包含抗PD-L1和抗CTLA-4抗体的共配制品的组合物的制作方法

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背景技术

癌症仍然是主要的全球健康负担。尽管在癌症的治疗方面有所进展，但一直存在对更有效且毒性更小的疗法的未满足的医疗需要，尤其对于患有对现有治疗剂有抗性的晚期疾病或癌症的那些患者。

免疫系统，特别是t细胞介导的细胞毒性，在肿瘤控制中的作用是公认的。有越来越多的证据表明t细胞在癌症患者中控制肿瘤生长和存活，无论是在该疾病的早期和晚期阶段。然而，肿瘤特异性t细胞应答很难在癌症患者中上升和维持。

迄今为止收到显著关注的两个t细胞通路通过细胞毒性t淋巴细胞相关的抗原-4(ctla-4，cd152)和程序性细胞死亡配体-1(pd-l1，也被称为b7-h1或cd274)发信号。

ctla-4在活化的t细胞上表达，并随着cd28介导的t细胞活化作为共抑制剂以抑制t细胞应答。ctla-4被认为在tcr接合之后调节初试和记忆性t细胞的早期活化幅度，并且是影响抗肿瘤免疫和自身免疫两者的中央抑制途径的一部分。ctla-4仅在t细胞上表达，并且其配体cd80(b7.1)和cd86(b7.2)的表达主要限于抗原呈递细胞、t细胞、和其他免疫介导的细胞。据报道阻断ctla-4信号通路的拮抗性抗ctla-4抗体增强t细胞活化。一个这样的抗体易普利姆玛在2011年被fda批准用于转移性黑色素瘤的治疗。另一个抗ctla-4抗体曲美木单抗，在iii期试验中测试了对于晚期黑色素瘤的治疗，但相比当时的标准治疗(替莫唑胺或达卡巴嗪)没有显著增加患者的总体存活。

pd-l1也是涉及控制t细胞活化的受体和配体的复杂系统的一部分。在正常组织中，pd-l1在t细胞、b细胞、树突状细胞、巨噬细胞、间充质干细胞、骨髓源性肥大细胞以及不同非造血细胞上表达。它的正常功能是通过与它的两个受体程序性细胞死亡-1(又称为pd-1或cd279)和cd80(又称为b7.1或b7-1)的相互作用来调节t细胞活化与耐受之间的平衡。pd-l1还通过肿瘤来表达并且在多个部位上起作用以帮助肿瘤避开由宿主免疫系统进行的检测和消除。pd-l1在宽范围的癌症中高频率地表达。在一些癌症中，pd-l1的表达与存活降低和不利预后相关联。阻断pd-l1与它的受体之间的相互作用的抗体能够在体外解除pd-l1依赖性免疫抑制效应并且增强抗肿瘤t细胞的细胞毒性活性。杜伐鲁单抗(durvalumab)(medi4736)是针对人类pd-l1的能够阻断pd-l1与pd-1和cd80受体两者的结合的人类单克隆抗体。

尽管在医学治疗上有所进展，但改进癌症患者的生存率难度依然很大。组合免疫疗法有可能是有效的。然而，目前的组合疗法方法涉及单独给予个别药物。能够在单一配制品中给予多种治疗性蛋白质是有用和所希望的，例如以促进递送。然而，药物稳定性、药物纯度、药物相容性、有效剂量浓度(例如，以实现药效学和/或药代动力学参数；以避免副作用或药物毒性)、和/或相容的药学上可接受的赋形剂代表了多种药物配制品的重要考虑。因此，紧急需要多种药物产品配制品及其制备方法。

技术实现要素：

本发明提供了一种稳健的共配制品设计空间，其中两种单克隆抗体(mab)以不同的蛋白质浓度比率配制。将抗pd-l1抗体(例如，杜伐鲁单抗)和抗ctla-4抗体(例如，曲美木单抗)配制成个别地稳定的配制品并混合以实现以各种抗pd-l1与抗ctla-4浓度比率的新液体和冻干共配制品的设计空间。

在一个方面，本发明提供含有抗pd-l1抗体(例如，杜伐鲁单抗)或其抗原结合片段和抗ctla-4抗体(例如，曲美木单抗)或其抗原结合片段的组合物，其中抗pd-l1或其抗原结合片段的浓度为约18.7mg/ml至约44.4mg/ml，以及抗ctla-4抗体或其抗原结合片段的浓度为约2.2mg/ml至约12.5mg/ml。

在另一个方面，本发明提供含有杜伐鲁单抗或其抗原结合片段和曲美木单抗或其抗原结合片段的组合物，其中杜伐鲁单抗或其抗原结合片段的浓度为约18.7mg/ml至约44.4mg/ml，并且其中曲美木单抗或其抗原结合片段的浓度为约2.2mg/ml至约12.5mg/ml。

在另一个方面，本发明提供一种组合物，在约5.8的ph下，其含有约18.7mg/ml杜伐鲁单抗或其抗体片段、约12.5mg/ml曲美木单抗或其抗体片段、约22mm组氨酸/组氨酸-hcl、约254mm海藻糖脱水物、约0.17mmedta、和约0.02％w/vps80或由其组成。

在另一个方面，本发明提供一种组合物，在约5.8的ph下，其含有约28.6mg/ml杜伐鲁单抗或其抗体片段、约8.6mg/ml曲美木单抗或其抗体片段、约23mm组氨酸/组氨酸-hcl、约252mm海藻糖脱水物、约0.12mmedta、和约0.02％w/vps80或由其组成。

在另一个方面，本发明提供一种组合物，在约6.0的ph下，其含有约36.3mg/ml杜伐鲁单抗或其抗体片段、约5.5mg/ml曲美木单抗或其抗体片段、约24mm组氨酸/组氨酸-hcl、约260mm海藻糖脱水物、约0.07mmedta、和约0.02％w/vps80或由其组成。

在另一个方面，本发明提供一种组合物，在约6.0的ph下，其含有约40.0mg/ml杜伐鲁单抗或其抗体片段、约4.0mg/ml曲美木单抗或其抗体片段、约25mm组氨酸/组氨酸-hcl、约264mm海藻糖脱水物、约0.05mmedta、和约0.02％w/vps80或由其组成。

在另一个方面，本发明提供一种组合物，在约6.0的ph下，其含有约42.8mg/ml杜伐鲁单抗或其抗体片段、约2.9mg/ml曲美木单抗或其抗体片段、约25mm组氨酸/组氨酸-hcl、约267mm海藻糖脱水物、约0.04mmedta、和约0.02％w/vps80或由其组成。

在另一个方面，本发明提供一种组合物，在约6.0的ph下，其含有约44.4mg/ml杜伐鲁单抗或其抗体片段、约2.2mg/ml曲美木单抗或其抗体片段、约25mm组氨酸/组氨酸-hcl、约269mm海藻糖脱水物、约0.03mmedta、和约0.02％w/vps80或由其组成。

在另一个方面，本发明提供一种组合物，在约6.0的ph下，其含有约44.4mg/ml杜伐鲁单抗或其抗体片段、约2.2mg/ml曲美木单抗或其抗体片段、约25mm组氨酸/组氨酸-hcl、约269mm海藻糖脱水物、约0.03mmedta、和约0.02％w/vps80或由其组成。

在另一个方面，本发明提供了制备根据本文描绘的任何方面的组合物的方法，该方法涉及混合抗pd-l1抗体(例如，杜伐鲁单抗)或其抗原结合片段和抗ctla-4抗体(例如，曲美木单抗)或其抗原结合片段，以获得约18.7mg/ml至约44.4mg/ml的抗pd-l1抗体或其抗原结合片段的浓度，和约2.2mg/ml至约12.5mg/ml的抗ctla-4抗体或其抗原结合片段的浓度。

在另一个方面，本发明提供了一种治疗方法，该方法涉及给予受试者(例如，患者)根据本文描绘的任何方面的组合物。

在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒包括根据本文描绘的任何方面的组合物，以及用于本文描绘的任何方面的方法(例如，用于治疗实体瘤、癌症、肺癌、或非小细胞肺癌(nsclc))的说明书。

在本文描绘的任何方面的各种实施例中，抗pd-l1抗体或其抗原结合片段的浓度为约18.7mg/ml、28.6mg/ml、36.3mg/ml、40.0mg/ml、42.8mg/ml、或44.4mg/ml。在本文描绘的任何方面的各种实施例中，抗ctla-4抗体或其抗原结合片段的浓度为约2.2mg/ml、2.9mg/ml、4.0mg/ml、5.5mg/ml、8.6mg/ml、或12.5mg/ml。

在本文描绘的任何方面的各种实施例中，抗pd-l1或其抗原结合片段与抗ctla-4抗体或其抗原结合片段的组合浓度为约31.2mg/ml至约46.6mg/ml。在某些实施例中，抗pd-l1或其抗原结合片段与抗ctla-4抗体或其抗原结合片段的组合浓度为约31.2mg/ml、37.1mg/ml、41.8mg/ml、44.0mg/ml、45.7mg/ml、或46.6mg/ml。

在本文描绘的任何方面的各种实施例中，抗pd-l1抗体或其抗原结合片段与抗ctla-4抗体或其抗原结合片段的浓度比率为约15∶10至约20∶1。在某些实施例中，抗pd-l1抗体或其抗原结合片段与抗ctla-4抗体或其抗原结合片段的浓度比率为约15∶10、10∶3、20∶3、10∶1、15∶1、或20∶1。

在本文描绘的任何方面的各种实施例中，该抗pd-l1抗体是杜伐鲁单抗。在本文描绘的任何方面的各种实施例中，该抗ctla-4抗体是曲美木单抗。在本文描绘的任何方面的各种实施例中，该抗pd-l1抗体是杜伐鲁单抗并且该抗ctla-4抗体是曲美木单抗。

在本文描绘的任何方面的各种实施例中，杜伐鲁单抗或其抗原结合片段的浓度为约18.7mg/ml、28.6mg/ml、36.3mg/ml、40.0mg/ml、42.8mg/ml、或44.4mg/ml。在本文描绘的任何方面的各种实施例中，曲美木单抗或其抗原结合片段的浓度为约2.2mg/ml、2.9mg/ml、4.0mg/ml、5.5mg/ml、8.6mg/ml、或12.5mg/ml。

在本文描绘的任何方面的各种实施例中，杜伐鲁单抗或其抗原结合片段与曲美木单抗或其抗原结合片段的组合浓度为约31.2mg/ml至约46.6mg/ml。在某些实施例中，杜伐鲁单抗或其抗原结合片段与曲美木单抗或其抗原结合片段的组合浓度为约31.2mg/ml、37.1mg/ml、41.8mg/ml、44.0mg/ml、45.7mg/ml、或46.6mg/ml。

在本文描绘的任何方面的各种实施例中，杜伐鲁单抗与曲美木单抗的浓度比率为从约15∶10至约20∶1。在某些实施例中，该浓度比率为约15∶10、10∶3、20∶3、10∶1、15∶1、或20∶1。

在本文描绘的任何方面的各种实施例中，该组合物含有组氨酸、组氨酸-hcl或其组合。在各种实施例中，组氨酸、组氨酸-hcl、或其组合的浓度为从约20mm至约25mm。

在本文描绘的任何方面的各种实施例中，该组合物含有海藻糖二水合物。在某些实施例中，该海藻糖二水合物的浓度为从约254mm至约269mm。

在本文描绘的任何方面的各种实施例中，该组合物含有依地酸二钠二水合物(edta二钠盐二水合物)。在某些实施例中，edta的浓度为从约0.03mm至约0.27mm。

在本文描绘的任何方面的各种实施例中，该组合物含有聚山梨醇酯80(ps80)。在某些实施例中，聚山梨醇酯80的浓度为约0.02重量/体积百分比(％w/v)。

在本文描绘的任何方面的各种实施例中，该组合物具有约6.0的ph。

在本文描绘的任何方面的各种实施例中，该组合物被配制用于静脉内注射。在本文描绘的任何方面的各种实施例中，该受试者患有实体瘤、癌症、肺癌、或非小细胞肺癌(nsclc)中的一种或多种。在本文描绘的任何方面的各种实施例中，该组合物通过静脉内注射给予。

定义

除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。下面的参考文献为技术人员提供了本发明所用的多个术语的通用定义：singleton等人，dictionaryofmicrobiologyandmolecularbiology[微生物学和分子生物学词典](第2版，1994)；thecambridgedictionaryofscienceandtechnology[剑桥科技词典](walker编著，1988)；theglossaryofgenetics[遗传学词汇]，第5版，r.rieger等人(编著)，斯普林格出版社(springerverlag)(1991)；以及hale和marham，theharpercollinsdictionaryofbiology[哈珀科林斯生物学词典](1991)。除非另外指明，否则如在此所使用的以下术语具有以下赋予它们的含意。

应当指出，术语“一个/种(a或an)”实体是指一个/种或多个/种该实体；例如，“抗体”应理解为代表一种或多种抗体。因此，术语“一个/种(a或an)”、“一个/种或多个/种”和“至少一个/种”在本文中可互换地使用。

如在本披露中使用的术语“抗体”是指免疫球蛋白或其片段或衍生物，并且涵盖包含抗原结合位点的任何多肽，无论它是在体外或在体内生产的。该术语包括但不限于：多克隆、单克隆、单特异性、多特异性、非特异性、人源化、单链、嵌合、合成、重组、杂合、突变、以及接合抗体。除非用术语“完整”另外修饰，如在“完整抗体”中，出于本披露的目的，术语“抗体”还包括抗体片段例如fab、f(ab′)2、fv、scfv、fd、dab以及保留抗原结合功能的其他抗体片段。典型地，这类片段将包含抗原结合结构域。

术语“抗原结合结构域”、“抗原结合片段”和“结合片段”是指包含负责抗体和抗原之间特异性结合的氨基酸的抗体分子的一部分。在抗原很大的情况下，抗原结合结构域可以仅结合到该抗原的一部分。负责与抗原结合结构域特异性相互作用的抗原分子的一部分被称为“表位”或“抗原决定簇”。抗原结合结构域典型地包括抗体轻链可变区(vl)和抗体重链可变区(vh)，然而，它不一定必须包括两者。例如，所谓的fd抗体片段仅由vh结构域组成，但是仍然保留完整抗体的一定抗原结合功能。

抗体的结合片段通过重组dna技术或通过完整抗体的酶促或化学裂解来产生。结合片段包括fab、fab′、f(ab′)2、fv以及单链抗体。除了“双特异性”或“双功能”抗体以外，抗体应理解为其每个结合位点是相同的。使用酶(木瓜蛋白酶)来消化抗体的结果是两个相同的抗原结合片段，又称为“fab”片段和“fc”片段，它们不具有抗原结合活性，但具有结晶的能力。用酶(胃蛋白酶)来消化抗体的结果是f(ab′)2片段，其中该抗体分子的两个臂保持连接并且包括两个抗原结合位点。f(ab′)2片段具有交联抗原的能力。当在此使用时，“fv”是指保留了抗原识别和抗原结合位点的抗体的最小片段。当在此使用时，“fab”是指包括轻链的恒定结构域和重链的chi结构域的抗体的片段。

术语“mab”是指单克隆抗体。本发明的抗体包括但不限于全天然抗体、双特异性抗体；嵌合抗体；fab、fab′、单链v区片段(scfv)、融合多肽以及非常规抗体。

在本披露中，“包含(comprises、comprising)”、“含有(containing)”和“具有(having)”等可以具有美国专利法赋予他们的意义并且可以意味着“包括(includes、including)”等；“基本上由......组成(consistingessentiallyof或consistsessentially)”同样具有美国专利法赋予的意义并且该术语是开放性的，允许超出所叙述的存在，只要所叙述的基本或新特征不被超过叙述的存在改变，但是排除现有技术实施例。

“检测”是指鉴定待检测的分析物的存在、不存在或量。在一个实施例中，分析物是蛋白质，并且检测方法测量该蛋白质的物理化学性质。

“有效量”是指足以导致患者的症状改善或实现所希望的生物学结果的药剂的剂量或量。在一个实施例中，有效量用于治疗非小细胞肺癌(nsclc)。

“参比”意指比较的标准。在一个实施例中，本文所用的参比是指未与另一种蛋白质共配制的蛋白质的物理化学性质。

在此所提供的范围被理解成对在该范围内的所有值的简写。例如，一个1到50的范围应当理解为包括来自下组的任何数字、数字的组合或子范围，该组由以下组成：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。

除非明确声明或从上下文显而易见，如在此所使用的，术语“或”被理解为包括在内。除非明确声明或从上下文显而易见，如在此所使用的，术语“一种(a)”、“一个(an)”和“该(the)”被理解为单数的或复数的。

除非确切规定或从上下文显而易见，否则如在此所使用的术语“约(about)”被理解为在本领域的正常公差范围内，例如，在平均数的2个标准偏差之内。约可以被理解为在声明值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、或0.01％之内。除非从上下文显而易见，在此提供的所有数值被该术语约修饰。

在此变量的任何定义中对化学基团清单的叙述包括将该变量定义为任何单个基团或所列基团的组合。对在此变量或方面的实施例的叙述包括作为任何单个实施例或与任何其他实施例或其部分结合的实施例。

可以将在此提供的任何组合物或方法与在此提供的任何其他组合物和方法中的一种或多种进行组合。

附图说明

图1是一幅图，该图描绘了在5℃，与单独的杜伐鲁单抗或单独的曲美木单抗相比，如通过高效尺寸排阻色谱法(hpsec)以各种浓度比率评估的共配制的杜伐鲁单抗/曲美木单抗的纯度。

图2是一幅图，该图描绘了在25℃，与单独的杜伐鲁单抗或单独的曲美木单抗相比，如通过hpsec以各种浓度比率评估的共配制的杜伐鲁单抗/曲美木单抗的纯度。

图3是一幅图，该图描绘了在40℃，与单独的杜伐鲁单抗或单独的曲美木单抗相比，如通过hpsec以各种浓度比率评估的共配制的杜伐鲁单抗/曲美木单抗的纯度。

图4是一幅图，该图描绘了在5℃，与单独的冻干的杜伐鲁单抗相比，如通过高效尺寸排阻色谱法(hpsec)以各种浓度比率评估的共配制的冻干的杜伐鲁单抗/曲美木单抗的纯度。

图5是一幅图，该图描绘了在40℃，与单独的冻干的杜伐鲁单抗相比，如通过高效尺寸排阻色谱法(hpsec)以各种浓度比率评估的共配制的冻干的杜伐鲁单抗/曲美木单抗的纯度。

图6是一幅条形图，该图描绘了在5℃，通过流动显微镜(microflowimager^tm；proteinsimple公司，安大略，加拿大)与单独的杜伐鲁单抗相比，以不同浓度比率的共配制的杜伐鲁单抗/曲美木单抗的≥2μm亚可见粒子形成。

图7是一幅条形图，该图描绘了在5℃，通过流动显微镜(microflowimager^tm)与单独的杜伐鲁单抗相比，以不同浓度比率的共配制的杜伐鲁单抗/曲美木单抗的≥10μm亚可见粒子形成。

图8是一幅条形图，该图描绘了在5℃，通过流动显微镜(microflowimager^tm)与单独的杜伐鲁单抗相比，以不同浓度比率的共配制的杜伐鲁单抗/曲美木单抗的≥25μm亚可见粒子形成。

图9是一幅条形图，该图描绘了在5℃，通过流动显微镜(microflowimager^tm；proteinsimple公司，安大略，加拿大)与单独的杜伐鲁单抗相比，以10∶3或20∶1的浓度比率重组之后的共配制的冻干的杜伐鲁单抗/曲美木单抗的≥2μm亚可见粒子形成。

图10是一幅条形图，该图描绘了在5℃，通过流动显微镜(microflowimager^tm；proteinsimple公司，安大略，加拿大)与单独的杜伐鲁单抗相比，以10∶3或20∶1的浓度比率重组之后的共配制的冻干的杜伐鲁单抗/曲美木单抗的≥10μm亚可见粒子形成。

图11是一幅条形图，该图描绘了在5℃，通过流动显微镜(microflowimager^tm；proteinsimple公司，安大略，加拿大)与单独的杜伐鲁单抗相比，以10∶3或20∶1的浓度比率重组之后的共配制的冻干的杜伐鲁单抗/曲美木单抗的≥25μm亚可见粒子形成。

图12是一幅图，该图描绘了在5℃，与单独的杜伐鲁单抗或单独的曲美木单抗相比，以共配制的20∶1比率的杜伐鲁单抗或曲美木单抗的效力。

图13是一幅图，该图描绘了在25℃，与单独的杜伐鲁单抗或单独的曲美木单抗相比，以共配制的20∶1比率的杜伐鲁单抗或曲美木单抗的效力。

图14是一幅图，该图描绘了在40℃，与单独的杜伐鲁单抗或单独的曲美木单抗相比，以共配制的20∶1比率的杜伐鲁单抗或曲美木单抗的效力。

图15是一幅图，该图描绘了在5℃，与单独的杜伐鲁单抗或单独的曲美木单抗相比，如通过还原凝胶电泳评估的以20∶1比率共配制的杜伐鲁单抗/曲美木单抗的主峰纯度。

图16是一幅图，该图描绘了在25℃，与单独的杜伐鲁单抗或单独的曲美木单抗相比，如通过还原凝胶电泳评估的以20∶1比率共配制的杜伐鲁单抗/曲美木单抗的主峰纯度。

图17是一幅图，该图描绘了在40℃，与单独的杜伐鲁单抗或单独的曲美木单抗相比，如通过还原凝胶电泳评估的以20∶1比率共配制的杜伐鲁单抗/曲美木单抗的主峰纯度。

图18是一幅图，该图描绘了在5℃，与单独的杜伐鲁单抗或单独的曲美木单抗相比，如通过非还原凝胶电泳评估的以20∶1比率的共配制的杜伐鲁单抗/曲美木单抗的主峰纯度。

图19是一幅图，该图描绘了在25℃，与单独的杜伐鲁单抗或单独的曲美木单抗相比，如通过非还原凝胶电泳评估的以20∶1比率的共配制的杜伐鲁单抗/曲美木单抗的主峰纯度。

图20是一幅图，该图描绘了在40℃，与单独的杜伐鲁单抗或单独的曲美木单抗相比，如通过非还原凝胶电泳评估的以20∶1比率共配制的杜伐鲁单抗/曲美木单抗的主峰纯度。

图21是一幅图，该图描绘了在5℃，当在edta存在下掺有各种水平的铁离子时，如通过高效尺寸排阻色谱法法(hpsec)评估的曲美木单抗(以20∶1配制)的纯度。

图22是一幅图，该图描绘了在25℃，当在edta存在下掺有各种水平的铁离子时，如通过高效尺寸排阻色谱法法(hpsec)评估的曲美木单抗(以20∶1配制)的纯度。

图23是一幅图，该图描绘了在40℃，当在edta存在下掺有各种水平的铁离子时，如通过高效尺寸排阻色谱法法(hpsec)评估的曲美木单抗(以20∶1配制)的纯度。

图24是一幅图，该图描绘了在5℃，当在edta不存在下掺有各种水平的铁离子时，如通过高效尺寸排阻色谱法法(hpsec)评估的曲美木单抗(以20∶1配制)的纯度。

图25是一幅图，该图描绘了在25℃，当在edta不存在下掺有各种水平的铁离子时，如通过高效尺寸排阻色谱法法(hpsec)评估的曲美木单抗(以20∶1配制)的纯度。

图26是一幅图，该图描绘了在40℃，当在edta不存在下掺有各种水平的铁离子时，如通过高效尺寸排阻色谱法法(hpsec)评估的曲美木单抗(以20∶1配制)的纯度。

图27是一幅图，该图描绘了在5℃，当在edta存在下掺有各种水平的铁离子时，如通过毛细管等电聚焦(cief)评估的曲美木单抗(以20∶1配制)的酸性峰百分比。

图28是一幅图，该图描绘了在25℃，当在edta存在下掺有各种水平的铁离子时，如通过毛细管等电聚焦(cief)评估的曲美木单抗(以20∶1配制)的酸性峰百分比。

图29是一幅图，该图描绘了在40℃，当在edta存在下掺有各种水平的铁离子时，如通过毛细管等电聚焦(cief)评估的曲美木单抗(以20∶1配制)的酸性峰百分比。

图30是一幅图，该图描绘了在5℃，当在edta存在下掺有各种水平的铁离子时，如通过非还原型毛细管凝胶电泳(cge)评估的曲美木单抗(以20∶1配制)的片段百分比。

图31是一幅图，该图描绘了在25℃，当在edta存在下掺有各种水平的铁离子时，如通过非还原型毛细管凝胶电泳(cge)评估的曲美木单抗(以20∶1配制)的片段百分比。

具体实施方式

本发明的特征在于包含至少两种抗体(例如抗pd-l1和抗ctla-4抗体)的共配制品的组合物以及制备和使用这类共配制品的方法。特别是，这类共配制品可用于肠胃外(例如，静脉内)药物给予。

本发明至少部分基于稳健的共配制品设计空间的发现，其中两种单克隆抗体(例如，抗pd-l1和抗ctla-4抗体)以不同的蛋白质浓度比率配制。如下文详细报道的，进行了一项研究以找到具有不同蛋白浓度的抗pd-l1抗体杜伐鲁单抗和抗ctla-4抗体曲美木单抗的相容且稳定的共配制品。

将抗pd-l1和抗ctla-4抗体配制成个别地稳定的配制品。在混合时，最终的共配制品基于两种抗体之间的靶向最终蛋白质浓度比率而变化。将以不同蛋白质浓度比率共配制的抗体的稳定性特性与相应的个体抗体的稳定性特性相比。出人意料并有利地，发现共配制品的抗体是稳定的，不会干扰这些抗体的质量属性，并且与共配制品的赋形剂相容。因此，用以不同蛋白质浓度比率的抗pd-l1抗体杜伐鲁单抗和抗ctla-4抗体曲美木单抗衍生新液体共配制品的设计空间。在本发明中建立的稳定共配制品包括抗pd-l1(杜伐鲁单抗)与抗ctla-4(曲美木单抗)浓度比率为10∶1、15∶1、15∶10、20∶1、以及20∶3。因此，证明了这两种抗体的共配制品是稳健的，并且这两种抗体的稳定性保持在测试的蛋白质浓度比率范围内。

抗体共配制品组合物

本发明的特征在于包含抗pd-l1和抗ctla-4抗体或其抗体片段的共配制品组合物。在某些实施例中，抗pd-l1抗体杜伐鲁单抗和抗ctla-4抗体曲美木单抗是共配制的。杜伐鲁单抗(medi4736)是一种选择性、高亲和力的人类igg1单克隆抗体(mab)，其可阻断pd-l1与pd-1和cd80的结合。在正在进行的1/2期研究中，杜伐鲁单抗单一疗法对晚期nsclc患者产生了持久的应答，具有可管理的耐受性特性。与杜伐鲁单抗相关的披露内容可以在美国专利号8,779,108和9,493,565中找到。曲美木单抗(cp-675,206)是ctla-4的选择性人类igg2mab抑制剂，其通过ctla-4抑制促进t细胞活性，但似乎不直接耗竭调节性t细胞。与曲美木单抗相关的披露内容可以在美国专利号6,682,736中找到。杜伐鲁单抗和曲美木单抗的组合基于强大的临床前数据，表明这两种途径是非冗余的，这表明靶向两者可能具有加和效应或协同效应。对于本文详述的配制品，应注意该组合物或配制品中的抗体或抗体片段保留所希望的生物活性和/或保留所希望的物理化学特征。在各种实施例中，本披露的配制品包含水或一种或多种合适的溶剂。在各种实施例中，水是蒸馏的。在某些实施例中，这些配制品包括一种或多种另外的组分，例如赋形剂。在优选的实施例中，本披露的抗体配制品是无菌和/或无热原的，例如适合于注射入受试者。用于制备药物组合物的方法是本领域已知的，并且例如，由remington′spharmaceuticalsciences[雷明顿氏药物科学](麦克出版公司)第16版(1980)描述，将其通过引用结合在此。

本文详述了该配制品的这些组分中的每一种的浓度和/或比例。应当理解，本披露考虑了包含本文所列的组分的特定浓度的任何组合的配制品。另外，对于可任选地包含其他赋形剂的配制品，应理解，该说明考虑包含这些特征的任何组合的配制品。

在各种实施例中，该组合物或共配制品含有浓度为约18.7mg/ml至约44.4mg/ml的抗pd-l1抗体(例如，杜伐鲁单抗)或其抗体片段和浓度为约2.2mg/ml至约12.5mg/ml的抗ctla-4抗体(曲美木单抗)或其抗体片段。在其他实施例中，该组合物或共配制品含有浓度为约18.0mg/ml至约45mg/ml的抗pd-l1抗体(例如，杜伐鲁单抗)或其抗体片段和浓度为约2.0mg/ml至约15.0mg/ml的抗ctla-4抗体(曲美木单抗)或其抗体片段。在某些实施例中，该组合物或共配制品含有浓度为约18.7mg/ml、36.3mg/ml、40.0mg/ml、42.8mg/ml、或44.4mg/ml的抗pd-l1抗体(例如，杜伐鲁单抗)或其抗体片段。在其他实施例中，抗pd-l1抗体(例如，杜伐鲁单抗)或其抗体片段的浓度为约18.0mg/ml、27.0mg/ml、36.0mg/ml、或45.0mg/ml。在其他实施例中，抗pd-l1抗体(例如，杜伐鲁单抗)或其抗体片段的浓度为约20.0mg/ml、25.0mg/ml、30.0mg/ml、35.0mg/ml、40.0mg/ml、或45.0mg/ml。在某些实施例中，该组合物或共配制品含有浓度为约2.2mg/ml、2.9mg/ml、4.0mg/ml、5.5mg/ml、或12.5mg/ml的抗ctla-4抗体(例如，曲美木单抗)或其抗体片段。在其他实施例中，抗ctla-4抗体(例如，曲美木单抗)或其抗体片段的浓度为约2.0mg/ml、3.0mg/ml、4.0mg/ml、5.0mg/ml、6.0mg/ml、7.0mg/ml、8.0mg/ml、9.0mg/ml、10.0mg/ml、11.0mg/ml、12.0mg/ml、13.0mg/ml、14.0mg/ml、或15.0mg/ml。

在具体的实施例中，该组合物或共配制品含有约18.7mg/ml的抗pd-l1抗体(例如，杜伐鲁单抗)或其抗体片段，和约12.5mg/ml的抗ctla-4抗体(曲美木单抗)或其抗体片段；约36.3mg/ml的抗pd-l1抗体(例如，杜伐鲁单抗)或其抗体片段，和约5.5mg/ml的抗ctla-4抗体(曲美木单抗)或其抗体片段；约40.0mg/ml的抗pd-l1抗体(例如，杜伐鲁单抗)或其抗体片段，和约4.0mg/ml的抗ctla-4抗体(曲美木单抗)或其抗体片段；约42.8mg/ml的抗pd-l1抗体(例如，杜伐鲁单抗)或其抗体片段，和约2.9mg/ml的抗ctla-4抗体(曲美木单抗)或其抗体片段；或约44.4mg/ml的抗pd-l1抗体(例如，杜伐鲁单抗)或其抗体片段，和约2.2mg/ml的抗ctla-4抗体(曲美木单抗)或其抗体片段。

在各种实施例中，该抗pd-l1抗体(杜伐鲁单抗)或其抗体片段与该抗ctla-4抗体(例如，曲美木单抗)或其抗体片段的蛋白质浓度比率为约15∶10至约20∶1。在具体的实施例中，该抗pd-l1抗体或其抗体片段与该抗ctla-4抗体或其抗体片段的蛋白质浓度比率为约15∶10、20∶3、10∶1、15∶1、或20∶1。本领域普通技术人员可以理解，蛋白质浓度比率可用于获得对应于该抗体的蛋白质浓度的抗体片段的蛋白质浓度，例如，考虑该抗体及其抗体片段之间分子量的差异。

在一些实施例中，该组合物或配制品可含有具有浓度范围为从约1mm至约50mm、或约20mm至约30mm、或约22mm至约25mm的组氨酸。在具体的实施例中，组氨酸的浓度为约20mm、21mm、22mm、23mm、24mm、25mm、26mm、27mm、28mm、29mm、或30mm。组氨酸可以呈l-组氨酸、d-组氨酸、或其混合物的形式。组氨酸也可以呈水合物的形式。组氨酸可以以药学上可接受的盐的形式使用，例如，盐酸盐(例如，单盐酸盐和二盐酸盐)、氢溴酸盐、硫酸盐、乙酸盐等。组氨酸的纯度应该是至少98％、或至少99％、或至少99.5％。组氦酸在ph为约5.5至约6.0的溶液中用作缓冲液。

该组合物或配制品可进一步包含赋形剂，例如糖类(例如，蔗糖、甘露糖、海藻糖等)、多元醇(例如，tween)和/或糖醇(例如，甘露醇、山梨糖醇等)。在一个实施例中，该赋形剂是糖。在具体的实施例中，该糖是海藻糖(例如，海藻糖脱水物)，其浓度范围为从约200mm至约300mm、或约225mm至约275mm、约250mm至约270mm、或约254mm至约269mm。在具体的实施例中，糖(例如，海藻糖脱水物)的浓度为约250mm、251mm、252mm、253mm、254mm、255mm、256mm、257mm、258mm、259mm、260mm、261mm、262mm、263mm、264mm、265mm、266mm、267mm、268mm、269mm、或270mm。在另一个实施例中，该赋形剂是多元醇。在具体的实施例中，该多元醇是聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯80)，其浓度范围为从约0.01％(w/v)至约1.0％(w/v)或约0.02％(w/v)至约0.05％(w/v)。在具体的实施例中，聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯80)的浓度为约0.01％(w/v)、0.02％(w/v)、0.03％(w/v)、0.04％(w/v)、0.05％(w/v)、0.06％(w/v)、0.07％(w/v)、0.08％(w/v)、0.09％(w/v)、或1.0％(w/v)。

该组合物或配制品可进一步包含防腐剂(例如，抗微生物防腐剂)。在各种实施例中，该组合物或配制品包含依地酸二钠二水合物(edta二钠盐二水合物)。在某些实施例中，edta的浓度为从约0.01mm至约0.3mm、约0.03mm至约0.17mm、或约0.03mm至约0.3mm。在具体的实施例中，edta的浓度为约0.01mm、0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm、0.10mm、0.11mm、0.12mm、0.13mm、0.14mm、0.15mm、0.16mm、0.17mm、0.18mm、0.19mm、0.20mm、0.21mm、0.22mm、0.23mm、0.24mm、0.25mm、0.26mm、0.27mm、0.28mm、0.29mm、或0.30mm。

该配制品的ph通常不应等于特定抗体(包括其抗体片段)的等电点，并且范围可以为从约4.0至约7.0、约5.0至约6.0、或约5.5至约6.0。在某些实施例中，本披露的组合物或配制品具有约5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、或6.0的ph。

在各种实施例中，本披露的组合物或配制品包含抗pd-l1抗体(例如，杜伐鲁单抗)或其抗体片段、抗ctla-4抗体(曲美木单抗)或其抗体片段、水性载体(例如，水)、海藻糖(例如，海藻糖脱水物)、组氨酸(例如，组氨酸/组氨酸-hcl)、聚山梨醇酯80、和edta。在某些实施例中，该组合物或配制品包含表2中列出的组分和量或浓度。

在具体的实施例中，在约5.8的ph下，该组合物或配制品包含约18.7mg/ml杜伐鲁单抗或其抗体片段、约12.5mg/ml曲美木单抗或其抗体片段、约22mm组氨酸/组氨酸-hcl、约254mm海藻糖脱水物、约0.17mmedta、和约0.02％w/vps80或由其组成。

在具体的实施例中，在约6.0的ph下，该组合物或配制品包含约36.3mg/ml杜伐鲁单抗或其抗体片段、约5.5mg/ml曲美木单抗或其抗体片段、约24mm组氨酸/组氨酸-hcl、约260mm海藻糖脱水物、约0.07mmedta、和约0.02％w/vps80或由其组成。

在具体的实施例中，在约6.0的ph下，该组合物或配制品包含约40.0mg/ml杜伐鲁单抗或其抗体片段、约4.0mg/ml曲美木单抗或其抗体片段、约25mm组氨酸/组氨酸-hcl、约264mm海藻糖脱水物、约0.05mmedta、和约0.02％w/vps80或由其组成。

在具体的实施例中，在约6.0的ph下，该组合物或配制品包含约42.8mg/ml杜伐鲁单抗或其抗体片段、约2.9mg/ml曲美木单抗或其抗体片段、约25mm组氨酸/组氨酸-hcl、约267mm海藻糖脱水物、约0.04mmedta、和约0.02％w/vps80或由其组成。

在具体的实施例中，在约6.0的ph下，该组合物或配制品包含约44.4mg/ml杜伐鲁单抗或其抗体片段、约2.2mg/ml曲美木单抗或其抗体片段、约25mm组氨酸/组氦酸-hcl、约269mm海藻糖脱水物、约0.03mmedta、和约0.02％w/vps80或由其组成。

在某些实施例中，本披露的配制品在约23℃至约27℃或约20℃至约24℃的温度范围内展示出持续至少6个月的稳定性。另外或可替代地，在某些实施例中，该配制品在约2℃至约8℃的温度范围内是稳定的，持续至少6个月、至少1年、或更长时间。另外或可替代地，在某些实施例中，该配制品在38℃至约42℃的温度范围内是稳定的，持续至少1个月，并且在一些实施例中，持续至少3个月。

可以例如，通过蛋白质浓度确定(例如，测量280mm处的吸光度或离子交换滴定色谱法)或高效尺寸排阻色谱法(hpsec)来评估稳定性。在某些实施例中，可以通过保持随时间的纯度水平来评估稳定性。例如，在某些实施例中，如通过hpsec确定的，当在约2℃至约8℃储存时，本披露的共配制品的纯度/年具有小于1％、小于0.8％、小于0.75％、小于0.7％、小于0.6％、小于0.5％、或甚至小于0.4％的降低。在一个实施例中，如通过监测片段和/或聚集种的存在或不存在的hpsec确定的，本披露的配制品具有长于6个月或长于1年的保质期。

在某些实施例中，本披露的共配制品组合物在储存持续如上所列的限定时间段后，当在2℃至8℃下储存时促进低至不可检测的聚集和/或片段化水平。优选地，在储存持续如上所列的限定时间段后，如通过hpsec所测量的，不超过5％、不超过4％、不超过3％、不超过2％、不超过1％、并且最优选地不超过0.5％的抗体(包括其抗体片段)形成片段或聚集体(可逆或不可逆的)形式。通过各种测定，包括例如视力检查、流动显微镜、离心凝胶电泳(例如，在还原和非还原条件下)、和离子交换色谱中的一种或多种评估聚集和/或片段化。

此外，如通过各种测定所评估的，本披露的共配制品组合物在上述条件下的延长的储存期间几乎不会损失抗体(包括其抗体片段)的生物活性。例如，免疫学测定，例如酶联免疫吸附测定(elisa)和放射免疫测定可以测量抗体(包括其抗体片段)免疫特异性结合抗原的能力。抗体组分的效力可以使用任何数量的生物测定来确定，例如，对每种抗体特异的报告基因生物测定方法。本披露的共配制品组合物在储存持续如上所限定时间段后，促进超过80％、超过85％、超过90％、超过95％、超过98％、超过99％、超过99.5％、超过99.8％、或超过99.9％的初始生物活性(例如，结合抗原的能力)的保留。在一些实施例中，本披露的共配制品组合物在储存持续如上所限定时间段后，与在储存前代表抗体的参比抗体相比，促进至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％、或至少99.9％的生物活性的保留。

治疗方法

本披露的共配制品组合物是有用的，包括例如在药物组合物的递送和/或储存中。在一个实施例中，该共配制品组合物包含如下共配制品组合物，其包含抗pd-l1抗体(例如，杜伐鲁单抗)或其抗原结合片段，和抗ctla-4抗体(例如，曲美木单抗)或其抗原结合片段。程序性细胞死亡-1/程序性细胞死亡配体-1(pd-1/pd-l1)途径和细胞毒性t淋巴细胞相关的抗原-4(ctla-4)途径阻断的组合靶向两个区室：抗pd-l1/抗pd-1在肿瘤微环境中起作用并阻断t细胞功能的抑制，而抗ctla-4在淋巴区室中起作用以扩增肿瘤应答性t细胞的数量和谱系。^1，2

杜伐鲁单抗(medi4736)是一种选择性、高亲和力的人类iggl单克隆抗体(mab)，其可阻断pd-l1与pd-1和cd80的结合⁴，但不会与程序性细胞死亡(pd-l2)结合，⁵避免潜在的在易感动物模型中观察到的由于pd-l2阻断引起的免疫相关的毒性。^6，7在正在进行的1/2期研究中，杜伐鲁单抗单一疗法对晚期nsclc患者产生了持久的应答，具有可管理的耐受性特性；随着每2周(q2w)杜伐鲁单抗10mg/kg的确认的/未确认的orr在pd-l1⁺患者中为27％，且在pd-l1^-患者中为5％。⁸在该研究中，在剂量递增阶段未达到最大耐受剂量(mtd)，并且使用10mg/kgq2w剂量开始剂量扩张组群。⁸曲美木单抗(cp-675,206)是ctla-4的选择性人类igg2mab抑制剂⁹；它通过ctla-4抑制促进t细胞活性，但似乎不会直接耗竭调节性t细胞。¹⁰杜伐鲁单抗和曲美木单抗的组合基于强大的临床前数据，表明这两种途径是非冗余的，这表明靶向两者可能具有加和效应或协同效应。¹¹

“杜伐鲁单抗”(还称为“medi4736”)意指选择性地结合pd-l1多肽的抗体或其抗原结合片段，并包含轻链可变区的至少一部分和/或重链可变区的至少一部分，该轻链可变区包含seqidno：1的氨基酸序列，该重链可变区包含seqidno：2的氨基酸序列。

关于用于在此提供的方法中的杜伐鲁单抗(或其抗原结合片段)的信息可以见于美国专利号8,779,108，其披露内容通过引用以其全文结合在此。杜伐鲁单抗的片段可结晶(fc)结构域在igg1重链的恒定结构域中含有三重突变，该三重突变减少与负责介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)的补体组分c1q和fcγ受体的结合。杜伐鲁单抗对pd-l1有选择性并且阻断了pd-l1与pd-1和cd80受体的结合。杜伐鲁单抗可以在体外解除pd-l1介导的对人类t细胞活化的抑制，并且经由t细胞依赖性机制在异种移植物模型中抑制肿瘤生长。

杜伐鲁单抗包含重链和轻链或重链可变区和轻链可变区。在具体的方面，用于在此提供的这些方法中的杜伐鲁单抗或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区包含seqidno：1的氦基酸序列，该重链可变区包含seqidno：2的氨基酸序列。在具体的方面，用于在此提供的这些方法中的杜伐鲁单抗或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含seqidno：3-seqidno：5的卡巴特(kabat)定义的cdr1、cdr2和cdr3序列，并且其中该轻链可变区包含seqidno：6-seqidno：8的卡巴特定义的cdr1、cdr2和cdr3序列。本领域普通技术人员将能够容易地鉴定本领域普通技术人员已知的乔西亚(chothia)定义的、abm定义的或其他的cdr定义。在具体的方面，用于在此提供的这些方法中的杜伐鲁单抗或其抗原结合片段包括如在美国专利号8,779,108中所披露的2.14h9opt抗体的可变重链和可变轻链cdr序列，该专利通过引用以其全文结合在此。

“曲美木单抗”意指选择性地结合ctla-4多肽的抗体或其抗原结合片段，并包含轻链可变区的至少一部分和/或重链可变区的至少一部分，该轻链可变区包含seqidno：9的氨基酸序列，该重链可变区包含seqidno：10的氨基酸序列。示例性抗ctla-4抗体例如在以下专利中有所描述：美国专利号6,682,736；7,109,003；7,123,281；7,411,057；7,824,679；8,143,379；7,807,797；以及8,491,895(在此，曲美木单抗是11.2.1)，这些专利通过引用结合在此。曲美木单抗是示例性抗ctla-4抗体。在下面的序列表中提供了曲美木单抗序列。

关于用于在此提供的方法中的曲美木单抗(或其抗原结合片段)的信息可以见于美国专利号6,682,736(其中它被称为11.2.1)，该专利的披露内容通过引用以其全文结合在此。曲美木单抗(又称为cp-675,206、cp-675、cp-675206、和替西木单抗(ticilimumab))是一种人类igg2单克隆抗体，该单克隆抗体对于ctla-4有高度选择性并阻断了ctla-4与cd80(b7.1)和cd86(b7.2)的结合。它已被证明导致体外免疫活化，并且用曲美木单抗治疗的一些患者已表现出肿瘤消退。

用于在此提供的这些方法中的曲美木单抗和其抗原结合片段包含重链和轻链或重链可变区和轻链可变区。在具体的方面，用于在此提供的这些方法中的曲美木单抗或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区包含seqidno：9的氨基酸序列，该重链可变区包含seqidno：10的氨基酸序列。在具体的方面，用于在此提供的这些方法中的曲美木单抗或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含seqidno：11-seqidno：13的卡巴特(kabat)定义的cdr1、cdr2和cdr3序列，并且其中该轻链可变区包含seqidno：14-seqidno：16的卡巴特定义的cdr1、cdr2和cdr3序列。本领域普通技术人员将能够容易地鉴定本领域普通技术人员已知的乔西亚(chothia)定义的、abm定义的或其他的cdr定义。在特定的方面，用于在此提供的方法中的曲美木单抗或其抗原结合片段包括如在us6,682,736中所披露的11.2.1抗体的可变重链和可变轻链cdr序列，该专利通过引用以其全文结合在此。

术语“抗原结合片段”是指完整抗体的一部分和/或是指完整抗体的抗原决定可变区。已知的是，抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来执行。抗体片段的实例包括但不限于：fab、fab′、f(ab′)2和fv片段，线性抗体，单链抗体，双体抗体，以及由抗体片段形成的多特异性抗体。

在某些方面，患有实体瘤(例如，nsclc)的患者被给予包含杜伐鲁单抗或其抗原结合片段和曲美木单抗或其抗原结合片段的共配制品组合物。有待向该患者给予的包含杜伐鲁单抗或其抗原结合片段和曲美木单抗或其抗原结合片段的共配制品组合物的量将取决于不同参数，例如该患者的年龄、体重、临床评价、肿瘤负荷和/或其他因素，包括主治医生的判断。

本发明的共配制品组合物可以仅被给予一次或偶尔给予，而仍然为该患者提供益处。在另外的方面，该患者被给予另外的后继剂量。可以取决于患者的年龄、体重、临床评定、肿瘤负荷和/或其他因素(包括主治医师的判断)，在不同时间间隔给予后继剂量。

在某些方面，该患者被给予一个或多个剂量(例如，两个、三个、或更多个剂量)的包含杜伐鲁单抗或其抗原结合片段和曲美木单抗或其抗原结合片段的共配制品组合物。“多剂量”意指两个或更多个剂量。特别是，多剂量配制品以2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、或多个剂量给予。

包含杜伐鲁单抗或其抗原结合片段和曲美木单抗或其抗原结合片段的共配制品组合物的剂量之间的间隔可以是每四周一次。包含杜伐鲁单抗或其抗原结合片段和曲美木单抗或其抗原结合片段的共配制品组合物的剂量之间的间隔可以是每十二周一次。包含杜伐鲁单抗或其抗原结合片段和曲美木单抗或其抗原结合片段的共配制品组合物剂量之间的间隔可以是每四周一次持续六个周期，并且然后每十二周一次。

在一些实施例中，向该患者给予至少两个剂量的包含杜伐鲁单抗或其抗原结合片段和曲美木单抗或其抗原结合片段的共配制品组合物。在一些实施例中，可以向该患者给予至少三个剂量、至少四个剂量、至少五个剂量、至少六个剂量、至少七个剂量、至少八个剂量、至少九个剂量、至少十个剂量或至少十五个剂量或更多剂量。在一些实施例中，在四周治疗周期内、在八周治疗周期内、在十六周治疗周期内、在二十周治疗周期内、在二十四周治疗周期内或在一年或更长治疗周期内给予包含杜伐鲁单抗或其抗原结合片段和曲美木单抗或其抗原结合片段的共配制品组合物。

在某些方面，根据在此提供的这些方法给予包含杜伐鲁单抗或其抗原结合片段和曲美木单抗或其抗原结合片段的共配制品组合物是通过肠胃外给予的。例如，可以通过静脉内输注或通过皮下注射来给予包含杜伐鲁单抗或其抗原结合片段和曲美木单抗或其抗原结合片段的共配制品组合物。在某些实施例中，该给予是通过静脉内输注。

共同疗法

使用包含在此提供的抗ctla-4抗体和抗pd-l1抗体或其抗原结合片段的本发明的共配制品组合物来治疗患有实体瘤的患者可以导致加和效应或协同效应。如在此使用，术语“协同”是指组合疗法(例如，抗ctla-4抗体和抗pd-l1抗体、或其抗原结合片段的组合)。

组合疗法(例如，抗ctla-4抗体和抗pd-l1抗体或其抗原结合片段的组合)的协同效应允许使用更低剂量的一种或多种治疗剂和/或向患有实体瘤的患者以更低的频率给予该治疗剂。利用更低剂量的治疗剂和/或以更低频率给予该疗法的能力减少与向受试者给予该疗法相关的毒性而不降低该疗法在实体瘤的治疗中的功效。此外，协同效应可以导致治疗剂在实体瘤的管理、治疗或改善中改进的功效。治疗剂的组合的协同效应可避免或减少与使用任一单一疗法相关的不良或不需要的副作用。

在共同疗法中，抗ctla-4抗体和抗pd-l1抗体或其抗原结合片段的组合可以包括在相同的药物组合物(例如，共配制品)中。在某些方面，根据本披露的药用组合物包含药学上可接受的、无毒性的、无菌的载体，例如生理盐水、无毒性的缓冲液、防腐剂等。本文披露了用于这些治疗方法中的合适的配制品。

用于测量肿瘤应答的测定

本文提供的治疗方法可以减少、延迟或稳定肿瘤生长。在一些方面，该减小或延迟可以是统计学上显著的。可以通过与基线处的患者肿瘤的生长、针对预期的肿瘤生长、针对基于大的患者群体的预期的肿瘤生长或针对对照群体的肿瘤生长进行比较来测量肿瘤生长的减少。在某些方面，肿瘤应答使用实体瘤反应评价标准(recist)来进行测量。

在某些方面，肿瘤应答在给予两个或更多个剂量的包含杜伐鲁单抗或其抗原结合片段和曲美木单抗或其抗原结合片段的共配制品组合物后是可检测的。在某些方面，肿瘤应答在第8周是可检测的。在某些方面，肿瘤应答在第33周是可检测的。在某些方面，肿瘤应答在第50周是可检测的。

在某些方面，“客观应答”(关于抗肿瘤活性)被定义为确认的完全或部分应答(cr或pr)。在某些方面，在24周的“疾病控制”被定义为≥24周的cr、pr、或稳定疾病(sd)持续时间。估计24周时的客观应答率(orr)和疾病控制率(dcr)，并使用精确的二项分布计算95％置信区间(ci)。

在某些方面，患者实现了疾病控制(dc)。疾病控制可以是完全应答(cr)、部分应答(pr)或稳定的疾病(sd)。

“完全应答”(cr)、“部分应答”(pr)、和“稳定的疾病”(sd)可以如在下面表1中所定义的来确定。

表1：总体应答的评估

^a被定义为在基线处的非靶病灶。

^b不可评估的被定义为在评价中没有病灶测量或只有病灶的小部分测量被进行。

在某些方面，给予包含杜伐鲁单抗或其抗原结合片段和曲美木单抗或其抗原结合片段的共配制品组合物可以增加无进展存活(pfs)。

在某些方面，给予包含杜伐鲁单抗或其抗原结合片段和曲美木单抗或其抗原结合片段的共配制品组合物可以增加整体存活(os)。

在一些实施例中，该患者先前已经接受了用至少一种化学治疗剂进行的治疗。在一些实施例中，该患者先前已经接受了用至少两种化学治疗剂进行的治疗。该化学治疗剂可以是例如并且不限于威罗菲尼、埃罗替尼、阿法替尼、西妥昔单抗、卡铂、贝伐单抗、埃罗替尼、吉非替尼、和/或培美曲塞。

在一些实施例中，该nsclc是至少一种化学治疗剂难治愈的或该nsclc对至少一种化学治疗剂有抗性。在一些实施例中，该肿瘤是至少两种化学治疗剂难治愈的或该肿瘤对至少两种化学治疗剂有抗性。该肿瘤可能是以下各项中的一种或多种难治愈的或该肿瘤对以下各项中的一种或多种有抗性：例如并且不限于威罗菲尼、埃罗替尼、阿法替尼、西妥昔单抗、卡铂、贝伐单抗、埃罗替尼、吉非替尼、和/或培美曲塞。在一些实施例中，该nsclc对于pd-l1是阴性的。在一些实施例中，该nsclc对于pd-l1是阳性的。

在一些实施例中，在给予包含杜伐鲁单抗或其抗原结合片段和曲美木单抗或其抗原结合片段的共配制品组合物之前，该患者具有0或1的东部肿瘤协作组(ecog)(okenmm等人，am.j.clin.oncol.[美国临床肿瘤学杂志]，5：649-55(1982))行为状态。

根据本文提供的方法，给予包含杜伐鲁单抗或其抗原结合片段和曲美木单抗或其抗原结合片段的共配制品组合物可导致所希望的药代动力学参数。可以使用“曲线下面积”(auc)来评估总药物暴露。“auc(τ)”是指从时间0至时间τ的给药间隔的auc，而“auc(∞)”是指直到无穷时间的auc。该给予可产生杜伐鲁单抗或其抗原结合片段的约600μg/ml至约3,000μg/ml*天的auc(τ)和曲美木单抗或其抗原结合片段的约250μg/ml至约350μg/ml*天的auc(τ)。该给予可产生约60μg/ml至约300μg/ml杜伐鲁单抗或其抗原结合片段和约25μg/ml至约35μg/ml曲美木单抗或其抗原结合片段的最大观察浓度(cmax)。该给予可产生约5μg/ml至约40μg/ml杜伐鲁单抗或其抗原结合片段和约4μg/ml至约6μg/ml曲美木单抗或其抗原结合片段的c最低值(最小血药浓度)。

如本文所提供的，在包含杜伐鲁单抗或其抗原结合片段和曲美木单抗或其抗原结合片段的共配制品组合物中的杜伐鲁单抗或其抗原结合片段也可降低游离(可溶的)pd-l1水平。游离(可溶的)pd-l1是指没有结合(例如，通过杜伐鲁单抗)的pd-l1。在一些实施例中，pd-l1水平被降低了至少65％。在一些实施例中，pd-l1水平被降低了至少80％。在一些实施例中，pd-l1水平被降低了至少90％。在一些实施例中，pd-l1水平被降低了至少95％。在一些实施例中，pd-l1水平被降低了至少99％。在一些实施例中，在给予包含杜伐鲁单抗或其抗原结合片段和曲美木单抗或其抗原结合片段的共配制品组合物之后，pd-l1水平是不可检测的。

在一些实施例中，在一次或多次给予包含杜伐鲁单抗或其抗原结合片段和曲美木单抗或其抗原结合片段的共配制品组合物之后，pd-l1水平降低了至少65％。在一些实施例中，在单次给予包含杜伐鲁单抗或其抗原结合片段和曲美木单抗或其抗原结合片段的共配制品组合物之后，pd-l1水平降低了至少80％。在一些实施例中，在单次给予包含杜伐鲁单抗或其抗原结合片段和曲美木单抗或其抗原结合片段的共配制品组合物之后，pd-l1水平降低了至少90％。在一些实施例中，在单次给予包含杜伐鲁单抗或其抗原结合片段和曲美木单抗或其抗原结合片段的共配制品组合物之后，pd-l1水平降低了至少95％。在一些实施例中，在单次给予包含杜伐鲁单抗或其抗原结合片段和曲美木单抗或其抗原结合片段的共配制品组合物之后，pd-l1水平降低了至少99％。在一些实施例中，在单次给予包含杜伐鲁单抗或其抗原结合片段和曲美木单抗或其抗原结合片段的共配制品组合物之后，pd-l1水平是不可检测的。

本文提供了使用包含杜伐鲁单抗或其抗原结合片段和曲美木单抗或其抗原结合片段的共配制品组合物治疗实体瘤非小细胞肺癌(nsclc)的方法。杜伐鲁单抗和曲美木单抗的组合可有效治疗非小细胞肺癌。本发明至少部分地基于这些发现。所提供的方法包括给予有效量的作为共配制品组合物的杜伐鲁单抗或其抗原结合片段和曲美木单抗或其抗原结合片段，以治疗非小细胞肺癌(nsclc)。

有三个主要的nsclc亚型：鳞状细胞癌、腺癌和大细胞(未分化)癌。其他亚型包括腺鳞癌和肉瘤样癌。nsclc可以包括在kras或表皮生长因子受体中的突变。这类突变在本领域是已知的并且描述于，例如，riely等人，procamthoracsoc.[美国胸腔学会会议录]2009年04月15日；6(2)：201-5，其通过引用结合在此。

患有肺癌(例如，非小细胞肺癌)的受试者可以在选择治疗方法的过程中对pd-l1多核苷酸或多肽表达进行测试。被鉴定为具有对pd-l1是阴性的肿瘤的患者(例如，如通过ct或ihc-m分数定义的)或由具有相对于参考水平减少的或不可检测的pd-l1水平鉴定的患者被鉴定为响应抗pd-l1抗体和曲美木单抗的组合治疗。向这样的患者给予杜伐鲁单抗或其抗原结合片段与曲美木单抗或其抗原结合片段的组合。

除非另外表明，本发明的实施采用很好地处在熟练的技术人员的见识范围之内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。这些技术在文献中已被充分解释，例如“molecularcloning：alaboratorymanual[分子克隆：实验室手册]”，第2版(sambrook，1989)；“oligonucleotidesynthesis[寡核苷酸合成]”(gait，1984)；“animalcellculture[动物细胞培养]”(freshney，1987)；“methodsinenzymology[酶学方法]”、“handbookofexperimentalimmunology[实验免疫学手册]”(weir，1996)；“genetransfervectorsformammaliancells[用于哺乳动物细胞的基因转移载体]”(miller和calos，1987)；“currentprotocolsinmolecularbiology[当前分子生物学方法]”(ausubel，1987)；“pcr：thepolymerasechainreaction[pcr：聚合酶链式反应]”(mullis，1994)；“currentprotocolsinimmunology[免疫学现代实验方案]”(coligan，1991)。这些技术适用于本发明的多核苷酸和多肽的生产，并且按照这样，可以被考虑用于制备和实施本发明。对具体实施例特别有用的技术将在下面的部分进行讨论。

给出以下的实例是为了给本领域普通技术人员提供如何制备和使用共配制品组合物和本发明的治疗方法的一个完整的披露内容和说明，而不是旨在限定诸位发明人认为是自己的发明的范围。

实例

实例1：杜伐鲁单抗和曲美木单抗共配制品稳定性评估

材料

用于研究的所有使用的材料都是usp级或多药典级(multicompendialgrade)。所有溶液和缓冲液使用usp或hplc水制备，并在进一步使用之前通过0.2μmpvdf过滤器(密理博(millipore)，millexgv，slg033rb)过滤。将由医学免疫公司(medimmune)(盖瑟斯堡，马里兰州)产生的高纯度的抗pd-l1抗体(杜伐鲁单抗)和抗ctla-4抗体(曲美木单抗)用于该研究中。所有样品均在生物安全柜(bsc)中在无菌防腐条件下制备。

方法和结果

适当地评估选择的时间点的流动显微镜(microflowimager^tm)、生物分析仪、离子交换色谱(iec)、和效力。

目视外观

根据从ph.eur.[欧洲药典](分别地从章节2.9.20、2.2.1和2.2.2)改编的程序，在目视检查站评估3cc、13mm玻璃小瓶中样品的目视外观的可见颗粒、澄清度/乳光和颜色。使用microflowimager^tm、mfi^tm(proteinsimple公司，安大略，加拿大)通过流动显微镜测量亚可见颗粒(svp)计数。为了从球形气泡中区分不规则的亚可见蛋白质颗粒，使用小于或等于0.85的软件纵横比来处理原始计数。

以不同的杜伐鲁单抗与曲美木单抗浓度比率混合后，最终的赋形剂浓度和ph不同。不同浓度比率的各种构象的最终配制品组合物示出于表2。

评估了以不同杜伐鲁单抗与曲美木单抗浓度比率共配制样品的稳定性，并与单独的杜伐鲁单抗或单独的曲美木单抗进行比较。在研究过程中，对于任何稳定性研究都没有观察到明显的可见颗粒形成。

图1-5阐明了在5℃、25℃、或40℃与单独的杜伐鲁单抗或单独的曲美木单抗相比，以不同杜伐鲁单抗与曲美木单抗浓度比率的共配制品的纯度损失率。如图所示出的，共配制样品的纯度损失率与单独的杜伐鲁单抗或单独的曲美木单抗的类似(图1-3示出了水性配制品，且图4和5示出了冻干配制品)。

图6-11证明了在2℃-8℃孵育下与单独的杜伐鲁单抗相比，以不同的杜伐鲁单抗与曲美木单抗浓度比率共配制的样品的亚可见颗粒计数。亚可见颗粒(svp)通过microflowimager^tm(mfi^tm)测量。总体而言，所有样品均未检测到svp计数的显著增加。

表2.不同杜伐鲁单抗和曲美木单抗共配制品的配制品组合物基于蛋白质浓度比率而变化。

通过尺寸排阻色谱法确定纯度

使用tsk-gelg3000swxl柱(其中在280nm处进行uv检测)(东曹生物科学有限责任公司(tosohbiosciencellc)，蒙哥马利维尔，宾夕法尼亚州)通过高效尺寸排阻色谱(hpsec)测量蛋白质纯度。使用含有0.1m磷酸钠、0.1m硫酸钠和0.05％(w/v)叠氮化钠的ph6.8流动相，将1.0ml/min的流速持续20分钟用于测定这些样品。

配制品稳定性研究

如上所述，将一系列共配制的杜伐鲁单抗和曲美木单抗混合物填充到透明玻璃小瓶(3cc，13mm)中。为了加速筛选，将样品于40℃/75％rh下稳定放置。对于长期稳定性研究，除了加速的40℃条件外，还在25℃/60％rh和2℃-8℃下进行了研究。目视检查小瓶的目视外观，并通过hpsec分析样品。

通过离子交换色谱确定蛋白质浓度(iec_浓度)

将离子交换滴定色谱用于定量杜伐鲁单抗和曲美木单抗的蛋白质浓度和比率。将共配制的样品在环境柱温度下注射到离子交换柱上，并用盐梯度洗脱。通过用分光光度计(安捷伦(agilent)uv-vis分光光度计)测量280mm处的吸光度来确定蛋白质浓度。将测量的消光系数1.52(mg/ml)^-1cm^-1和1.43(mg/ml)^-1gm^-1分别用于计算杜伐鲁单抗和曲美木单抗的蛋白质浓度。对于共配制品浓度，基于示出于表3中的蛋白质浓度比率衍生计算的消光系数。

表3

通过离子交换色谱(iec)确定电荷同种型

离子交换色谱(iec)用于测量电荷同种型，特别地是曲美木单抗的电荷异质性。将共配制的样品在环境柱温度下注射到离子交换柱上，并用盐梯度洗脱。使用220nm处的uv吸光度检测洗脱的蛋白质。报道了关于共配制品中每种组分的％面积和前峰(酸性变体)、主峰、和后峰(碱性变体)的结果。

还原和非还原凝胶电泳

在变性、非还原和变性、还原条件下通过凝胶电泳确定片段化。在分析之前，将测试样品调节至相同浓度，并在二硫苏糖醇(还原)或n-乙基马来酰亚胺(非还原；样品变性并烷基化)存在下与sds变性样品缓冲液混合。为了在还原条件下进行分析，将样品变性并还原为其重链和轻链种。将烷基化或还原的样品加载到填充有筛分聚合物和荧光染料的芯片上。带电荷的蛋白质种由电压梯度电泳驱动。由于恒定的质荷比率和筛分聚合物基质的存在，带电荷的蛋白质种按尺寸分离。通过激光诱导的荧光检测蛋白质-染料复合物。将数据转化为电泳图并定量峰面积以确定纯度和片段化水平。还原凝胶电泳的结果报告为重链加轻链的峰面积百分比和杂质百分比。非还原凝胶电泳的结果报告为主峰百分比和片段百分比。

为了确定共配制以20∶1比率的杜伐鲁单抗/曲美木单抗的主峰的纯度和相对片段化，将共配制的材料在5℃、25℃、和40℃下储存十二个月。图15-20证明了与单独的杜伐鲁单抗或曲美木单抗相比，以20∶1比率的杜伐鲁单抗和曲美木单抗共配制品的片段化特性。在不同的时间点，通过还原(图15-17)和非还原(图18-20)凝胶电泳来评估共配制的材料、单独的杜伐鲁单抗、和单独的曲美木单抗的主峰的纯度，以评估片段化水平。如图中所示出的，共配制的材料展示出与单独的每种抗体类似的百分比纯度。作为对纯度的进一步评估，在2℃至8℃孵育长达六个月后，通过a280和离子交换滴定色谱测量共配制的20∶1比率的杜伐鲁单抗/曲美木单抗、单独的杜伐鲁单抗、和单独的曲美木单抗的主峰的蛋白质浓度(表4)。结果表明，共配制品中的片段形成类似于单独的杜伐鲁单抗或单独的曲美木单抗。

表4

铁离子掺入研究

还检查了在存在或不存在依地酸二钠(edta)的情况下铁离子对曲美木单抗稳定性的影响。通过将氯化铁(ii)(阿尔法阿萨尔公司(alfaaesar)，沃德山，马萨诸塞州)溶解在hplc水中以获得1000ppm铁离子原液来制备铁离子掺入原液，其被进一步掺入样品中以获得最终所希望的铁离子浓度。在20∶1配制品组合物(25mmhis/his-hcl、270mm海藻糖二水合物、0.02％[w/v]聚山梨醇酯80，ph6.0)中，向单独的2mg/ml的(含有或不含0.03mmedta)曲美木单抗样品中掺入铁离子(0ppb、100ppb、200ppb、500ppb、或1000ppb)并在5℃、25℃、或40℃孵育。适当地通过hpsec、cief、cge分析样品。

图21-26示出了在5℃、25℃、或40℃，在存在或不存在含有不同铁离子水平的0.03mmedta下，曲美木单抗的单体纯度损失。在40℃，随着时间的推移，单体纯度百分比随着铁离子水平的升高而降低。在edta存在下，在5℃和25℃，在高达1ppm的铁离子长达9个月时，没有观察到显著的纯度降低。然而，当不存在edta时，在5℃或25℃孵育3个月后，在所有测试水平下检测到具有铁离子的样品的纯度降低。

图27-29证明了在具有不同铁离子水平的edta存在下，cief对于曲美木单抗的酸性峰特性。正如预期的，在高温下孵育时，酸性峰会增加。然而，对于具有不同铁离子水平的样品没有观察到显著差异。当存在edta时，与不含铁离子的样品相比，对于具有高达1ppm铁离子的样品，在5℃长达3个月没有观察到酸性峰显著增加。

图30-31示出了当存在edta时具有不同铁离子水平的曲美木单抗的片段化特性。在5℃和25℃，对于具有不同铁离子水平长达6个月的样品，未检测到片段化的显著增加。

如上述研究中所示出的，各种方法表明共配制的20∶1比率的杜伐鲁单抗/曲美木单抗在延长的时间段内保持稳定。这有助于建立共配制品的活力，供临床医生用于癌症治疗。

实例2：杜伐鲁单抗和曲美木单抗共配制品效力

使用对每种组分特异的报告基因生物测定方法确定共配制的产品中的杜伐鲁单抗和曲美木单抗的效力。

为了确定杜伐鲁单抗效力，将利用抗cd3scfv(okt3)和pd-l1的2-细胞生物测定在中国仓鼠卵巢(cho)细胞系中表达，且pd-1和报告基因元件(ap-1荧光素酶)在jurkat人类t淋巴细胞系(jurkatpd-1ap-1)中表达。通过抗cd3(经由cho细胞上表达的抗cd3scfv[okt3])和抗cd28(添加至jurkat/pd-1测定培养基)的共刺激活化，在jurkat/pd-1细胞中介导ap-1信号级联，导致ap-1转录因子与ap-1dna应答元件的结合和荧光素酶蛋白的表达。在与荧光素酶底物反应后使用发光读数器定量发光。发光量与t细胞活化水平成比例。通过将参比标准的ic50值除以测试样品的ic50值并乘以100来确定该测试样品的相对效力百分比。

在cho细胞系上表达的pd-l1存在下，cd3/cd28刺激信号被抑制(t细胞抑制)并且未观察到发光信号。在杜伐鲁单抗存在下，pd-l1与pd-1的结合被抑制，由于恢复的cd3/cd28刺激信号(恢复t细胞活化)导致荧光素酶信号增加。定量共配制样品对杜伐鲁单抗参比标准的效力。

为了确定杜伐鲁单抗效力，测量共配制的产品(含有曲美木单抗)在t细胞活化期间减弱ctla-4介导的抑制信号的能力(效力)。该测定由两种细胞系组成：工程化以表达il-2-荧光素酶和ctla-4的jurkat细胞系，和burkitt淋巴瘤衍生的淋巴母细胞样细胞系(raji)。在曲美木单抗存在下，ctla-4介导的t细胞活化抑制减弱，允许荧光素酶报告基因的表达。发光量与t细胞活性成比例。在与steady-glo荧光素酶底物反应后使用光度计定量发光。通过将曲美木单抗参比标准的ec50值除以测试样品的ec50值来确定测试样品的效力。

为了确定曲美木单抗效力，使用2-细胞测定；一种细胞是jurkat人类t细胞淋巴细胞系，其经过工程化以在il-2启动子的控制下表达人类ctla4和荧光素酶报告基因；另一种是表达b7的人类b淋巴细胞raji细胞系。原则上，曲美木单抗与细胞膜上的ctla4结合，导致阻断由ctla4途径产生的抑制信号。在刺激物(抗cd3抗体，okt3)和raji细胞的存在下，曲美木单抗与ctla4的结合剂量依赖性地阻断b7配体与ctla4的结合，导致jurkat细胞中il2-荧光素酶报告基因的转录活化。在与荧光素酶底物反应后，在光度计中量化与t细胞活性成比例的发光量。通过将参比标准的ic50值除以测试样品的ic50值并乘以100来确定测试样品的相对效力百分比。

在不同温度(5℃、25℃、和40℃)下，将以20∶1比率共配制的杜伐鲁单抗和曲美木单抗的效力与单独的杜伐鲁单抗和曲美木单抗相比。使用上文更详细描述的报告基因测定确定效力。如图12-14示出的，将20∶1的杜伐鲁单抗/曲美木单抗共配制品在5℃储存十二个月(图12)、在25℃储存六个月(图13)、在40℃储存三个月时展现出与单独的相应的抗体类似的效力(图14)。

上述研究示出了20∶1的杜伐鲁单抗/曲美木单抗共配制品与组合给予具有一样的效力，因此为癌症患者提供了显著的益处。

***

本领域技术人员仅仅使用常规实验即可识别出或能够确定在此描述的本披露的特定方面的许多等效物。此类等效物意图由以下权利要求书涵盖。

尽管出于清晰理解的目的已经借助于说明和实例相当详细地描述了前述发明，但显而易见可以在所附权利要求书的范围内实践某些变化和修改。

在此引用各种公开，这些公开的披露内容通过引用以其全文结合在此。

本文引用以下参考文献：

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序列表

seqidno：1杜伐鲁单抗(medi4736)vl

seqidno：2杜伐鲁单抗(medi4736)vh

seqidno：3-杜伐鲁单抗(medi4736)vhcdr1

seqidno：4-杜伐鲁单抗(medi4736)vhcdr2

seqidno：5-杜伐鲁单抗(medi4736)vhcdr3

seqidno：6-杜伐鲁单抗(medi4736)vlcdr1

seqidno：7-杜伐鲁单抗(medi4736)vlcdr2

seqidno：8-杜伐鲁单抗(medi4736)vlcdr3

seqidno：9曲美木单抗vl

seqidno：10曲美木单抗vh

seqidno：11-曲美木单抗vhcdr1

seqidno：12-曲美木单抗vhcdr2

seqidno：13-曲美木单抗vhcdr3

seqidno：14-曲美木单抗vlcdr1

seqidno：15-曲美木单抗vlcdr2

seqidno：16-曲美木单抗vlcdr3

<110>医学免疫公司

<120>包含抗pd-l1和抗ctla-4抗体的共配制品的组合物

<130>trb7-300-wo-pct

<140>

<141>

<150>62/327,214

<151>2016-04-25

<160>16

<170>patentin版本3.5

<210>1

<211>108

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成多肽

<400>1

gluilevalleuthrglnserproglythrleuserleuserprogly

151015

gluargalathrleusercysargalaserglnargvalserserser

202530

tyrleualatrptyrglnglnlysproglyglnalaproargleuleu

354045

iletyraspalaserserargalathrglyileproaspargpheser

505560

glyserglyserglythraspphethrleuthrileserargleuglu

65707580

progluaspphealavaltyrtyrcysglnglntyrglyserleupro

859095

trpthrpheglyglnglythrlysvalgluilelys

100105

<210>2

<211>121

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成多肽

<400>2

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheserargtyr

202530

trpmetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

alaasnilelysglnaspglyserglulystyrtyrvalaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnalalysasnserleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaarggluglyglytrppheglygluleualapheasptyrtrpgly

100105110

glnglythrleuvalthrvalserser

115120

<210>3

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>3

glyphethrpheserargtyrtrpmetser

1510

<210>4

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>4

asnilelysglnaspglyserglulystyrtyrvalaspservallys

151015

gly

<210>5

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>5

gluglyglytrppheglygluleualapheasptyr

1510

<210>6

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>6

argalaserglnargvalsersersertyrleuala

1510

<210>7

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>7

aspalaserserargalathr

15

<210>8

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>8

glnglntyrglyserleuprotrpthr

15

<210>9

<211>139

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成多肽

<400>9

proserserleuseralaservalglyaspargvalthrilethrcys

151015

argalaserglnserileasnsertyrleuasptrptyrglnglnlys

202530

proglylysalaprolysleuleuiletyralaalaserserleugln

354045

serglyvalproserargpheserglyserglyserglythraspphe

505560

thrleuthrileserserleuglnprogluaspphealathrtyrtyr

65707580

cysglnglntyrtyrserthrprophethrpheglyproglythrlys

859095

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100105110

proseraspgluglnleulysserglythralaservalvalcysleu

115120125

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130135

<210>10

<211>167

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>10

glyvalvalglnproglyargserleuargleusercysalaalaser

151015

glyphethrphesersertyrglymethistrpvalargglnalapro

202530

glylysglyleuglutrpvalalavaliletrptyraspglyserasn

354045

lystyrtyralaaspservallysglyargphethrileserargasp

505560

asnserlysasnthrleutyrleuglnmetasnserleuargalaglu

65707580

aspthralavaltyrtyrcysalaargaspproargglyalathrleu

859095

tyrtyrtyrtyrtyrglymetaspvaltrpglyglnglythrthrval

100105110

thrvalserseralaserthrlysglyproservalpheproleuala

115120125

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130135140

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145150155160

alaleuthrserglyvalhis

165

<210>11

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成多肽

<400>11

glyphethrphesersertyrglymethis

1510

<210>12

<211>15

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>12

valiletrptyraspglyserasnlystyrtyralaaspserval

151015

<210>13

<211>24

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>13

thralavaltyrtyrcysalaargaspproargglyalathrleutyr

151015

tyrtyrtyrtyrglymetaspval

20

<210>14

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>14

argalaserglnserileasnsertyrleuasp

1510

<210>15

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>15

alaalaserserleuglnser

15

<210>16

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>16

glnglntyrtyrserthrprophethr

15