具有改进的药代动力学的糖基化VWF融合蛋白的制作方法

本发明涉及蛋白质的半衰期延长，特别是人凝血因子如血管性血友病因子(vwf)和因子viii(fviii)。
背景技术：
：血友病是一组损害身体控制血液凝固或凝血的能力的遗传性疾病。在其最常见的形式血友病a中，凝血因子viii(fviii)是缺乏的。血友病a在5,000-10,000个男性出生儿中有约1个发生。fviii蛋白是血液凝固中具有多功能特性的必需辅助因子。fviii的缺乏可以用血浆衍生的fviii浓缩物或用重组产生的fviii治疗。用fviii浓缩物治疗可令血友病患者正常生活。血友病a患者根据需要用fviii治疗或作为每周施用数次的预防性治疗进行治疗。对于预防性治疗，施用15-25iu/kg体重的fviii，每周三次，这因为对fviii的持续需要及其在血液系统中的短的半衰期的缘故而是必要的，上述半衰期在人体中仅为约11小时(ewenstein等,2004)。在血液中，在正常条件下，fviii分子总是与其辅因子血管性血友病因子(vwf)相关，其使fviii分子稳定免于不同形式的降解。fviii和vwf的非共价复合物具有0.2-0.3nm的高结合亲和力(vlot等,1996)。在历史上，血友病a已经用源自人血浆的fviii治疗。然而，自20世纪90年代以来，市售了不同的重组产生的fviii蛋白。然而，血浆衍生的和重组产生的fviii蛋白都不具有最佳的药代动力学特性。与许多其他治疗性蛋白质一样，它们受到肽酶的代谢更新的影响，这显著限制了它们的体内半衰期。如tiede等(2015)评论，延长fviii半衰期的尝试包括fc融合(eloctate、elocta、efmoroctocogα)，添加聚乙二醇(turoctocogαpegol[n8-gp]、bay94-9027、bax855)和单链构建体(csl627)。所有这些技术改变fviii分子并得到半衰期延长约1.5倍的fviii。fviii的进一步半衰期延长限于vwf半衰期。如yee等人所示，人vwfd`d3结构域足以稳定血浆中的fviii。然而，d’d3-fc融合蛋白仅能在vwf-/-小鼠中延长fviii半衰期。在血友病a小鼠中，d’d3-fc构建体由于蛋白质片段与内源性vwf对fviii结合的无效竞争而不会导致fviii半衰期延长。wo2014/011819a2描述了含有vwf的d’d3结构域，xten和igg的fc结构域的fviii构建体的成功半衰期延长。由于该构建体不与内源性vwf结合，因此在vwf/fviii-双敲除(dko)和血友病a小鼠中均观察到相同的半衰期延长效应。然而，尽管体外功能完全，但其在体内显示出显著降低的活性。用于增加治疗性蛋白质的半衰期的其他方法包括治疗性蛋白质与具有天然长半衰期的蛋白质如转铁蛋白和白蛋白的遗传融合，或与蛋白质结构域如绒毛膜促性腺激素(cg)的c-末端肽(ctp)的遗传融合。cg属于糖蛋白激素家族，其包括促黄体激素(lh)、促卵泡激素(fsh)和促甲状腺激素(tsh)。这些糖激素是异二聚体并由共同的α-亚基和赋予它们不同活性的独特的β-亚基组成。人cg(hcg)的半衰期显著比其对应物lh、fsh和tsh的半衰期更长。这表明，hcg-β的o-糖基化ctp是造成这种半衰期延长的原因。ctp被描述为由序列fqssss*kappps*lpsps*rlpgps*dtpilpq组成，其具有四个o-糖基化位点(由s*表示)(birken等,1977)。如strohl等(2015)所述，已经开发了治疗性蛋白质和ctp的不同融合蛋白，并且目前正在临床试验中。治疗性蛋白质包括fshfviia、fix、ifn-β和胃肠激素。技术实现要素：本发明尤其基于以下发现：将o-糖基化氨基酸簇(其存在于全长人vwf中)添加到vwf片段中导致其半衰期显著增加。与不具有额外o-聚糖簇的vwf片段相比，融合蛋白的半衰期延长。因此，根据第一方面，本发明涉及一种包含主要蛋白质和至少一个延伸肽的融合蛋白，其中主要蛋白质的氨基酸序列与哺乳动物蛋白质如vwf或其片段的氨基酸序列相同或相似，所述延伸肽包含o-糖基化氨基酸簇。令人关注的是，被加成到vwf的片段中的包含o-糖基化氨基酸簇的延伸肽就是衍生自该蛋白质本身，即vwf。因此，申请人已经确定了延长蛋白质半衰期的一般原则。该一般原理是将蛋白质的o-糖基化氨基酸的内在簇添加到所述蛋白质或其片段中。因此，根据第一方面的融合蛋白的优选实施例，一个或多个延伸肽的氨基酸序列与所述哺乳动物蛋白或片段的非重复氨基酸序列部分相同或相似，特别是所述主要蛋白质。本发明人的发现的进一步结论是由seqidno：1鉴定的vwf的o-糖基化氨基酸簇可用作半衰期延伸肽。由于半衰期延长性质不限于vwf，根据第一方面的另一优选实施例，一个或多个延伸肽与vwf的o-糖基化肽具有至少90％，优选地至少95％，更优选地至少98％，最优选地至少100％的序列同一性，特别是seqidno：1。在第二方面中，本发明涉及一种编码根据第一方面的融合蛋白的多核苷酸。根据第三方面，本发明涉及一种含有根据第二方面的多核苷酸的载体。在第四方面中，本发明涉及一种含有根据第二方面的多核苷酸或根据第三方面的载体的宿主细胞，其中该宿主细胞是哺乳动物细胞。发明人发现，不仅vwf的半衰期增加，而且其结合配偶体fviii的半衰期也增加。因此，根据第五方面，本发明涉及根据第一方面的融合蛋白用于增加第二蛋白的半衰期的用途，其中所述融合蛋白能够与所述第二蛋白结合。因此，在所得的融合蛋白和第二蛋白质的复合物或组合物中，第二蛋白质也具有增加的半衰期。因此，在第六方面中，本发明涉及一种第一蛋白质和第二蛋白质的组合物，其中所述第一蛋白质是根据第一方面的融合蛋白并且能够结合所述第二蛋白质，并且所述第二蛋白质是治疗性蛋白质，其包含与第二哺乳动物蛋白质或其片段的氨基酸序列相同或相似的氨基酸序列。并且根据第七方面，本发明涉及一种第一蛋白质和第二蛋白质的复合物，其中所述第一蛋白质是根据第一方面的融合蛋白，并且所述第二蛋白质具有与第二哺乳动物蛋白质或其片段的氨基酸序列相同或相似的氨基酸序列。最后，在第八方面中，本发明还涉及一种药物组合物，其包含根据第一方面的融合蛋白，根据第六方面的组合物，或根据第七方面的复合物，其用于治疗或预防出血性疾病，优选地选自pup治疗，或iti治疗和其他相关出血性疾病治疗。附图说明图1显示以下的的示意图：a)vwf片段octa11，和b)根据本发明的融合蛋白，其中vwf片段作为主要蛋白质：octa12；c)根据本发明的融合蛋白，其中vwf片段作为主要蛋白质：octa14；d)根据本发明的融合蛋白，其中vwf片段作为主要蛋白质：octa15。图2显示静脉内施用与不同vwf蛋白或血浆衍生的全长vwf共同配制的fviii后fviii/vwf双敲除(dko)小鼠血浆中的fviii活性的时间进程。数据点和误差条表示5个值的平均值和标准偏差(sd)。由于尺寸小，有些误差条是不可辨别的。图3显示了皮下施用与octa12共同配制的100u/kgfviii后小型猪血浆中的octa12抗原浓度的时间进程。图4显示了皮下和静脉内注射100u/kgfviii或皮下注射与vwf-蛋白质octa12共同配制的100u/kgfviii后小型猪血浆中的fviii抗原浓度的时间进程。具体实施方式为了提供对说明书和权利要求，以及这些术语的指定范围的清楚和一致的理解，提供以下定义。定义如本文所用的“肽”可以由任何数量的任何类型的氨基酸组成，优选地天然存在的氨基酸，其优选地通过肽键连接。特别地，肽包含至少3个氨基酸，优选地至少5个、至少7个、至少9个、至少12个、或至少15个氨基酸。此外，肽的长度没有上限。然而，优选地，根据本发明的肽的长度不超过500个氨基酸，更优选地，其长度不超过300个氨基酸；甚至更优选地，其不长于250个氨基酸。因此，术语“肽”包括“寡肽”，其通常是指长度为2至10个氨基酸的肽，和“多肽”，其通常是指长度超过10个氨基酸的肽。如本文所用的“蛋白质”可含有一条或多条多肽链。具有一条以上多肽链的蛋白质通常被表达为来自一个基因的一条多肽链，并在翻译后切割。因此，术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用。本文使用的多肽和蛋白质包括化学合成的蛋白质以及由基因编码的天然合成的蛋白质。多肽或蛋白质可以从天然来源如人血液获得，或者在细胞培养物中作为重组蛋白质制得。本文所用的术语“治疗性蛋白质”涉及具有治疗作用的蛋白质或多肽，即用作活性药物成分的蛋白质。根据本发明，术语“蛋白质前体”，“前蛋白”或“前肽”涉及无活性蛋白质(或肽)，其可通过翻译后修饰，酶促切割部分氨基酸序列转化成活性形式。两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“序列同一性”描述。出于本发明的目的，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用needleman-wunsch算法(needleman和wunsch,1970,j.mol.biol.48:443-453)确定，如在emboss程序包的needle程序中实施(emboss:theeuropeanmolecularbiologyopensoftwaresuite,rice等,2000,trendsgenet.16:276-277)，优选版本3.0.0或更高版本。使用的任选参数是缺口开放罚分10，缺口延伸罚分0.5和eblosum62(blosum62的emboss版本)取代矩阵。标记为“最长同一性”的needle的输出(使用无简要选项获得)用作百分比同一性，并计算如下：(相同残基×100)/(比对长度-比对中的缺口总数)。出于本发明的目的，两个核苷酸序列之间的序列同一性程度使用needleman-wunsch算法(needlemanandwunsch,1970,同上)确定，如在emboss程序包的needle程序中实施(emboss:theeuropeanmolecularbiologyopensoftwaresuite,rice等,2000,同上)，优选地3.0.0或更高版本。使用的任选参数是缺口开放罚分10，缺口延伸罚分0.5和ednafull(ncbinuc4.4的emboss版本)取代矩阵。标记为“最长同一性”的needle的输出(使用无简要选项获得)用作百分比同一性，并计算如下：(相同的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度-比对中的缺口总数)本文所述的关于肽或多核苷酸的定义的术语“相似性”和“相似的”涉及氨基酸序列或核苷酸序列与参照的序列同一性的指定程度。类似的氨基酸序列包括与主题序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％同一性的氨基酸序列。通常，虽然相似的序列将在与肽或多核苷酸的功能相关的位置包括相同的残基，例如活性位点残基或糖基化的氨基酸，但是可以包括任何数量的保守氨基酸置换。类似的核苷酸序列包括与主题序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％同一性的核苷酸序列。如本文所用，“相同的”是指与参考序列具有100％同一性的氨基酸或核苷酸序列。术语“重组”当用于提及细胞、核酸、蛋白质或载体时，表示通过引入异源核酸或蛋白质或改变天然核酸或蛋白质而加以修饰的细胞、核酸、蛋白质或载体，或源自如此修饰的细胞的细胞。因此，例如，重组细胞表达在细胞的天然(非重组)形式内未发现的基因，或以不同水平或在自然界中发现的不同条件下表达的天然基因。本文所用的术语“半衰期”是在达到分布的假平衡后血浆/血液浓度降低50％所需的时间(根据toutain等,2005中的定义)。术语“半衰期”也称为“循环半衰期”、“最终半衰期”或“消除半衰期”。如本文所用，关于细胞使用的术语“转化的”、“稳定转化的”和“转基因的”是指细胞含有整合到其基因组中或作为通过多代维持的附加体携载的非天然(例如异源)核酸序列。如本文所用的术语“片段”是指一种多肽，其与天然或野生型蛋白质相比具有一个或多个氨基酸的氨基末端和/或羧基末端缺失，但其中剩余的氨基酸序列与从全长cdna推导出的氨基酸序列中的相应位置相同。片段的长度通常为至少50个氨基酸。本文所用的术语“糖基化”是指聚糖与分子的连接，例如与蛋白质的连接。糖基化可以是酶促反应。形成的连接可以通过共价键。因此，如本文所用的糖基化多肽是与一个或多个聚糖连接的多肽。短语“高度糖基化”是指在所有或几乎所有可用的糖基化位点(例如o-连接或n-连接的糖基化位点)糖基化的分子，例如酶。如本文所用的术语“聚糖”是指多糖或寡糖，或糖蛋白或糖基化多肽的碳水化合物部分。聚糖可以是单糖残基的均聚物或杂聚物。它们可以是直链或支链分子。聚糖通常含有至少三个糖，并且可以是直链或支链的。聚糖可包括天然糖残基(例如，葡萄糖、n-乙酰葡糖胺、n-乙酰神经氨酸、n-乙酰半乳糖胺、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、阿拉伯糖、核糖、木糖等)和/或修饰的糖(例如，2’-氟代核糖、2’-脱氧核糖、磷酸甘露糖、6’-磺基-n-乙酰葡糖胺等)。本文所用的术语“o-聚糖”是指通常发现与哺乳动物糖蛋白的丝氨酸和苏氨酸残基共价连接的聚糖。o-聚糖可以通过o-糖苷键经n-乙酰半乳糖胺(galnac)部分与丝氨酸或苏氨酸的-oh进行α-连接。其他连接包括α-连接的o-岩藻糖、β-连接的o-木糖、α-连接的o-甘露糖、β-连接的o-glcnac(n-乙酰葡糖胺)、α-或β-连接的o-半乳糖、以及α-或β-连接的o-葡萄糖聚糖。根据本发明，术语“o-糖基化簇”、“o-聚糖簇”和“o-糖基化氨基酸簇”可互换使用，并且涉及两种或更多种o-糖基化氨基酸。如本文所用的术语“唾液酸化”是指已经与唾液酸或其衍生物反应的分子，特别是聚糖。与“包括”，“含有”或“特征在于”同义的过渡术语“包含”是包含性的或开放式的，并且不排除另外的、未列举的元素或方法步骤。过渡短语“由......组成”不包括权利要求中未指定的任何元素、步骤或成分，除了通常与其相关的杂质。当短语“由......组成”出现在权利要求主体的一个条款中，而不是紧接在前序之后时，其仅限制该条款中陈述的元素；其他元素作为整体不排除在权利要求之外。过渡短语“基本上由......组成”将权利要求的范围限制于指定的材料或步骤“以及对要求保护的发明的基本和新颖特征没有实质影响的那些”。“‘基本上由权利要求组成’的a占据了以‘由......组成’格式书写的封闭式权利要求与以‘包含’格式书写的完全开放式权利要求之间的中间部分。”在本发明的上下文中，出于实际原因，术语“糖基化蛋白质”如融合蛋白以单数形式使用。通常，在实践中，蛋白质存在于相同类型的蛋白质分子的组合物中。然而，在糖基化蛋白质的情况下，糖基化在组合物的每个分子中都是不相同的。例如，并非组合物的所有单个分子都可以被糖基化至100％。此外，可能出现与特定o-糖基化位点结合的聚糖的差异。因此，在本申请中，对“融合蛋白”的提及也涉及具有相同氨基酸序列但在o-聚糖结构中具有变化的融合蛋白分子的组合物。本文所用的术语“结合亲和力”或“亲和力”表示两个分子之间的结合强度，特别是配体和蛋白质靶标。结合亲和力受两个分子之间的非共价分子间相互作用的影响，例如氢键、静电相互作用、疏水相互作用和范德华力。本文所用的免疫应答涉及适应性或先天性免疫应答。先天性免疫反应是指非特异性防御机制，其在抗体在体内出现后立即或数小时内被激活。这些机制包括物理障碍，如皮肤、血液中的化学物质、以及攻击体内外来细胞的免疫系统细胞。先天性免疫应答被抗原的化学特性激活。适应性免疫应答是指抗原特异性免疫应答。为此，首先必须加工和识别抗原。一旦抗原被识别，适应性免疫系统就会产生大量专门设计用于攻击该抗原的免疫细胞。融合蛋白根据第一方面，本发明提供了一种融合蛋白，其包含主要蛋白质和至少一个延伸肽，其中主要蛋白质的氨基酸序列与哺乳动物蛋白质或其片段的氨基酸序列相同或相似，并且所述延伸肽包含o-糖基化氨基酸簇。本发明人已经鉴定了导致半衰期增加的蛋白质修饰，即添加含有o-糖基化氨基酸簇的延伸肽。如实施例中所示，人vwf的o-糖基化簇1作为延伸肽与vwf片段的融合导致仅与vwf片段(octa11)相比具有增加的半衰期的融合蛋白(octa12)。半衰期(t1/2)可以通过各个血浆浓度-时间曲线的对数线性部分的线性回归分析或通过非线性回归使用一相指数衰减模型来计算。用于计算的示例性软件程序是graphpadprism版本6.07(lajolla,ca92037usa)和winnonlin，版本6.4(pharsightcorporation,mountainview,ca,usa)。计算基于以下等式：kel＝消除率常数t1/2＝消除半衰期c＝浓度t＝时间因此，根据一个实施例，与不含延伸肽的主要蛋白质相比，融合蛋白具有增加的半衰期。由于可以增加具有衍生自vwf的糖基化氨基酸簇的vwf片段的半衰期，因此发明人已经确定了半衰期延长的新原理。即，通过添加也存在于天然存在的蛋白质中的o-糖基化氨基酸簇增加蛋白质或蛋白质片段的半衰期。因此，根据融合蛋白的一个实施例，一个或多个延伸肽的氨基酸序列与所述哺乳动物蛋白的一部分相同或相似。该哺乳动物蛋白质部分特别是非重复氨基酸序列。如本文所用的非重复氨基酸序列是在根据本发明的天然存在的哺乳动物蛋白中仅在一个拷贝中发现的序列。因此，非重复氨基酸序列明确排除了蛋白质中天然存在的任何重复序列。如果序列由超过20个氨基酸，优选地超过15个氨基酸，更优选地超过10个氨基酸组成，则序列被特别认为是重复的，并且哺乳动物蛋白含有多于一个该序列。重复序列可以衍生自所谓的可变数目的串联重复。可变数目的串联重复(vntr)是基因组中的位置，其中短核苷酸序列被组织为“串联重复”。当重复一个或多个核苷酸的模式并且重复彼此直接相邻时，在dna中发生“串联重复”。vntr存在于许多染色体上，并且通常在个体之间显示出长度的变化。在串联重复位于蛋白质编码dna序列中的情况下，这些串联重复导致氨基酸序列重复。实例是在粘蛋白家族的所有成员中发现的串联重复。粘蛋白是由动物界的大多数生物体中的上皮组织产生的高分子量、高度糖基化的蛋白质家族。根据本发明的非重复氨基酸序列明确地排除了这种氨基酸序列串联重复，特别是粘蛋白串联重复。延伸肽不仅可以衍生自与主要蛋白质相同的哺乳动物蛋白质，更具体地可以包含也存在于主要蛋白质中的一部分。因此，根据一个实施例，一个或多个延伸肽的氨基酸序列与所述主要蛋白质的非重复氨基酸序列部分是相同或相似的。优选地，一个或多个延伸肽不衍生自绒毛膜促性腺激素β-亚基(cg-β)。绒毛膜促性腺激素β-亚基的c-末端肽(ctp)显示出增加其他蛋白质如fsh、fviia和fix的半衰期。然而，对于hcg被描述为具有另外的ctp，即多于一个ctp拷贝的情况，该蛋白质被特别排除在本发明的主题之外。因此，特别地，延伸肽与cg-β的ctp是不相同或不相似的。根据本发明，氨基酸序列附近的两个或更多个o-糖基化氨基酸被认为是簇。因此，根据融合蛋白的一个实施例，至少一个延伸肽的o-糖基化氨基酸簇含有至少两个o-糖基化氨基酸。该簇可含有例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个o-糖基化氨基酸。根据理论，半衰期延长效应是基于o-聚糖的负电荷。因此，半衰期延长效应应随着簇中o-糖基化氨基酸的数量而增加。因此，簇优选地含有至少三个o-糖基化氨基酸。如实施例中所示，使用具有四个o-糖基化氨基酸簇的延伸肽实现显著的半衰期扩展效应。因此，根据优选的实施例，该簇含有至少四个o-糖基化氨基酸。除了簇的o-糖基化氨基酸外，还可以存在n-糖基化氨基酸。优选地，在o-糖基化簇中没有n-糖基化氨基酸。在存在多于一个延伸肽的情况下，延伸肽的簇可具有不同数量的o-糖基化氨基酸。例如，融合蛋白可含有一个具有两个o-糖基化氨基酸的簇和具有四个o-糖基化氨基酸的第二簇。此外，一个簇可含有三个o-糖基化位点和另外四个o-糖基化位点。延伸肽的o-糖基化氨基酸可以是粘蛋白型o-糖基化氨基酸丝氨酸(ser)和苏氨酸(thr)。然而，o-糖基化酪氨酸(tyr)、羟基赖氨酸(羟基-lys)或羟基脯氨酸(羟基-pro)也是本领域已知的。因此，融合蛋白中的一个或多个o-糖基化氨基酸，特别是在延伸肽中，可以选自ser、thr、tyr、羟基-lys和羟基-pro。导致所述片段的半衰期延长的与octa12中的vwf片段融合的延伸肽含有o-糖基化苏氨酸残基和丝氨酸残基。因此，根据第一方面的一个实施例，o-糖基化氨基酸簇含有至少一个o-糖基化苏氨酸。优选地，所述簇包含苏氨酸和丝氨酸作为o-糖基化氨基酸。有趣地是，octa12的延伸肽含有两个邻位o-糖基化苏氨酸残基。因此，在一个实施例中，延伸肽含有至少两个邻位o-糖基化苏氨酸残基。如上所述，据信由o-聚糖产生的蛋白质表面的负电荷导致半衰期延长。不希望受理论束缚，据信为了表现该效应，需要两个或更多个紧邻的o-聚糖。如果o-聚糖之间的间隙太大，即在15个氨基酸中具有少于一个o-糖基化氨基酸，则该效应可能变弱或消失。因此，根据融合蛋白的一个实施例，至少一个延伸肽在15个氨基酸中含有至少一个o-糖基化氨基酸。更优选地，至少一个延伸肽在10个氨基酸中含有至少一个o-糖基化位点。如实例中所示，测试的延伸肽含有在8个氨基酸中具有一个o-糖基化位点的簇。因此，根据优选的实施例，一个或多个簇在8个氨基酸中含有至少一个糖基化位点。延伸肽的长度由两个不同方面限定。延伸肽必须足够长以含有促进o-糖基化氨基酸糖基化的识别位点。因此，延伸肽的长度应为至少10个氨基酸。另一方面，延伸肽越短，其越不可能干扰结构完整性或活性，从而影响主要蛋白质的治疗效果。因此，延伸肽不应超过100个氨基酸。根据一个实施例，一个或多个延伸肽的长度为15至60个氨基酸。为了使延伸肽内四个氨基酸被o-糖基化，长度优选地为22至40个氨基酸。更优选地，延伸肽的长度约为octa12中延伸肽的长度，即26至36个氨基酸。根据一个实施例，一个或多个延伸肽具有约31个氨基酸的长度。本发明人的发现并非仅导致了添加蛋白质中天然存在的o-糖基化肽的一个或多个拷贝以增加相同蛋白质或其片段的半衰期的原理的结论。除此之外，所提出的结果使人相信：vwf的特定o-糖基化肽——与ctp类似地——可以增加其他蛋白质(也就是普通蛋白质)的半衰期。因此，根据一个实施例，一个或多个延伸肽与人vwf的o-糖基化肽具有至少90％的序列同一性。该人vwf衍生的延伸肽可以与其他哺乳动物蛋白或其片段如fviii融合。一个或多个延伸肽与人vwf的o-糖基化肽的序列同一性优选地为至少95％。更优选地，序列同一性为至少98％。最优选地，延伸肽的序列与人vwf的o-糖基化肽相同。人vwf的o-糖基化肽优选地包括vwf的至少部分o-糖基化簇2(seqidno：2的氨基酸1238-1268)：qepgglvvpptdapvspttlyvedisepplh(seqidno：1)或其变体。因此，根据一个实施例，延伸肽与seqidno：1具有至少90％的序列同一性。与seqidno：1的序列同一性优选地为至少95％。更优选地，延伸肽与seqidno：1的序列同一性为至少98％。最优选地，一个或多个延伸肽与seqidno：1具有100％的序列同一性。主要蛋白质基于哺乳动物蛋白质，即含有与哺乳动物蛋白质或其片段相似或相同的氨基酸序列。哺乳动物蛋白质特别是人蛋白质。与主要蛋白质的氨基酸序列相似或相同的哺乳动物蛋白质可以是糖基化蛋白质。根据融合蛋白的一个实施例，主要蛋白质包含哺乳动物蛋白质的糖基化部分。根据另一个实施例，主要蛋白质包含至少一个o-糖基化氨基酸簇。该o-糖基化氨基酸簇可以与延伸肽中的o-糖基化氨基酸簇相同。主要蛋白质所基于的哺乳动物蛋白质更优选地为血液蛋白质。根据一个实施例，哺乳动物蛋白质是人血液蛋白质。哺乳动物血液蛋白可以是血液凝固因子、转运蛋白、蛋白酶抑制剂、免疫球蛋白、细胞相关血浆蛋白、载脂蛋白、补体因子、生长因子、抗血管生成蛋白、高度糖基化蛋白、血液因子或其他血液蛋白质。血液凝固因子，特别是人血液凝固因子，优选地选自纤维蛋白原(fi)、凝血酶原(fii)、组织因子(fiii)、fv、fvii、fviii、fix、fx、fxi、fxii、fxiii、vwf、以及adamts13。应理解，凝血因子fi、fii、fv、fvii、fviii、fix、fx、fxi、fxii和fxiii可以是非活性或活化形式。因此，在本发明的上下文中，对fi、fii、fv、fvii、fviii、fix、fx、fxi、fxii和fxiii的提及分别包括活化形式fia(纤维蛋白)、fiia(凝血酶)、fva、fixa、fviia、fviiia、fxa、fxia、fxiia和fxiiia，除非另有明确说明，或根据上下文在逻辑上排除活化形式。因此，例如，在这种情况下，fi、fii、fv、fix、fvii、fviii、fx、fxi、fxii和fxiii可以被读作fi/fia、fii/fiia、fv/fva、fvii/fviia、fviii/fviiia、fix/fxia、fx/fxa、fxi/fxia、fxii/fxiia和fxiii/fxiiia。转运蛋白，特别是人转运蛋白，可选自白蛋白、转铁蛋白、铜蓝蛋白、触珠蛋白、血红蛋白和血红素结合蛋白。根据一个实施例，哺乳动物蛋白质是蛋白酶抑制剂，特别是人蛋白酶抑制剂。该蛋白酶抑制剂的实例是β-抗凝血酶、α-抗凝血酶、前潜抗凝血酶、氧化抗凝血酶、2-巨球蛋白、c1-抑制剂、组织因子途径抑制剂(tfpi)、肝素辅助因子ii、蛋白c抑制剂(pai-3)、蛋白质c、蛋白质s和蛋白质z。免疫球蛋白的实例例如多克隆抗体(igg)、单克隆抗体、igg1、igg2、igg3、igg4、iga、iga1、iga2、igm、ige、igd和本琼氏蛋白。细胞相关的血浆蛋白可以是例如纤连蛋白、血栓球蛋白或血小板因子4。载脂蛋白的实例是apoa-i、apoa-ii和apoe。根据本发明的补体因子是例如因子b、因子d、因子h、因子i、c3b-灭活剂、备解素、c4结合蛋白等。生长因子的实例包括血小板衍生生长因子(pdgf)、表皮生长因子(egf)、转化生长因子α(tgf-α)、转化生长因子β(tgf-α)、成纤维细胞生长因子(fgf)和肝细胞生长因子(hgf)。抗血管抑制蛋白包括潜抗凝血酶、前潜抗凝血酶、氧化抗凝血酶和纤溶酶原。高度糖基化的蛋白质的实例是α-1-酸性糖蛋白、抗胰凝乳蛋白酶、内-α-胰蛋白酶抑制剂、α-2-hs糖蛋白、c-反应蛋白。血液因子可以是例如红细胞生成素、干扰素、肿瘤因子、tpa或gcsf。其他人血蛋白包括富含组氨酸的糖蛋白、甘露聚糖结合凝集素、c4结合蛋白、纤连蛋白、gc-球蛋白、纤溶酶原/纤溶酶、α-1微球蛋白、c-反应蛋白。哺乳动物蛋白质特别选自人vwf、纤维蛋白原、凝血酶原、fiii、fv、fvii、fviii、fix、fx、fxi、fxii、fxiii、adamts13、抗凝血酶、α-1抗胰蛋白酶、c1-抑制剂、抗胰凝乳蛋白酶、pai-1、pai-3、2-巨球蛋白、tfpi、肝素辅因子ii、蛋白z、蛋白c和蛋白s。人体中的因子viii由f8基因编码，f8基因在六个外显子中包含187,000个碱基对。转录的mrna具有9,029个碱基对的长度并且被翻译成从中除去19个氨基酸的具有2,351个氨基酸的蛋白质。人体中的fviii分子在31个氨基酸上糖基化，其中25个n-糖基化和6个o-糖基化(参见kannicht等,2013)。翻译后，氨基酸链在多个位置处被特异性蛋白酶切割，导致形成具有约200kda的重链和具有约80kda的轻链的。结构域组织通常表征为a1-a2-b-a3-c1-c2。轻链由结构域a3-c1-c2组成。重链主要由结构域a1-a2-b组成。在血浆中发现的重链具有分子量在90至200kda范围内的不均匀组成。其原因是其糖基化的异质性，剪接变体的存在和蛋白水解产物的存在，例如b结构域耗尽的重链a1-a2。全长fviii的氨基酸序列由uniprotkb的p00451的氨基酸20至2,351，1986年7月21日的序列版本1(在下面的uniprotkbp00451.1中)鉴定。根据一个实施例，与主要蛋白质相似或相同的哺乳动物蛋白质是由uniprotkbp00451.1的氨基酸20至2,351鉴定的人全长fviii。根据另一个实施例，主要蛋白质是fviii，其中缺失至少部分b结构域。在这方面，可能缺失整个b结构域。b结构域的缺失部分任选地被接头替换。接头序列特别具有以下氨基酸序列sfsqnsrhqayryrrg(seqidno：12)。其中b结构域被接头替换的fviii的实例是simoctocogα、或的活性成分。simoctocogα具有以下序列：atrryylgavelswdymqsdlgelpvdarfpprvpksfpfntsvvykktlfveftdhlfniakprppwmgllgptiqaevydtvvitlknmashpvslhavgvsywkasegaeyddqtsqrekeddkvfpggshtyvwqvlkengpmasdplcltysylshvdlvkdlnsgligallvcregslakektqtlhkfillfavfdegkswhsetknslmqdrdaasarawpkmhtvngyvnrslpgligchrksvywhvigmgttpevhsifleghtflvrnhrqasleispitfltaqtllmdlgqfllfchisshqhdgmeayvkvdscpeepqlrmknneeaedydddltdsemdvvrfdddnspsfiqirsvakkhpktwvhyiaaeeedwdyaplvlapddrsyksqylnngpqrigrkykkvrfmaytdetfktreaiqhesgilgpllygevgdtlliifknqasrpyniyphgitdvrplysrrlpkgvkhlkdfpilpgeifkykwtvtvedgptksdprcltryyssfvnmerdlasgligpllicykesvdqrgnqimsdkrnvilfsvfdenrswylteniqrflpnpagvqledpefqasnimhsingyvfdslqlsvclhevaywyilsigaqtdflsvffsgytfkhkmvyedtltlfpfsgetvfmsmenpglwilgchnsdfrnrgmtallkvsscdkntgdyyedsyedisayllsknnaieprsfsqnsrhqayryrrgeitrttlqsdqeeidyddtisvemkkedfdiydedenqsprsfqkktrhyfiaaverlwdygmsssphvlrnraqsgsvpqfkkvvfqeftdgsftqplyrgelnehlgllgpyiraevednimvtfrnqasrpysfysslisyeedqrqgaeprknfvkpnetktyfwkvqhhmaptkdefdckawayfsdvdlekdvhsgligpllvchtntlnpahgrqvtvqefalfftifdetkswyftenmerncrapcniqmedptfkenyrfhaingyimdtlpglvmaqdqrirwyllsmgsnenihsihfsghvftvrkkeeykmalynlypgvfetvemlpskagiwrvecligehlhagmstlflvysnkcqtplgmasghirdfqitasgqygqwapklarlhysgsinawstkepfswikvdllapmiihgiktqgarqkfsslyisqfiimysldgkkwqtyrgnstgtlmvffgnvdssgikhnifnppiiaryirlhpthysirstlrmelmgcdlnscsmplgmeskaisdaqitassyftnmfatwspskarlhlqgrsnawrpqvnnpkewlqvdfqktmkvtgvttqgvkslltsmyvkeflisssqdghqwtlffqngkvkvfqgnqdsftpvvnsldpplltrylrihpqswvhqialrmevlgceaqdly(seqidno:13)vwf是一种存在于哺乳动物血浆中的多聚体粘附糖蛋白，其具有多种生理功能。在止血初期，vwf充当血小板表面上的特定受体与细胞外基质的组分如胶原蛋白之间的介质。此外，vwf用作促凝血因子viii的载体和稳定蛋白。vwf在内皮细胞和巨核细胞中合成为2813个氨基酸的前体分子。vwf的结构域组织通常表征为til3-d3-til4-a1-a2-a3-d4-c1-c2-c3-ck。前体多肽(前体pro-vwf)由22个残基的信号肽，741个残基的前肽(结构域d1-d2)和在成熟血浆血管性血友病因子中发现的2050个残基的多肽组成(fischer等,1994)。全长vwf由uniprotkb的条目p04275(2017年4月12日的条目版本224)鉴定。根据本发明的人vwf具有所述uniprotkbp04275中任何序列的氨基酸序列，特别是seqidno：2(同种型1)。vwf含有两个o-糖基化氨基酸簇。在seqidno：2的氨基酸1238至1268之间发现第一o-糖基化氨基酸簇。第二簇包括seqidno：2的氨基酸1468至1487。在分泌到血浆中时，vwf以具有不同分子大小的各种物种的形式循环。这些vwf分子由2050个氨基酸残基的成熟亚基的寡聚体和多聚体组成。vwf通常可以在血浆中被发现为大小约500至20,000kda的多聚体(furlan等,1996)。根据一个实施例，主要蛋白质具有与人成熟vwf的序列相同或相似的氨基酸序列。根据另一个实施例，主要蛋白质具有与人vwf片段的序列相似或相同的氨基酸序列。例如，在人vwf的片段中，相对于人成熟vwf(til3-d3-til4-a1-a2-a3-d4-c1-c2-c3-ck)，可能缺失结构域a1、a2、a3、d4、c1、c2、c3、ck中的一个或多个。片段vwf片段可以例如具有选自til3-d3-til4-a1、til3-d3-til4-a1-a2、til3-d3-til4-a1-a2-a3、til3-d3-til4-a1-a2-a3-d4、til3-d3-til4-a1-a2-a3-d4-c1、til3-d3-til4-a1-a2-a3-d4-c1-c2、以及til3-d3-til4-a1-a2-a3-d4-c1-c2-c3-ck的结构域组织。在这方面，人vwf的片段尤其是以seqidno：2的氨基酸764开始的片段。seqidno：2的氨基酸764至1035包含vwf的fviii结合结构域。主要蛋白质可以例如含有wo2015/185758a2中定义的vwf片段。如wo2015/185758a2中所示，与单独fviii相比，fviii和其中定义的vwf片段的复合物表现出与磷脂膜的结合降低，并且与fviii和全长vwf的复合物相比，表现出与胶原iii和肝素的结合降低。优选地以seqidno：2的氨基酸764开始的vwf片段优选地以seqidno：2的1905至2153范围内的氨基酸终止。根据一个实施例，vwf片段以seqidno：2的2030至2153范围内的vwf的氨基酸终止。根据另一个实施例，vwf片段以seqidno：2的2100至2153范围内的氨基酸终止。根据一个实施例，主要蛋白质具有与seqidno：2的氨基酸764至1268相似或相同的氨基酸序列。根据一个实施例，主要蛋白质的氨基酸序列与seqidno：2的氨基酸764至1268具有至少90％的同一性。主要蛋白质的氨基酸序列也可以与seqidno：2的氨基酸764至1268具有至少95％的同一性。此外，主要蛋白质的氨基酸序列与seqidno：2的氨基酸764至1268的同一性可以是至少98％。特别地，主要蛋白质的氨基酸序列可以与seqidno：2的氨基酸764至1268具有100％的同一性。根据一个实施例，主要蛋白质具有与seqidno：2的氨基酸764至1905相似或相同的氨基酸序列。根据一个实施例，主要蛋白质的氨基酸序列与seqidno：2的氨基酸764至1905具有至少90％的同一性。主要蛋白质的氨基酸序列也可以与seqidno：2的氨基酸764至1905具有至少95％的同一性。此外，主要蛋白质的氨基酸序列与seqidno：2的氨基酸764至1905的同一性可以是至少98％。特别地，主要蛋白质的氨基酸序列可以与seqidno：2的氨基酸764至1905具有100％的同一性。融合蛋白可含有任何数量的延伸肽，例如一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个延伸肽。与vwf片段octa11相比，融合蛋白octa12含有两个延伸肽拷贝并显示出半衰期的显著增加。因此，根据一个实施例，融合蛋白含有至少两个延伸肽。目前应理解，半衰期延长效应至少部分地基于延伸肽的o-聚糖的负电荷。因此，延伸肽拷贝数量的增加导致半衰期延长效应的进一步增加。这由octa14证实，octa14含有四个延伸肽拷贝。因此，根据一个实施例，融合蛋白含有至少四个延伸肽。另一方面，利用延伸肽的拷贝数量，延伸肽干扰结构完整性或活性以及因此主要蛋白质的治疗效果的机会增加。因此，根据一个实施例，延伸肽的数量低于11。除主要蛋白质和延伸肽外，融合蛋白可包含其他肽组分。特别地，除了根据本发明的延伸肽之外，融合蛋白可以含有用于半衰期延长的其他肽，例如ctp、xten、转铁蛋白或其片段、白蛋白或其片段。主要蛋白质也可能是哺乳动物蛋白质的片段，融合蛋白质含有相同哺乳动物蛋白质的另一片段。特别地，两个片段被一个或多个延伸肽分开。这种蛋白质的实例是octa15，其含有vwf的氨基酸764至1268，两个具有序列seqidno：1的延伸肽和由seqidno：2的氨基酸2721至2813组成的vwf的“半胱氨酸结结构域”。在融合蛋白中，一个或多个延伸肽可以与主要蛋白质的n-末端或c-末端连接。具体地，融合蛋白可含有一个或多个与n-末端连接的延伸肽和一个或多个与主要蛋白质的c-末端连接的延伸肽。由于融合蛋白除主要蛋白质和一个或多个延伸肽外还可含有其他肽。因此，延伸肽可以直接或间接地与主要蛋白质连接。在这方面，“直接连接”是指主要蛋白质和延伸肽的氨基酸序列直接相邻。“间接连接”是指在主要蛋白质与延伸肽之间存在另外的肽。特别地，接头肽可位于主要蛋白质与延伸肽之间。接头可含有切割位点，使得延伸肽可从主要蛋白质切割。主要蛋白质，一个或多个延伸肽和任选地其他肽可以通过连接基因、cdna或编码它们的序列来产生。因此，主要蛋白质，一个或多个延伸肽和任选地其他肽通过肽键连接。根据本发明，融合蛋白的肽可以另通过其他接头如化学接头或糖苷键连接。优选地，融合蛋白的肽通过肽键连接。根据一个实施例，延伸肽与主要蛋白质的c末端直接连接。特别地，融合蛋白含有至少两个与主要蛋白质的c末端连接的连续延伸肽。融合蛋白可以与两个或多个亲和标签连接。亲和标签的实例是聚组氨酸、蛋白a、谷胱甘肽s转移酶、p物质、flag、链霉抗生物素蛋白和免疫球蛋白重链恒定区。虽然亲和标签通常形成完整构建体的氨基酸序列的一部分，但亲和标签不被认为是融合蛋白的一部分。一个或多个亲和标签优选地与融合蛋白的c-末端或n-末端连接。在融合蛋白与一个或多个亲和标签连接的情况下，融合蛋白优选地在亲和标签与蛋白质的其余部分之间含有切割位点，使亲和标签可切割，例如利用蛋白酶切割。根据一个实施例，一个延伸肽形成融合蛋白的n-末端。如上所述，所述延伸肽的n-末端氨基酸任选地与亲和标签连接。根据一个实施例，一个延伸肽形成融合蛋白的c末端。如上所述，所述延伸肽的c-末端氨基酸任选地与亲和标签连接。根据一个实施例，根据前述权利要求中任一项的融合蛋白，其中与主要蛋白质相比，融合蛋白包含至少4个，优选地至少8个，更优选地至少12个额外的o-聚糖。根据一个实施例，融合蛋白包含二聚化结构域；特别地，主要蛋白质包含二聚化结构域。在vwf中，二聚体通过ck-结构域的结合而形成。因此，在主要蛋白质是vwf片段的情况下，其优选地包含ck-结构域。根据本发明的代表性融合蛋白是octa12。octa12具有以下氨基酸序列(seqidno：3)：octa12是seqidno：2的氨基酸764至1268的vwf片段和两个与c-末端结合的由seqidno：2的氨基酸1238至1268组成的延伸肽拷贝(粗体)的融合蛋白。根据一个实施例，融合蛋白的氨基酸序列与seqidno：3具有至少90％的同一性。融合蛋白的氨基酸序列也可以与seqidno：3具有至少95％的同一性。此外，融合蛋白的氨基酸序列与seqidno：3的同一性可以是至少98％。特别地，融合蛋白的氨基酸序列可以与seqidno：3具有100％的同一性。以下序列(seqidno：4)代表具有另外12个氨基酸信号肽(粗体和下划线)的octa12。该肽的表达提供octa12的单体形式。信号肽被切除。根据一个实施例，融合蛋白的氨基酸序列与seqidno：4具有至少90％的同一性。融合蛋白的氨基酸序列也可以与seqidno：4具有至少95％的同一性。此外，融合蛋白的氨基酸序列与seqidno：4的同一性可以是至少98％。特别地，融合蛋白的氨基酸序列可以与seqidno：4具有100％的同一性。根据本发明的另一种代表性融合蛋白是包括具有信号肽(粗体和下划线)的octa12和前肽(粗体)的pro-octa12。pro-octa12由seqidno：5鉴定：pro-octa12的表达导致二聚体的形成。肽二聚体在切割前肽后保留。根据一个实施例，融合蛋白的氨基酸序列与seqidno：5具有至少90％的同一性。融合蛋白的氨基酸序列也可以与seqidno：5具有至少95％的同一性。此外，融合蛋白的氨基酸序列与seqidno：5的同一性可以是至少98％。特别地，融合蛋白的氨基酸序列可以与seqidno：5具有100％的同一性。根据本发明的另一种代表性融合蛋白是octa14。octa14具有以下氨基酸序列：octa14是seqidno：2的氨基酸764至1268的vwf片段和四个与c-末端结合的由seqidno：2的氨基酸1238至1268组成的延伸肽拷贝(粗体)的融合蛋白。根据一个实施例，融合蛋白的氨基酸序列与seqidno：6具有至少90％的同一性。融合蛋白的氨基酸序列也可以与seqidno：6具有至少95％的同一性。此外，融合蛋白的氨基酸序列与seqidno：6的同一性可以是至少98％。特别地，融合蛋白的氨基酸序列可以与seqidno：6具有100％的同一性。以下序列(seqidno：7)代表具有另外的12个氨基酸信号肽(粗体和下划线)的octa14。该肽的表达提供octa14的单体形式。信号肽被切除。根据一个实施例，融合蛋白的氨基酸序列与seqidno：7具有至少90％的同一性。融合蛋白的氨基酸序列也可以与seqidno：7具有至少95％的同一性。此外，融合蛋白的氨基酸序列与seqidno：7的同一性可以是至少98％。特别地，融合蛋白的氨基酸序列可以与seqidno：7具有100％的同一性。根据本发明的另一种代表性融合蛋白是包括具有信号肽(粗体和下划线)的octa14和前肽(粗体)的pro-octa14。pro-octa14由seqidno：8鉴定：根据一个实施例，融合蛋白的氨基酸序列与seqidno：8具有至少90％的同一性。融合蛋白的氨基酸序列也可以与seqidno：8具有至少95％的同一性。此外，融合蛋白的氨基酸序列与seqidno：8的同一性可以是至少98％。特别地，融合蛋白的氨基酸序列可以与seqidno：8具有100％的同一性。根据本发明的另一种代表性融合蛋白是octa15。octa15具有以下氨基酸序列：octa15是seqidno：2的氨基酸764至1268的vwf片段，两个与c-末端结合的由seqidno：2的氨基酸1238至1268组成的延伸肽拷贝(粗体)和由seqidno：2的氨基酸2721至2813组成的vwf的“半胱氨酸结结构域”的融合蛋白。根据一个实施例，融合蛋白的氨基酸序列与seqidno：9具有至少90％的同一性。融合蛋白的氨基酸序列也可以与seqidno：9具有至少95％的同一性。此外，融合蛋白的氨基酸序列与seqidno：9的同一性可以是至少98％。特别地，融合蛋白的氨基酸序列可以与seqidno：9具有100％的同一性。以下序列(seqidno：10)代表具有另外的12个氨基酸信号肽(粗体和下划线)的octa15。该肽的表达提供octa15的二聚体形式。信号肽被切除。根据一个实施例，融合蛋白的氨基酸序列与seqidno：10具有至少90％的同一性。融合蛋白的氨基酸序列也可以与seqidno：10具有至少95％的同一性。此外，融合蛋白的氨基酸序列与seqidno：10的同一性可以是至少98％。特别地，融合蛋白的氨基酸序列可以与seqidno：10具有100％的同一性。根据本发明的另一种代表性融合蛋白是包括具有信号肽(粗体和下划线)的octa15和前肽(粗体)的pro-octa15。该序列的表达将导致多聚体的形成。pro-octa15由seqidno：11鉴定：根据一个实施例，融合蛋白的氨基酸序列与seqidno：11具有至少90％的同一性。融合蛋白的氨基酸序列也可以与seqidno：11具有至少95％的同一性。此外，融合蛋白的氨基酸序列与seqidno：11的同一性可以是至少98％。特别地，融合蛋白的氨基酸序列可以与seqidno：11具有100％的同一性。根据本发明的一个实施例，融合蛋白是基于具有两个或更多个延伸肽拷贝的simoctocogα的修饰的fviii蛋白。在该实施例中，主要蛋白质优选地与fviii的重链相同或相似，特别是与uniprotkbp00451.1的氨基酸20至759相同或相似。具有与fviii的重链，特别是uniprotkbp00451.1的氨基酸20至759相同或相似的主要蛋白质的融合蛋白，优选地另外含有与seqidno：12相似或相同的接头和与uniprotkb条目p0045.1的氨基酸1668至2351所鉴定的轻链相似或相同的另外的氨基酸序列。延伸肽可以与轻链的c-末端融合。替代地，延伸肽位于重链与轻链之间。在这方面，延伸肽可以连接到接头的c-末端或n-末端。延伸肽也可以替换接头。此外，接头序列可以被一个或多个延伸肽中断。延伸肽也可能位于重链与轻链之间以及轻链的c-末端。优选地，基于simoctocogα的融合蛋白从n-末端到c-末端含有fviii的重链，接头的第一部分，两个或更多个，优选地三个延伸肽(粗体)，接头的第二部分(带下划线和粗体)和轻链。这种蛋白质的一个实例是由seqidno：14鉴定的蛋白质：根据一个实施例，融合蛋白的氨基酸序列与seqidno：14具有至少90％的同一性。融合蛋白的氨基酸序列也可以与seqidno：14具有至少95％的同一性。此外，融合蛋白的氨基酸序列与seqidno：14的同一性可以是至少98％。特别地，融合蛋白的氨基酸序列可以与seqidno：14具有100％的同一性。替代地，基于simoctocogα的融合蛋白含有两个或更多个，优选地三个连接到simoctocogα的c-末端的延伸肽(粗体)。这种蛋白质的实例是由seqidno：21鉴定的蛋白质。根据一个实施例，融合蛋白的氨基酸序列与seqidno：21具有至少90％的同一性。融合蛋白的氨基酸序列也可以与seqidno：21具有至少95％的同一性。此外，融合蛋白的氨基酸序列与seqidno：21的同一性可以是至少98％。特别地，融合蛋白的氨基酸序列可以与seqidno：21具有100％的同一性。多核苷酸根据第二方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，其包含编码根据本发明第一方面的融合蛋白的核酸序列。分离的多核苷酸可以是dna分子或rna分子。分离的多核苷酸优选地是dna分子，特别是cdna分子。用于分离或克隆编码肽的多核苷酸的技术是本领域已知的，包括从基因组dna中分离，从cdna制备，或其组合。从这种基因组dna克隆多核苷酸可以例如通过使用众所周知的聚合酶链反应(pcr)或表达文库的抗体筛选来进行以检测具有共有结构特征的克隆dna片段(参见例如innis等,1990)pcr：aguidetomethodsandapplication,academic出版社,纽约。可以使用其他核酸扩增程序，例如连接酶链反应(lcr)、连接活化转录(lat)和基于多核苷酸的扩增(nasba)。特别地，分离的多核苷酸的序列可包含编码主要蛋白质的第一部分和至少第二部分序列。第一部分优选地与seqidno：15相似或相同。第一部分优选地与seqidno：15具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性程度。所述至少第二部分优选地与seqidno：16类似或相同。所述第二部分优选地与seqidno：16具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性程度。分离的多核苷酸可以是编码融合蛋白的dna分子，该融合蛋白的氨基酸序列与选自由seqidno：4、seqidno：5、seqidno：7、seqidno：8、seqidno：10、seqidno：11、seqidno：14和seqidno：21组成的群组的序列相似或相同。特别地，分离的多核苷酸可以是编码融合蛋白的dna分子，所述融合蛋白具有与seqidno:4具有至少90％、优选地至少95％、更优选地至少98％、最优选地100％的同一性的氨基酸序列。替代地，分离的多核苷酸可以是编码融合蛋白的dna分子，所述融合蛋白具有至少90％同一性的氨基酸序列。此外，分离的多核苷酸可以是编码融合蛋白的dna分子，所述融合蛋白具有与seqidno：5具有至少90％、优选地至少95％、更优选地至少98％、最优选地100％的同一性的氨基酸序列。根据一个实施例，分离的多核苷酸是编码融合蛋白的dna分子，所述融合蛋白具有与seqidno：7具有至少90％、优选地至少95％、更优选地至少98％，最优选地100％的同一性的氨基酸序列。根据一个实施例，分离的多核苷酸是编码融合蛋白的dna分子，所述融合蛋白具有与seqidno：8具有至少90％、优选地至少95％、更优选地至少98％、最优选地100％的同一性的氨基酸序列。根据一个实施例，分离的多核苷酸是编码融合蛋白的dna分子，所述融合蛋白具有与seqidno：10具有至少90％、优选地至少95％、更优选地至少98％、最优选地100％的同一性的氨基酸序列。根据一个实施例，分离的多核苷酸是编码融合蛋白的dna分子，所述融合蛋白具有与seqidno：11具有至少90％、优选地至少95％、更优选地至少98％、最优选地100％的同一性的氨基酸序列。根据一个实施例，分离的多核苷酸是编码融合蛋白的dna分子，所述融合蛋白具有与seqidno：14具有至少90％、优选地至少95％、更优选地至少98％、最优选地100％的同一性的氨基酸序列。根据一个实施例，分离的多核苷酸是编码融合蛋白的dna分子，所述融合蛋白具有与seqidno：21具有至少90％、优选地至少95％、更优选地至少98％、最优选地100％的同一性的氨基酸序列。分离的多核苷酸可以是具有与选自由seqidno：17、seqidno：18、seqidno：19、seqidno：20和seqidno：22组成的群组的序列相似或相同的序列的dna分子。根据一个实施例，分离的多核苷酸的一条链与seqidno：17具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。根据另一个实施例，分离的多核苷酸与seqidno：18具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。根据又另一个实施例，分离的多核苷酸与seqidno：19具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。根据一个实施例，分离的多核苷酸与seqidno：20具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。根据一个实施例，分离的多核苷酸与seqidno：20具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。多核苷酸序列列表：seqidno：15编码octa11的dna(seqidno：2的aa1-1268)seqidno：16编码延伸肽的dna(seqidno：1)seqidno：17编码pro-octa12的dna(seqidno：5)seqidno：18编码pro-octa14的dna(seqidno：8)seqidno：19编码pro-octa15的dna(seqidno：11)seqidno：20编码在接头区域具有三个延伸肽的simoctocogα的dna(seqidno14)seqidno：22编码具有三个c-末端延伸肽的simoctocogα的dna序列(seqidno：21)表达载体在第三方面中，本发明还涉及包含根据本发明第二方面的多核苷酸的表达载体。表达载体还优选地包含控制元件如启动子，以及转录和翻译终止信号。根据第二方面的多核苷酸和控制元件可以连接在一起以产生重组表达载体，其可以包括一个或多个限制性位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的多核苷酸。可以将多核苷酸插入合适的表达载体中以进行表达。在产生表达载体时，编码序列位于表达载体中，使得编码序列与恰当的控制序列可操作地连接以进行表达。重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其可以方便地进行重组dna程序并且可以实现本发明第四方面的多核苷酸的表达。表达载体的选择通常取决于表达载体与将要导入表达载体的宿主细胞的相容性。表达载体可以是线性的或闭合环状的质粒。表达载体优选地适于在哺乳动物细胞中表达。表达载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。对于自主复制，载体可以进一步包含复制起点，使载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制。复制起点可以是介导在细胞中起作用的自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”是指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。载体优选地是当导入宿主细胞中时整合到基因组中并与其整合的染色体一起复制的载体。为了整合到宿主细胞基因组中，表达载体可以依赖于表达载体的任何其他元件以通过同源或非同源重组整合到基因组中。替代地，载体可含有用于指导通过同源重组在染色体中精确位置整合到宿主细胞基因组中的另外的多核苷酸。本发明的载体优选地含有一个或多个(例如几个)选择性标记，其允许容易地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞或类似细胞。选择性标记是一种基因，其产物提供杀生物剂或抗病毒性，对重金属的抗性，对营养缺陷型的原养型等。用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域技术人员熟知的(参见，例如，sambrook等，1989，同上)。根据一个实施例，根据第三方面的载体的载体骨架选自pcdna3、pcdna3.1、pcdna4、pcdna5、pcdna6、pcep4、pcep-puro、pcet1019、pcmv、pef1、pef4、pef5、pef6、pexchange、pexpr、pires和pscas。宿主细胞根据第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含根据本发明第三方面的表达载体。将根据第三方面的表达载体导入宿主细胞中，使得表达载体维持为染色体整合体或如前所述的自我复制的染色体外载体。术语“宿主细胞”包括由于在复制过程中发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码多肽的基因及其来源。根据一个实施例，融合蛋白通过在哺乳动物宿主细胞系中表达而产生。融合蛋白优选地在人宿主细胞系中产生。通常，任何人宿主细胞系都适合于融合蛋白的表达。融合蛋白的有利糖基化特别地用人肾细胞系获得。优选的人肾细胞系是hek细胞系，特别是hek293细胞系。用于产生糖基化多肽的hek细胞系的实例是hek293f、flp-intm-293(invitrogen,r75007)、293(crl-1573)、293ebna、293h(thermoscientific11631017)、293s、293t(crl-3216tm)、293t/17(crl11268tm)、293t/17sf(acs4500tm)、hek293stf(crl3249tm)、hek-293.2sus(crl-1573tm)。用于产生多肽的优选细胞系是hek293f细胞系。适合作为表达宿主细胞的其他细胞系包括衍生自人髓细胞白血病细胞的细胞系。宿主细胞的具体实例是k562、nm-f9、nm-d4、nm-h9d8、nm-h9d8-e6、nmh9d8-e6q12、gt-2x、gt-5s和衍生自任何所述宿主细胞的细胞。k562是存在于美国典型培养物保藏中心(atccccl-243)中的人髓细胞白血病细胞系。剩余的细胞系衍生自k562细胞，并且已经加以选择用于特定的糖基化特征。融合蛋白的用途如实例中所示，融合蛋白octa12和octa14中seqidno：1的延伸肽并非仅导致融合蛋白的半衰期增加(即与主要蛋白质、即vwf片段相比)。融合蛋白octa12和octa14当与fviii(vwf的结合配偶体)一起施用于患者时也会导致fviii的半衰期增加。因此，根据第五方面，本发明提供了根据第一方面的融合蛋白用于增加第二蛋白的半衰期的用途，其中所述融合蛋白能够结合所述第二蛋白。该用途还可以描述为一种用治疗性蛋白质治疗患者的方法，其中该方法包括施用治疗性蛋白质如fviii蛋白质和根据第一方面的融合蛋白。组合物和蛋白质复合物因此，根据本发明的概念，即由延伸肽提供的半衰期延长不限于融合蛋白，而且另外可以延长由融合蛋白结合的第二蛋白的半衰期。因此，根据第六方面，本发明提供一种第一蛋白质和第二蛋白质的组合物，其中所述第一蛋白质是根据第一方面的融合蛋白质并且能够结合所述第二蛋白质，并且所述第二蛋白质是治疗性蛋白质，其包含与第二哺乳动物蛋白质或其片段的氨基酸序列相同或相似的氨基酸序列。第一蛋白质可以共价或非共价结合第二蛋白质以形成复合物。因此，本发明还涉及一种第一蛋白质和第二蛋白质的复合物，其中所述第一蛋白质是根据第一方面的融合蛋白质，并且所述第二蛋白质具有与第二哺乳动物蛋白质或其片段的氨基酸序列相同或相似的氨基酸序列。因此，复合物通过第一蛋白质与第二蛋白质的非共价结合而形成。根据一个实施例，第一蛋白质共价结合第二蛋白质。促进第一和第二蛋白质结合的接头可选自二硫键、肽键、化学接头或糖苷键。替代地，第一蛋白质非共价结合第二蛋白质。对于非共价结合，第一蛋白质尤其可以包含特异性结合结构域，使其能够结合所述第二蛋白质，即第二蛋白质结合结构域。取决于一个或多个延伸肽在第一蛋白质序列中的位置，可以位于第一蛋白质的不同位置。优选地，一个或多个延伸肽位于暴露于折叠状态的蛋白质的表面的位置。一个或多个延伸肽可位于相对于第二蛋白质结合位点(诸如结合结构域)的任何位置。根据组合物的一个实施例，一个或多个延伸肽位于折叠状态的第一蛋白质的不干扰第一蛋白质与第二蛋白质结合的位置。根据一个实施例，与所述第二蛋白质的游离形式(例如fviii蛋白)相比，结合第一蛋白质(例如vwf片段)的第二蛋白质(例如fviii)的半衰期增加。优选地，与结合天然哺乳动物蛋白质(例如成熟的vwf)的所述第二蛋白质相比，结合第一蛋白质(例如octa12)的第二蛋白质(例如fviii蛋白)的半衰期增加。更优选地，与结合不具有融合肽的主要蛋白质(例如octa11)的所述第二蛋白质相比，结合第一蛋白质(例如octa12)的第二蛋白质(例如fviii蛋白)的半衰期增加。第二哺乳动物蛋白质可以选自针对上述哺乳动物蛋白质鉴定的相同列表。然而，在组合物或复合物中，第二哺乳动物蛋白质与第一哺乳动物蛋白质不同。根据一个实施例，第二哺乳动物蛋白质是血液蛋白质，特别是人血液蛋白质。优选地，第二哺乳动物蛋白质是凝血因子，特别是人凝血因子。根据一个实施例，与主要蛋白质相似或相同的第二哺乳动物蛋白质是由uniprotkbp00451.1的氨基酸20至2,351鉴定的人全长fviii。根据另一实施例，主要蛋白质是fviii，其中缺失至少部分b结构域。在这方面，可能缺失整个b结构域。b结构域的缺失部分任选地被接头替换。接头序列特别具有以下氨基酸序列sfsqnsrhqayryrrg(seqidno：12)。其中b结构域被接头替换的fviii的一个实例是simoctocogα(seqidno：13)、或的活性成分。根据一个实施例，fviii蛋白是人fviii蛋白，其在患者中具有降低的免疫应答。fviii蛋白的免疫应答降低优选地基于与siglecsig-5、sig-7、sig-8和sig-9的结合。不希望受理论束缚，据信与抗原呈递细胞(例如树突细胞)上的siglecs的结合导致细胞表面上的促炎受体表达的下调和免疫抑制受体表达的上调。此外，结合导致抗炎细胞因子的产生增加，降低促炎细胞因子的产生，并因此导致t细胞增殖和抗体产生受到抑制。因此，当将糖基化多肽施用于患者时，siglecsig-5、sig-7、sig-8和sig-9的结合导致免疫应答降低或免疫耐受性增加。siglec结合以及因此降低的免疫应答基于与天然存在的人fviii的唾液酸化核心2和/或扩展核心1o-聚糖的数量相比，糖基化蛋白质中唾液酸化核心2和/或扩展核心1o-聚糖的数量或百分比增加。因此，根据一个实施例，fviii蛋白质表现出与天然存在的人fviii的唾液酸化核心2和/或扩展核心1o-聚糖的数量相比，糖基化蛋白质中唾液酸化核心2和/或扩展核心1o-聚糖的数量或百分比增加。对于第二蛋白质是fviii蛋白质的情况，第一蛋白质的主要蛋白质优选地是包含fviii结合结构域的vwf片段，以使其能够结合fviii蛋白质。根据组合物的一个实施例，第一蛋白质具有与seqidno：3具有至少95％、优选地至少98％、更优选地100％的同一性的氨基酸序列，并且第二蛋白质具有与seqidno：13具有至少95％、优选地至少98％、更优选地100％的同一性的氨基酸序列。根据组合物的一个实施例，第一蛋白质具有与seqidno：6具有至少95％、优选地至少98％、更优选地100％的同一性的氨基酸序列，并且第二蛋白质具有与seqidno：13具有至少95％、优选地至少98％、更优选地100％的同一性的氨基酸序列。根据组合物的一个实施例，第一蛋白质具有与seqidno：9具有至少95％、优选地至少98％、更优选地100％的同一性的氨基酸序列，并且第二蛋白质具有与seqidno：13具有至少95％、优选地至少98％、更优选地100％的同一性的氨基酸序列。因为在患者的血液中，含有vwf片段的融合蛋白，特别是octa12，与内源性vwf竞争结合fviii蛋白，所以优选地是，该组合物包含含有vwf片段的融合蛋白，特别是octa12，与fviii蛋白相比摩尔过量。优选地，第一蛋白质与第二蛋白质的摩尔比为0.1至250，优选地0.5至50，更优选地1至25，最优选地2至10。为了形成稳定的非共价结合的复合物，并因此允许第二蛋白质的半衰期延长，第一蛋白质与由平衡解离常数(kd)定义的第二蛋白质的结合亲和力应低于10μm。优选地，第一蛋白质中vwf片段与fviii蛋白质的平衡解离常数为0.05至3nm。第一和第二蛋白质可以通过单独的重组表达，然后连接而产生。替代地，第一和第二蛋白质在相同细胞中重组表达。为此，第一和第二蛋白质可以由相同的载体编码或在两个不同的载体上编码。实例中使用的vwf构建体(即octa12、octa14和octa15)以其前蛋白的形式表达，导致二聚体形成或在octa15的情况下导致多聚体形成。即使在切割前肽后这些二聚体仍保持完整，因此二聚体中vwf构建体的每个拷贝都可以与fviii蛋白结合。因此，根据一个实施例，复合物含有两个拷贝的第一和第二蛋白质，其中两个拷贝的第一蛋白质形成二聚体。第一蛋白质的这个二聚体优选地是非共价结合的二聚体。药物组合物和医疗用途如上所述，根据第一方面的融合蛋白，根据第六方面的组合物和根据本发明的第七方面的复合物具有增加患者血液中半衰期并因此增加患者治疗效果的优点。因此，根据第一方面的融合蛋白，根据第六方面的组合物和根据第七方面的复合物可特别用作医学治疗的活性成分。优选地，它们可用于治疗或预防出血性疾病。根据第一方面的融合蛋白，根据第六方面的组合物，特别是本文所述的蛋白质复合物，可以单独施用或以药物组合物的形式施用。因此，根据第八方面，本发明提供了一种根据第一方面的融合蛋白，根据第六方面的组合物和根据第七方面的复合物的药物组合物。根据本发明，药物组合物可包含有效量的根据第一方面的融合蛋白，根据第六方面的组合物和根据第七方面的复合物，其配制有至少一种药学上可接受的载体。可以通过药学领域熟知的任何方法制备实施例的药物组合物并将其施用于受试者。参见，例如，goodman&gilman’sthepharmacologicalbasisoftherapeutics,hardman等,编著,mcgraw—hillprofessional(第10版,2001)；remington:thescienceandpracticeofpharmacy,gennaro,编著,lippincottwilliams&wilkins(第20版,2003)；和pharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems,ansel等(编著),lippincottwilliams&wilkins(第7版,1999)。此外，实施例的药物组合物还可以配制成包括其他医学上有用的药物或生物制剂。药物组合物通常包含治疗有效量的融合蛋白或蛋白质复合物与药学上可接受的载体。药学上可接受的载体是本领域已知或建立的任何载体。示例性的药学上可接受的载体包括无菌无热原水和无菌无热原盐水溶液。可用于本发明实施例的其他形式的药学上可接受的载体包括粘合剂、崩解剂、表面活性剂、吸收促进剂、保湿剂、吸收剂、润滑剂、填充剂、增量剂、水分赋予剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、增溶剂、控制渗透压的盐、通常取决于制剂的使用形式而使用的稀释剂如缓冲剂和赋形剂。它们根据所得制剂的单位剂量任选地选择和使用。因此，本发明的第九方面还涉及一种治疗或预防患者出血性疾病的方法，所述方法包括向所述患者施用根据第八方面的药物组合物。如本文所用，“出血性疾病”是指损害正常止血的疾病或病症。出血性疾病可以是，例如，血友病a、血友病b、因子viii缺乏症、因子xi缺乏症、血管性血友病、glanzmann血小板无力症、bernardsoulier综合征、特发性血小板减少性紫癜、脑内出血、创伤、创伤性脑损伤等。如本文所用，“血友病”是指与没有血友病的健康个体中的血凝形成时间相比血凝形成时间增加所相关的一组出血性疾病。血友病包括血友病a，这是一种导致产生缺陷因子viii的疾病，血友病b，这是一种导致产生缺陷因子ix的疾病和获得性血友病a，这是一种由对凝血因子(f)viii的自身抗体引起的罕见出血性疾病。出血性疾病优选地为血友病a或b。治疗可以是例如pups(先前未治疗的患者)的血友病治疗或免疫耐受诱导(iti)治疗和/或血友病的其他相关治疗。对于体内应用，药物组合物可以通过任何常规施用途径施用给患者，例如，口服、肠胃外或吸入。肠胃外施用包括静脉内注射、皮下注射、腹膜内注射、肌内注射、液体剂、悬浮液、乳液和滴落剂。对于肠胃外施用，药物组合物应该是注射剂，例如液体剂或悬浮液。在其他实施例中，将药物组合物口服施用给患者。在这些实施例中，药物的一种形式包括固体制剂，例如片剂、包衣片剂、粉末剂、颗粒、胶囊和丸剂、液体制剂(诸如液体剂，例如滴眼剂、滴鼻剂)、悬浮液、乳液和糖浆，吸入剂(诸如气雾剂、雾化器和喷雾器)，以及脂质体包合剂。在又一些其他实施例中，糖基化多肽、蛋白质复合物或药物组合物通过吸入施用到患者的呼吸道以靶向受试者的气管和/或肺。根据第八方面的一个实施例，所述用途包括静脉内或非静脉内注射。非静脉内注射优选地是皮下注射。本公开中引用的所有出版物和专利均通过引用整体并入。如果通过引用并入的材料与本说明书相矛盾或不一致，则说明书将取代任何此类材料。实例实例1-vwf蛋白的重组表达以下重组vwf蛋白在具有c-末端strep标签的hek细胞系293f中瞬时表达，并通过streptactin亲和层析(ibagmbh)纯化：-octa11-octa12octa12是根据本发明的融合蛋白。octa11是比较vwf片段。vwf蛋白质在图1中示意性地描绘。前蛋白的表达导致二聚体的形成。肽二聚体在切割前肽后也保留。基因合成和克隆作为第一步，编码vwf蛋白的前蛋白的基因由geneart(thermofisherscientific)合成：-pro-octa11-pro-octa12将编码前蛋白的基因克隆到含有twin-strep标签的pdsg表达载体(ibagmbh)中。top10大肠杆菌(ibagmbh)的单个培养物用载体构建体转化，并在37℃下在含氨苄青霉素的lb-琼脂平板上温育过夜后选择单个克隆。根据制造商的推荐，使用qiaampdnamini或maxi试剂盒(qiagen)进行质粒dna制备。通过测序，验证了载体的完整性，特别是编码pro-octa11，pro-octa12的基因的正确取向和完整性。蛋白质表达对于vwf蛋白的真核表达，使用4.5mg/ml25kda线性聚氮丙啶，用1.5mg/l构建体转染在mexi转染培养基(ibagmbh)中生长的mexi-293细胞(ibagmbh)。在37℃，5％co2和100-150rpm温育2-4小时后，培养物用mexi转染-培养基1:2稀释并继续培养直至细胞存活率达到75％。随后，通过在4℃和300×g下离心将上清液与细胞分离。为了最小化生物素在细胞培养基中的抑制作用并调节ph，将0.1体积的缓冲液(1mtris-hcl，1.5mmnacl，10mmedta，ph8.0)和0.09％(v/v)biolock溶液(ibagmbh)加入上清液中并在4℃下温育20分钟。蛋白质纯化离心后，将上清液施加在strep-tactinxt柱(ibagmbh)上，用洗涤缓冲液(100mmtris-hcl，150mmnacl，1mmedta，ph8.0)洗涤5次，并用洗脱缓冲液(100mmtris-hcl，150mmnacl，1mmedta，10mm脱硫生物素，ph8.0)洗脱含有结合strep-标签的蛋白质。实例2-全长vwf或vwf蛋白当与fviii共同施用给fviii/vwf双敲除(dko)小鼠时，对fviii半衰期的影响2.1背景在该实验中，测试了根据实例1产生的vwf蛋白和全长血浆衍生的vwf(pdvwf)对fviii半衰期的影响。已知全长vwf和fviii是形成非共价复合物的结合配偶体。fviii在循环中的半衰期主要由vwf的循环半衰期决定。如在血清中内源性vwf与施用的vwf蛋白(片段)竞争fviii结合，该竞争将影响施用的vwf蛋白对fviii半衰期的任何影响。因此，在本实验中，将fviii和vwf双敲除(fviii/vwf-dko)的c57bl/6小鼠用作用于评估vwf对fviii半衰期的影响的模型生物体。2.2实验程序2.2.1含fviii的产品生产以下含fviii的产品：1)仅fviii2)fviii和octa113)fviii和octa124)fviii和pdvwf如实例1中所述制备vwf蛋白octa11和octa12。pdvwf是vwf浓缩物wilate(octapharma)。fviii是b结构域缺失的人细胞系fviii(nuwiq,octapharma)。nuwiq产品包含以下缓冲组成：含有fviii的产物2)-4)中vwf蛋白与fviii的摩尔比为5:1。将vwf蛋白质添加至nuwiq产物(fviii)中。2.2.2fviii/vwf-dko小鼠品系使用fviii和vwf双敲除(fviii/vwf-dko)的c57bl/6小鼠。2.2.3产品的施用通过尾静脉输注将四种含有fviii的产物以240iufviii/kg(～6iu/小鼠)的剂量施用给20只fviii/vwf-dko小鼠。2.2.4采样和分析在用含有fviii的产品治疗后5分钟和1、4、8、12、24、36和48小时取小鼠的血样。从小鼠的眼眶后丛获得血液样品。对于每个时间点，获得每个含有fviii的产物的5只小鼠的血液样品并单独分析。每个小鼠在5分钟时间点取样并最多在另外两个时间点取样。使用显色测定法(chromogenix)分析每个血液样品中的fviii活性。2.3结果利用血液样品中的fviii活性值，确定每种含fviii产品的fviii活性的时间进程，如图2所示。对于每个时间点和含有fviii的产品，测量五只动物的血液样品，图2中的每个数据点代表5个值的平均值。此外，各个时间点的fviii活性以治疗后5分钟的fviii活性百分比给出，其定义为每种含有fviii的产品的100％活性。五种产品中fviii的半衰期使用各个血浆浓度-时间曲线的对数线性部分的线性回归分析在曲线拟合后或通过非线性回归使用一相指数衰减模型来计算。用于计算的软件程序是graphpadprism版本6.07(lajolla,ca92037usa)和winnonlin，版本6.4(pharsightcorporation,mountainview,ca,usa)。计算基于以下等式：kel＝消除率常数t1/2＝消除半衰期c＝浓度t＝时间结果总结在表1中。表1.dko小鼠中fviii的最终半衰期含有fviii的产品t1/2[h]1)·仅fviii0.072)fviii和octa110.453)fviii和octa121.034)fviii和flvwf0.32从这些数值可以明显看出，fviii与任何vwf蛋白的共同施用导致半衰期延长。fviii与pdvwf的共同施用导致fviii半衰期增加为～4.6倍(0.31)。与vwf蛋白octa11共同施用的fviii显示了0.45小时的相当的半衰期(增加为约1.4倍)。引人注目的是，与vwf蛋白octa12共同施用得到1.03小时的fviii半衰期，这表示与flvwf相比，增加为约3.2倍。与fviii相比，该因子为14.7倍。该结果表明，octa12中存在的额外o-聚糖重复导致对vwf片段以及继而对vwf/fviii复合物的显著半衰期延长影响。此外，该结果表明添加内在o-聚糖簇的拷贝可以增加蛋白质的半衰期。实例3-小型猪iv和皮下(sq)施用后fviii和vwfocta12的药代动力学特征3.1背景药物的皮下递送在凝血因子领域变得越来越令人关注。然而，由于回收非常低，该途径尚不适用于fviii的施用。由于与表皮的人体结构非常相似，因此小型猪是测试药物皮下施用的最有名的动物模型。该实验的目的是评估vwfocta12和fviii当通过皮下途径对小型猪单独施用或与5倍摩尔过量的octa12施用时的半衰期。此外，将fviii当通过常规iv途径单独施用时的半衰期与在具有或不具有vwfocta12下sq施用的fviii进行比较。3.2实验程序本研究使用9只年龄为10至14个月的雌性aachener小型猪。体重在13.7与19.5kg之间。iv注射在侧耳静脉中进行，皮下注射在腹股沟区域的皮肤下进行。剂量为100ufviii/kgbw，每组3只动物用每种产品治疗：-第1组：仅fviiisq-第2组：含octa12的fviiisq-第3组：仅fviiiiv为了每只动物获得2×200μl柠檬酸钠血浆和取样时间，在以下时间点从所有动物的颈静脉收集足够的血液：每次施用后0(给药前)、0.5、1、2、4、8、24、32、48、72、96和120小时。将全血取样至含有柠檬酸钠(0.15m)作为抗凝血剂的管中，并立即使用isotherm-rack系统(eppendorf)冷却。在抽血30分钟内通过离心分离血浆。离心后立即将血浆样品冷冻并在≤-20℃下储存直至运输。使用asserachrom测定试剂盒(diagnosticastago)测试每个样品的fviii抗原。使用elisa测定法如下定量octa12；将xt涂布的微孔板(ibagmbh)用封闭缓冲液(1％bsa的pbs)在室温下封闭2小时。将血浆样品在封闭缓冲液中1:15稀释并施加在平板上。在37℃温育2小时后，用抗vwfpab(dakop0226)检测vwf片段。每次温育后，将平板用0.1％tween的pbs溶液洗涤3次。使用winnonlin，版本6.4(pharsightcorporation,mountainview,ca,usa)进行分析数据的药代动力学评估。3.3结果图3显示了sq施用fviii/vwfocta12混合物后小型猪血浆中vwfocta12浓度的时间进程。如表2所总结，octa12循环，半衰期为219.31小时。如实施例2中所述测定半衰期。表2.小型猪中vwfocta12抗原的药代动力学参数。该值代表三只动物的平均值±sd。cmax最高测量血浆浓度tmaxcmax的最大时间t1/2最终半衰期在血管性血友病(vwd)猪中，全长重组人(rhvwf)的半衰期为约10-16小时，血浆衍生的猪vwf的半衰期为10-18小时(nichols等)。如yee等所示，在vwf缺陷小鼠中，仅含有fviii结合结构域的vwf片段的半衰期短于flvwf的半衰期。因此，在猪中，octa12的半衰期比rhvwf的半衰期长，为约14-22倍。此外，还观察到对fviii半衰期的显著延长影响。如图4所示并表3中所总结，当与octa12共同施用时，fviii具有25.3小时的半衰期，与通过相同途径(sq)单独施用的fviii相比，其表示半衰期增加为6.7倍，与通过常规iv途径单独施用的fviii相比，增加为3.9倍。表3.小型猪中fviii抗原的药代动力学参数。该值代表三只动物的平均值±sd。本发明所属领域的技术人员将会想到本文所阐述的本发明的许多修改和其他实施例，其具有前述说明书和相关附图中呈现的教导的益处。因此，应该理解，本发明不限于所公开的特定实施例，并且修改和其他实施例旨在包括在所附权利要求的范围内。尽管本文采用了特定术语，但它们仅在一般性和描述性意义上使用，而不用于限制的目的。参考文献birkens,canfieldre.isolationandaminoacidsequenceofcooh-terminalfragmentsfromthebetasubunitofhumanchoriogonadotropin.jbiolchem.1977；vol.252pg.5386–5392ewensteinbm,collinsp,tarantinomd,negrierc,blanchettev,shapiroad,bakerd,spottsg,senselm,yise,gompertsed.hemophiliatherapyinnovationdevelopmentofanadvancedcategoryrecombinantfactorviiibyaplasma/albumin-freemethodproceedingsofaspecialsymposiumatthexixthcongressoftheinternationalsocietyonthrombosisandhaemostasis；2004,vol.41,pg.1-16.fischerb,mitterera,schlokatu,denbouwmeesterr,dorner“structuralanalysisofrecombinantvonwillebrandfactor:identificationofhetero-andhomo-dimers”ffebslett.1994sep12；351(3):345-8.erratumin:febslett1994oct24；353(3):337.furlanm.“vonwillebrandfactor:molecularsizeandfunctionalactivity”annhematol.1996jun；72(6):341-8.kannichtc,ramstromm,kohlag,etal.characterisationofthepost-translationalmodificationsofanovel,humancellline-derivedhumanfactorviii.thrombres.2013；131(1):78–88.needlemansb,wunschcd.ageneralmethodapplicabletothesearchforsimilaritiesintheaminoacidsequenceoftwoproteins.jmolbiol.1970；vol.48(3)；pg.443-453.nicholstc,bellingerda,merricksep,etal.porcineandcaninevonwillebrandfactorandvonwillebranddisease:hemostasis,thrombosis,andatherosclerosisstudies.thrombosis.2010；2010:461238.strohlwr.fusionproteinsforhalf-lifeextensionofbiologicsasastrategytomakebiobetters.biodrugs.2015aug；vol.29(4),pg.215-239.tiedea.half-lifeextendedfactorviiiforthetreatmentofhemophiliaa.jthrombhaemost.2015jun；vol.13suppl1；pg.s176-179vlotaj,koppelmansj,meijersjc,damac,vandenberghm,boumabn,sixmajj,willemsgm.kineticsoffactorviii-vonwillebrandfactorassociation.blood.19961；vol.87(5)；pg.1809-1816yeea,gildersleeverd,gus,kretzca,mcgeebm,carrkm,pipesw,ginsburgd.avonwillebrandfactorfragmentcontainingthed’d3domainsissufficienttostabilizecoagulationfactorviiiinmice.blood.2014jul17；vol.124(3)；pg.445-452.innisetal,1990pcr:aguidetomethodsandapplication,academicpress,newyork.序列表<110>octapharmaag<120>用于改善fviii药代动力学的vwf肽<130>4830/p/1098-wo<160>22<170>patentinversion3.5<210>1<211>31<212>prt<213>智人<400>1glngluproglyglyleuvalvalproprothraspalapr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