅胶按质量比约1:1.5(即3.124g发酵产物中加100-200目硅胶粉4.7g)混合均匀，待溶剂挥发后得到河沙状样品，该样品作为上柱的样品；称取100-200目硅胶粉140g与石油醚：丙酮＝6:1(在此过程中不能产生气泡)装入长为975mm，内径为50mm分离柱中，让硅胶粉缓缓下沉直至不再下沉时加入上柱样品，采用石油醚-丙酮[6:1；4:1；2:1]，依次3个梯度洗脱，每个梯度洗脱4-5个(大约每个柱体积洗脱1l-1.2l洗脱溶剂)柱体积，每100ml洗脱溶剂为一份进行收集，共收集40份，每份经旋转蒸发仪减压回收后，加入10ml丙酮溶解后移到规格为20ml西林瓶中，薄层层析(tcl)点板，用石油醚：丙酮＝2:1、氯仿：丙酮＝5:1或氯仿：甲醇＝10：1展开剂展开，在常规紫外可见光分析仪下观察是否具254nm或365nm荧光，再用8％硫酸乙醇显色的颜色剂显色；合并365nm荧光显黄绿色，8％硫酸乙醇显黄色，迁移值(rf)在0.5的点，合并后称量得到f5-391mg。
(3)f5-391mg组分，用丙酮溶解后，采用薄层层析(tcl)方法，点(板的规格：20cm×20cm)薄层层析板，板的载样量45mg/块，配制氯仿：丙酮：甲酸＝6:1:1滴140ml展开剂，将展开剂倒入展开缸，将薄层层析板放入展开缸中，待溶剂距板边缘大约0.5cm处，将板取出，溶剂挥干，放在365nm荧光下观察，将rf值为0.25，365nm荧光下显黄绿色荧光的硅胶粉刮下来，将刮下来硅胶粉磨均匀，装入分离柱，采用丙酮洗脱，回收丙酮溶机，得到zunyimycinc化合物14mg。
4、zunyimycinc抗菌活性应用
(1)测试菌株：金黄色葡萄球菌(mrsa)、枯草芽孢杆菌、布氏杆菌、表皮葡萄球菌、变形杆菌、产生超广谱β-内酰胺酶的大肠杆菌(esbl)、白色念珠菌。
(2)培养基：mh(a)培养基，称取mh(a)培养基36.5g与1l蒸馏水混匀，121℃高温高压灭菌15min。在超净台里将培养基倒入平皿，每个培养皿约20ml。将培养皿放在30℃烘箱内培养24h，观察是否有菌生长，无菌方可使用。
(3)菌株活化：从-80℃冰箱中取出甘油斜面保存的测试菌株，以无菌接种环挖取1环各种测试菌株，十字划线接种于直径11cm的mh(a)培养基平板，37℃静置培养1d，挑取单菌落传代至第三代。
(4)化合物zunyimycinc溶液的制作：称取zunyimycinc3mg溶解到1ml的dmso溶液中，使其溶液清澈无浑浊。
(4)采用琼脂扩散法测量抗菌活性：第一、用蒸馏水配制浓度为10-6或10-7测试菌的悬浮液；第二，倒悬浮液于mh(a)培养基中，使其表面涂层均匀；第三、在涂有测试菌的mh(a)培养基上打出直径8mm的小孔若干，小孔内分别接种100ul的zunyimycinc的溶液和对照；第四、将培养皿放入37℃孵育恒温箱培养24h后取出测量其抑菌圈直径。
应用举例
采用琼脂扩散法测定zunyimycinc的抗菌活性测试，以金黄色葡萄球菌(mrsa)、枯草芽孢杆菌、布氏杆菌、表面葡萄球菌、变形杆菌、产超广谱β-内酰胺酶的大肠杆菌(esbl)、白色念珠菌为测试菌，dmso为阴性对照。结果表明：zunyimycinc对金黄色葡萄球菌(mrsa)、枯草芽孢杆菌、布氏杆菌、表面葡萄球菌、变形杆菌、产超广谱β-内酰胺酶的大肠杆菌(esbl)、白色念珠菌等都具有较好的抑制作用，其抑菌圈都大于15mm，结果详见表1和图2～图8。
表1：zunyimycinc抗菌活性检测结果
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述，所属领域普通技术人员知晓申请日或者优先权日之前发明所属技术领域所有的普通技术知识，能够获知该领域中所有的现有技术，并且具有应用该日期之前常规实验手段的能力，所属领域普通技术人员可以在本申请给出的启示下，结合自身能力完善并实施本方案，一些典型的公知结构或者公知方法不应当成为所属领域普通技术人员实施本申请的障碍。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。