用于药物递送和稳定化的复合物及其制备方法与流程

本发明涉及一种用于药物递送和稳定化的复合物及其制备方法，更具体地，涉及用于稳定适配体-l-x缀合物[aptameur-药物缀合物]的复合物及其制备方法，所述复合物通过使用连接子(l)将治疗材料(x)(具有治疗效果)附接到适配体上而制备，以利用适配体的靶向能力，从而长时间在体内保护适配体。
背景技术：
：胰腺癌是一种绝望的癌症，其生存率没有显著的变化，因为数十年来尚未出现任何明确的治疗方法。其原因被认为是胰腺癌是臭名昭著的癌症，对传统抗癌化学品或新的免疫抗癌药物化学品制剂的反应很小，并且作为胰腺癌典型特征的肿瘤周围的纤维组织干扰免疫治疗反应。85％的患者在最后阶段被发现并且涉及高复发率，每天出现15名新胰腺癌患者并有14名患者死亡。胰腺癌的基本化疗目前是单独使用吉西他滨。迄今为止，选择用于治疗的任何现有化学疗法只能确保局部晚期胰腺癌的平均存活时间为8-12个月，对于转移性胰腺癌为3-6个月。在过去的12年中，已经进行了通过吉西他滨和许多药物的联合疗法来治疗胰腺癌，然而，与单独使用吉西他滨相比，几乎没有获得显著的益处。然而，仍在执行吉西他滨起主要作用的同时，两种或三种类型药物的联合疗法。在这方面，问题在于该疗法应该仅依赖于吉西他滨还是应该进行涉及可替选药剂的联合疗法。此外，虽然看似根据分子生物学致癌过程的识别，在向引入各种靶向治疗剂迈进，但其效果实质上不明显。出于这样的原因，越发迫切需要开发生物靶向治疗剂和新型细胞毒性药物。此外，应继续发掘新药和开发联合疗法用于临床试验，并且也将需要用于缓解剧烈疼痛和恶病质的治疗方法。乳腺癌是包括美国和欧洲等的发达国家中女性癌症当中最常见的癌症，并且是40-55岁年龄的美国女性的第一位主要死亡原因。9名女性中的一名在一生中会发生乳腺癌，并且患者数量有每年增加约15％的趋势。在韩国，1995年乳腺癌占女性癌症患者的11.9％，是继宫颈癌和胃癌之后的第三位常见癌症，并且显示出继胃癌、肝癌、子宫癌和肺癌之后的第五位高死亡率，并且其频率趋于每年在增加。肝癌是国内外社会经济方面的重大疾病。关于2012年韩国的癌症死亡率，肝癌是癌症相关死亡的第二大常见原因，每100,000人中有22.5人死于肝癌。特别是，已知韩国由于乙型肝炎的流行率高，所以肝癌的发病率高。此外，已知由于肝癌导致的收入损失在多种癌症中引起的社会经济损失最大，因此迫切需要开发有效的治疗剂。目前开发的标准治疗剂包括，例如，索拉非尼(sorafenip)，其是口服应用的抗癌靶向治疗剂并且已被证明抑制不同的细胞物质，因此有效治疗肝癌。然而，即使这些治疗剂具有治疗效果，它们也达到了限度，因为生存时间的增加仅为2-3个月。在由于西方饮食而导致结肠直肠癌迅速增加的情况下，已经尝试手术或化疗作为结肠直肠癌的治疗方法。5-氟尿嘧啶(5-fu)是选择用于治疗结肠直肠癌的主要抗肿瘤化合物，但已被证明仅在有限范围内有效。5-fu可暂时减小结直肠癌的大小，但很少有证据表明患者的生存期显著延长或“治愈”(基于5年缓解期)。用5-fu化疗用于疾病扩散到肝脏的患者，然而，仅在25％或更少的此类病例中观察到暂时改善，并且对总体存活率没有显著影响。此外，近年来，在韩国人中甲状腺癌特别地出现迅速增加的情况下，过度手术正在成为问题。用于治疗癌症的药物大多呈现严重的副作用或毒性。最近，已开发出与癌症相关受体特异性结合的适配体，并且该适配体单独或与其他药物联合正处于治疗包括乳腺癌在内的各种癌症的临床试验下。本发明人已经开发了一种特异性结合her-2受体的适配体，并将其公开在美国专利公布no.us9409515b2中。特别地，这种适配体具有靶向功能，并且当适配体与具有抗癌效果的一些物质x例如药物、毒素、寡核苷酸药物(sirna、mirna、反义寡核苷酸等)、蛋白、酶、纳米粒子等缀合时，适配体可以将上述物质例如药物递送到靶标的癌细胞。然而，这种适配体-l-x缀合物(适配体-药物缀合物)在体内不稳定，并且在许多情况下不能恰当表现其原始功能。类似地，诸如关节炎药物的其它药物需要在药物与适配体缀合时能够在体内稳定药物的技术。技术实现要素：【技术问题】因此，本发明的目的是提供一种可以弥补现有药物的缺点的治疗剂及其制剂，以及使用其的治疗。特别地，本发明的另一个目的是稳定在体内不稳定的适配体-l-x缀合物(适配体-药物缀合物)，从而获得优异的治疗效果。【技术方案】本发明人发现，当适配体-l-x缀合物(例如，适配体-药物缀合物)与缺端胶原组合而形成缺端胶原-(适配体-l-x缀合物)复合物并使用该复合物时，所述适配体-l-x缀合物可以在体内稳定以使其效果最大化，在该发现的基础上完成了本发明。也就是说，提供了新型缺端胶原介导的局部适配体-连接子-药物缀合物递送系统。换句话说，本发明涉及一种包含缺端胶原-[适配体-x]复合物的药物稳定化复合物，其中x是选自由药物、毒素、寡核苷酸药物(sirna、mirna、反义寡核苷酸等)、蛋白(抗体)、酶和纳米粒子组成的组中的至少一种。【有利效果】本发明的复合物在体内是稳定的并且表现出优异的治疗效果，包括抗癌效果。附图说明图1示出了根据本发明的实施方式的as1411和阿霉素反应后的as1411-dox(阿霉素)加合物的室温下hplc。图2示出了根据本发明实施方式的as1411-dox加合物的u紫外-可见光吸收光谱。图3示出了根据本发明实施方式的erbb2适配体-sirna缀合物。图4是显示根据本发明实施方式的缺端胶原-[适配体-药物缀合物]复合物(溶胶-凝胶型)的照片。图5是显示根据本发明实施方式的缺端胶原-[适配体-药物缀合物]复合物(贴剂型)的照片。图6是显示根据本发明实施方式的缺端胶原-[适配体-药物缀合物]复合物(支架型)的电子显微照片。图7是显示测量cy3-as1411-gem缀合物和缺端胶原-[cy3-as1411-gem缀合物]复合物(溶胶-凝胶型)的体内稳定性的结果的照片(图7a)和图线(图7b)。图8是显示根据本发明实施方式的缺端胶原-[适配体-药物缀合物]复合物(贴剂型)的照片。图9是显示根据本发明该实施方式的缺端胶原-[适配体-药物缀合物]复合物(贴剂型)的体内稳定性试验结果的照片。图10是显示根据本发明实施方式的缺端胶原-[适配体-药物缀合物]复合物(支架型)的照片(图10a)和电子显微照片(sem图像)(图10b)。图11是显示根据本发明该实施方式的缺端胶原-[适配体-药物缀合物]复合物(支架型)的体内稳定性的试验结果的照片。图12是显示根据本发明实施方式的缺端胶原-[cy3-as1411-gem缀合物]复合物(支架型)的照片(图12a)和电子显微照片(sem图像)(图12b)。图13是示出as1411、cro、吉西他滨、as1411-gem(吉西他滨)缀合物和cro-gem缀合物对胰腺癌细胞系的功效检查结果的图线。图14是示出as1411、cro、吉西他滨、缺端胶原-[as1411-gem缀合物]和缺端胶原-[cro-gem缀合物]对胰腺癌细胞系的功效检查结果的图线。图15示出了erbb2适配体-sirna缀合物和sirna之间乳腺癌细胞系输送功效的比较结果。图16示出了erbb2适配体-sirna缀合物和sirna对乳腺癌细胞系的体外功效检查结果。图17示出了缺端胶原-[erbb2适配体-sirna缀合物]复合物对乳腺癌细胞系的体外功效检查结果。图18示出了as1411-dox加合物和cro-dox加合物对肝癌细胞系的体外功效检查结果。图19示出了缺端胶原-[as1411-dox加合物]复合物对肝癌细胞系的体外功效检查结果。图20示出了通过注射器在胰腺癌小鼠中直接注射2.0mgas1411-gem缀合物和0.5％去端肽胶原复合物后肿瘤大小随时间的测量结果。图21示出了通过注射器将仅缺端胶原直接注射到胰腺癌小鼠中的肿瘤后肿瘤大小随时间的测量结果。图22是示出在不同浓度的缺端胶原-[as1411-gem缀合物]复合物下肿瘤大小的变化的图线。图23是示出切除的肿瘤的大小的比较结果的照片(图23a)和图(图23b)。图24是显示在肿瘤周围植入的缺端胶原-[as1411-gem缀合物]复合物(贴剂型)和缺端胶原-[as1411-gem缀合物]复合物(支架型)的照片。图25是示出分别在肿瘤周围植入缺端胶原-[as1411-gem缀合物]复合物(贴剂型，a)、缺端胶原-[as1411-gem缀合物]复合物(支架型，b)、缺端胶原-[cro-gem缀合物]复合物(贴剂型，c)和缺端胶原-[cro-gem缀合物]复合物(支架型，d)之后肿瘤大小随时间变化的比较结果的照片(图25a)和图线(图25b)。图26是示出将缺端胶原-[erbb2适配体-sirna缀合物]复合物直接注射到乳腺癌小鼠中后肿瘤大小随时间的变化的比较结果的图。图27是显示比较切除的肿瘤的大小的照片。图28是示出分别在肿瘤周围植入缺端胶原-[erbb2适配体-sirna缀合物]复合物(贴剂型，a)、缺端胶原-[erbb2适配体-sirna缀合物]复合物(支架型，b)、缺端胶原-[对照erbb2适配体-sirna缀合物]复合物(贴剂型，c)和缺端胶原-[对照erbb2适配体-sirna缀合物]复合物(支架型，d)之后肿瘤大小随时间变化的比较结果的图线。图29是示出分别将缺端胶原-[as1411-dox加合物]复合物(溶胶-凝胶型)和缺端胶原-[cro-dox加合物]复合物(溶胶-凝胶型)直接注射到肝癌小鼠中之后肿瘤大小随时间的变化的比较结果的图。图30是显示比较切除的肿瘤的大小的照片。具体实施方式本发明的药物稳定化复合物可包括缺端胶原-[适配体-l-x缀合物]复合物。本文中，x表示具有治疗效果例如抗癌效果、抗炎效果等的任何物质，例如药物、毒素、sirna、肽、蛋白质药物和纳米材料等，并且可以在不限于此的多种应用中使用，只要该物质具有治疗效果即可。当缀合为适配体-l-x(适配体-药物缀合物)时，适配体具有靶向功能并因此将药物递送至靶部位，例如癌细胞或炎症部位。如果将上述缀合物与缺端胶原组合，则所生成的产物可在体内稳定化，从而展现出进一步改善的治疗效果。缺端胶原、适配体和抗癌活性物质x的量可取决于适配体的类型、患者的体重、待治疗的肿瘤的大小、或肿瘤与皮肤之间的距离等，其可适当地调整。本发明的缺端胶原-[适配体-l-x]复合物(即，缺端胶原-[适配体-药物缀合物]复合物)并不特别限于特定的适配体，而是可以使用不同的适配体以‘缺端胶原-[适配体-l-x缀合物]复合物(即，缺端胶原-[适配体-药物缀合物]复合物)’的形式产生。在以复合体(即“复合物”)的形式产生的情况下，可以预期适配体的稳定性和抗癌效果改善。本发明的复合物可取决于适配体和抗癌活性物质的类型，用于治疗多种癌症，包括胰腺癌、乳腺癌、肝癌等。当然，本发明的复合物可以应用于其他治疗剂，例如关节炎药物。本发明的组合物可以各种制剂使用，包括例如：溶胶-凝胶型；注射产品，其可以直接放入癌症或关节炎部位以使其能够通过体温固化并允许药物从其缓慢释放；可以附着于目标部位的移植材料例如贴片、植入物等。因此，本发明的组合物尤其可用于在手术前减小肿瘤大小和/或在手术后除去剩余的癌细胞，而在放疗期间没有副作用或排异。【发明的优选实施方式】本发明将通过下面的实施例更详细地描述。实施例1.医用高浓度缺端胶原分散体的制备向naoac/hac溶液(1.2gch3coona，27.5mlch3cooh在50ml中)添加3wt％的高浓度缺端胶原后，在维持ph3.0的同时，搅拌混合物并使其完全溶解。通过切向流过滤(tff)将溶液在pbs溶液中进行透析过滤，从而制备pbs溶液中的医用缺端胶原分散体。适配体-连接子-药物缀合物合成实施例2.抗核仁素gro适配体-连接子-吉西他滨缀合物[as1411-gem缀合物]的合成通过使马来酰亚胺己酰基-(gly-phe-leu-gly)-吉西他滨[mc-gflg-吉西他滨]与hs-c6-tttggtggtggtggttgtggtggtggtgg[hs-c6-t3-as1411]反应，合成吉西他滨-(gly-leu-phe-gly)-mal-s-c6-tttggtggtggtggttgtggtggtggtgg[吉西他滨-(glfg-mc-s-c6)-t3-as1411，as1411-gem缀合物]。换句话说，使rss-c6-tttggtggtggtggttgtggtggtggtgg[rss-c6-t3-as141])在dtt存在下进行还原反应约3小时，用centricon除去剩余的dtt并用sb17缓冲溶液替换。将溶于少量dmso中的mal-gplg-吉西他滨放入所生成的产物中后，将混合物振荡过夜。通过反相hplc进行纯化(waters-xbridgeostc1810×50mm，65，teae/acn缓冲液)，从而得到吉西他滨-(glfg-mc-s-c6)-t3-as1411[as1411-gem缀合物]。通过esi-ms，确定吉西他滨-(glfg-mc-s-c6-t3-as1411[as1411-gem缀合物]的分子量。c334h422f2n117o198p29s[计算的mw＝10211.90观察的mw＝10211.87]实施例3.抗核仁素cro适配体-连接子-吉西他滨缀合物[cro-gem缀合物]的合成通过使马来酰亚胺己酰基-(gly-phe-leu-gly)-吉西他滨[mc-gflg-吉西他滨]与hs-c6-tttcctcctcctccttctcctcctcctcc[hs-c6-t3-cro]反应，合成吉西他滨-(gly-leu-phe-gly)-mal-s-c6-tttcctcctcctccttctcctcctcctcc[吉西他滨-(glfg-mc-s-c6)-t3-cro，cro-gem缀合物]。换句话说，使rss-c6-tttcctcctcctccttctcctcctcctcc[rss-c6-t3-cro]在dtt存在下进行还原反应约3小时，用centricon除去剩余的dtt并用sb17缓冲溶液替换。将溶于少量dmso中的mal-gplg-吉西他滨放入所生成的产物中后，将混合物振荡过夜。通过反相hplc(waters-xbridgeostc1810×50mm，65，teae/acn缓冲液)进行纯化，从而得到吉西他滨-(glfg-mc-s-c6)-t3-cro[cro-gem缀合物]。通过esi-ms，确定吉西他滨-(glfg-mc-s-c6)-t3-cro[cro-gem缀合物]的分子量。c317h422f2n83o198p29s[计算的mw＝9531.49观察的mw＝9532.09]。实施例4.抗核仁素gro适配体-阿霉素加合物[as1411-dox加合物]的合成通过as1411与阿霉素-hcl(美他环素(adramycin)-hcl)反应，合成as1411-dox加合物。换句话说，将20μm的gro、150μm的阿霉素-hcl和0.37％甲醛放入0.5ml缓冲溶液(20mm磷酸钠，150mmnacl，0.5mmedta；ph7.0)中并在10℃下振荡过夜的同时进行反应。反应后，通过反相hplc(waters-xbridgeostc1810×50mm，0.1mteae/acn缓冲液，260nm，490nm)进行分离/纯化。分离/纯化后，将生成的产物浓缩并通过centricon(millipore，mw3000截止值)脱盐。通过hplc保留时间、uv-vis光谱和esi-ms鉴定as1411-dox加合物(图1和图2)。实施例5.cro适配体-阿霉素加合物[cro-dox加合物]的合成通过使对照适配体与阿霉素-hcl(美他环素-hcl)反应，合成对照-dox加合物。换句话说，将20μm的对照适配体、150μm的阿霉素-hcl和0.37％甲醛放入0.5ml缓冲液(20mm磷酸钠，150mmnacl，0.5mmedta；ph7.0)中并在10℃下振荡过夜的同时进行反应。反应后，通过反相hplc(waters-xbridgeostc1810×50mm，0.1mteae/acn缓冲液，260nm，490nm)进行分离/纯化。分离/纯化后，将生成的产物浓缩并通过centricon(millipore，mw3000截止值)脱盐。通过hplc保留时间、uv-vis光谱和esi-ms鉴定cro-dox加合物(图1和图2)。实施例6.erbb2适配体-sirna缀合物的合成从以本发明人的名义提交的专利申请no.kr10-1279584和us9309515b2中描述的erbb2适配体[a6g66agag666gcc6gag6gcc6cgcaagggcg6aacaa，6＝napdu[5-(n-萘基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷]]，合成erbb2适配体-sirna缀合物。合成靶向细胞中bcl-2的sirna，使得在其末端部分具有马来酰亚胺基团。此外，erbb2适配体的末端通过将其修饰为硫醇基团来合成。使硫醇化的适配体和马来酰亚胺-sirna与8mm磺基-smpb反应，并通过在37℃下与溶于pbs中的10mmtcep反应1小时来激活erbb2适配体。通过centri-sep柱纯化后制备上述两种物质。将这些物质充分混合，然后在37℃反应2小时。最后，将这两种已完成缀合的物质进行page纯化，并通过紫外分光光度计进行定量(图3)。缺端胶原-[适配体-药物缀合物]复合物的制备实施例7.缺端胶原-[适配体-药物缀合物]复合物组合物(溶胶-凝胶型)的制备将通过合成制备的适配体-药物缀合物放入pbs中，并在室温下用混合器使其完全溶解。将如上所述制备的试剂与以0.5-3.0％的适当浓度的高浓度缺端胶原分散体混合，然后在室温下用旋转套装置处理30分钟以制备混合物溶液。缺端胶原-[适配体-药物缀合物]复合物(溶胶-凝胶型)在低温下处于液态(溶胶)。另一方面，当直接注射到体内肿瘤中时，该复合物在37℃下固结形成凝胶，使得适配体-药物缀合物(溶胶-凝胶型)周围的缺端胶原逐渐熔化并且药物可以缓慢释放以作为有效的肿瘤治疗剂(图4)。1)胰腺癌：缺端胶原-[as1411-gem缀合物]复合物(溶胶-凝胶型)2)乳腺癌：缺端胶原-[erbb2适配体-sirna缀合物]复合物(溶胶-凝胶型)3)肝癌：缺端胶原-[as1411-dox加合物]复合物(溶胶-凝胶型)实施例8.缺端胶原-[适配体-药物缀合物]复合物组合物(贴剂型)的制备使用上面制备的高浓度胶原分散体和合成的适配体-药物缀合物，以与形成溶胶-凝胶型产物相同的方式制备混合物溶液。将制备好的混合物溶液放入48孔细胞培养板中并使其扩散而形成厚度为0.5mm的均匀膜后，将膜在负(-)80℃下冷冻。将冷冻样品在冷冻干燥器中冻干，维持在-70℃下30小时，从而产生多孔膜(图5)。实施例9.缺端胶原-[适配体-药物缀合物]复合物组合物(支架型)的制备使用采用合成的适配体-药物缀合物以及作为生物相容性和生物降解性天然聚合物的缺端胶原分散体，制备具有三维(3d)结构(支架型)的缺端胶原-[适配体-药物缀合物]复合物。通过降解缺端胶原产生的适配体-药物缀合物与癌细胞结合，使得缀合物可以选择性地作用于癌细胞。在制备中，3d绘图仪采用了无固体形式制作工艺。此外，制备方法包括：将缺端胶原-[适配体-药物缀合物]复合物混合物溶液引入配备有精确喷嘴(直径：300μm)的桶中；并将桶固定在板上，在37℃下使用3d绘图仪以300±50kpa的排出压力和5mm/s的浮动速率，从而制作3层的3d缺端胶原-[适配体-药物缀合物]复合物(支架型)。此外，形成网格结构的细胞载体以增加孔隙效率，并制备不同浓度(0.5wt％、1.5wt％和3.0wt％)的缺端胶原，从而产生可以控制细胞载体的机械强度或降解速率的3d缺端胶原-[适配体-药物缀合物]复合物(支架型)。为了缺端胶原-[适配体-药物缀合物]复合物(支架型)和细胞载体之间的交联，使用京尼平。更具体地，将上述两种物质在1％京尼平溶液中在20℃的条件下交联24小时(图6)。体内稳定性验证实施例10.缺端胶原-[适配体-药物缀合物]复合物组合物(溶胶-凝胶型)的体内稳定性试验[表1]编号处理处理浓度1阴性对照2.0％缺端胶原2阳性对照10μmcy3-as1411-gem缀合物3样品(1)10μmcy3-as1411-gem缀合物&2.0％缺端胶原4样品(2)10μmcy3-as1411-gem缀合物&0.3％缺端胶原以特定浓度制备了cy3-标记的as1411-gem缀合物[cy3-as1411-gem缀合物]和缺端胶原-[cy3-as1411-gem缀合物]复合物(溶胶-凝胶型)，如上表所示。将预处理的cy3-as1411-gem缀合物和缺端胶原-[cy3-as1411-gem缀合物]复合物(溶胶-凝胶型)中的每种注入每只裸鼠的皮下层中。之后，根据按日期测量荧光亮度水平的方法，观察有多少cy3-as1411-gem缀合物维持在稳定状态。为此，使用荧光测量装置ivis，以3-4天的间隔测量荧光水平。通过分析获得的结果，能够看出，当将cy3-as1411-gem缀合物单独注射到动物中时，缀合物基本上从上述缀合物被引入的身体部位扩散到动物的全身，荧光在1天内消失。另一方面，当将缺端胶原-[cy3-as1411-gem缀合物]复合物(溶胶-凝胶型)和缺端胶原一起注射时，观察到低浓度的缀合物在数天内缓慢扩散，而高浓度的cy3-as1411-gem缀合物在最多35天内仍有相当的量保留在注射部位。因此，在cy3-as1411-gem缀合物和缺端胶原的复合物的情况下，证明与单独施用缀合物相比，复合物可以相当稳定地保留在体内(图7a和图7b)。实施例11.缺端胶原-[适配体-药物缀合物]复合物组合物(贴剂型)的体内稳定性实验将cy3-标记的as1411-gem缀合物[cy3-as1411-gem缀合物]和缺端胶原-[cy3-as1411-gem缀合物]冻干形成片。使用浓度为0.5％、1.5％和3.0％的各缺端胶原，将片制成5mm和8mm大小(图8)。将制备的片植到每只小鼠的外皮层上后，目测测量降解速率。观察到0.5％和1％浓度的片在5天内熔化并被吸收。此外，1.5％浓度的片在5天后部分保留，并在第8天完全熔化。此外，观察到3％浓度的片即使在8天后仍未完全熔化(图9)。实施例12.缺端胶原-[适配体-药物缀合物]复合物组合物(支架型)的体内实验使用缺端胶原通过3d绘图仪制作3d网格结构的细胞载体。更具体地，使用浓度为0.5％、1.5％和3.0％的缺端胶原，制作尺寸为5×5×2mm3和10×10×2mm3的细胞载体。此外，为了控制体内降解速率，将细胞载体在1-乙基-(3-3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液(edc，sigmachemicalco.，st.louis，mo，usa)中交联24小时。或者，使用京尼平作为生物相容性材料交联细胞载体以形成支架。将如上所述获得的支架使用超声磨机用蒸馏水洗涤，然后在-50℃冻干(图10a和图10b)。将交联的支架以与上述进行的方法相同的方式移植到小鼠的外皮层上，并随时间观察。证实即使在移植后过8天时也未观察到显著的降解。因此，证明了由于交联导致降解速率明显降低(图11)。将cy3-as1411-gem缀合物携带在支架上，以在之后通过电子显微镜进行观察(图12)。体外功效验证实施例13.适配体-药物缀合物对胰腺癌的体外功效对胰腺癌细胞系，即bxpc3、miapaca-2、panc-1和capan-1，进行wst-1测定。通过wst-1测定在体外进行as1411-gem缀合物对胰腺癌细胞系的细胞抑制功效验证。首先，分别制备没有与抗癌剂结合的裸露形式的对照适配体cro、具有癌细胞靶向功能的as1411、以及与对胰腺癌有效的抗癌剂、即吉西他滨组合的cro-gem缀合物和as1411-gem缀合物(表2)。[表2]gem＝吉西他滨，n＝1至10在通过wst-1测定比较细胞活力和细胞增殖中，证实as1411适配体比作为对照适配体的cro的功效好得多，并且进一步显示出比单独使用原始抗癌剂、即吉西他滨治疗的情况更优异的功效。实验过程：将每种胰腺癌细胞系，即bxpc3、miapaca-2、panc-1和capan-1(atcc，rpmi+10％fbs)，以1至2×104细胞/孔的细胞数量(这是为了确定合适的细胞浓度通过细胞测试法限定的)接种于96孔板上，然后使其生长1天。将适配体和适配体-药物缀合物分别溶解在pbs中，并立即在每个孔中以0.1μm直至100μm的浓度处理。将处理过的细胞在5％co2培养箱中温育72小时，分别用10μl用于wst-1测定(wst-1，roche)的试剂溶液处理，然后使用elisa读数器测量440nm处的吸光度(图13)。实施例14.缺端胶原-[适配体-药物缀合物]复合物对胰腺癌的体外功效进行对胰腺癌细胞系、即miapaca-2和mcf-7的wst-1测定。通过wst-1测定在体外进行缺端胶原-[as1411-gem缀合物]复合物对胰腺癌细胞系的细胞抑制功效验证。首先，分别制备没有与抗癌剂结合的裸露形式的对照适配体cro、具有癌细胞靶向功能的as1411、以及与对胰腺癌有效的抗癌剂、即吉西他滨组合的缺端胶原-[as1411-gem缀合物]复合物和缺端胶原-[cro-gem缀合物]复合物。在通过wst-1测定比较细胞活力和细胞增殖中，证实缺端胶原-[as1411-gem缀合物]复合物比缺端胶原-[cro-gem缀合物]复合物的功效好得多，并且进一步显示出比单独使用原始抗癌剂、即吉西他滨治疗的情况更优异的功效。实验过程：将每种胰腺癌细胞系，即miapaca-2和mcf-7(atcc，rpmi+10％fbs)，以1至2×104细胞/孔的细胞数量(这是为了确定合适的细胞浓度通过细胞测试法限定的)接种于96孔板上，然后使其生长1天。将适配体和缺端胶原-[适配体-药物缀合物]复合物分别溶解在pbs中，并立即在每个孔中以0.1μm直至100μm的浓度处理。将处理过的细胞在5％co2培养箱中温育72小时，分别用10μl用于wst-1测定(wst-1，roche)的试剂溶液处理，然后使用elisa读数器测量440nm处的吸光度(图14)。实施例15.erbb2适配体-药物缀合物对乳腺癌的体外功效为了鉴定对乳腺癌靶细胞的靶向，制备在sirna处用cy3修饰的erbb2适配体-连接子-sirna-cy3、以及作为对照组的sirna-cy3。用这两种合成物质分别处理erbb2过表达的mcf7细胞系，然后通过荧光显微镜观察。在包括未处理的对照组和仅与cy3组合的对照组的sirna对照组情况下，细胞不显示荧光。另一方面，仅在与erbb2适配体组合的试验组中，细胞显示出荧光。通过分析这样的结果，可以发现sirna可通过适配体的靶向准确地递送给靶细胞(图15)。另外，进行了对乳腺癌细胞系、即bt-474和mcf-7的wst-1测定。通过wst-1测定在体外进行了erbb2适配体对乳腺癌细胞系的细胞抑制功效验证。在用没有活性的对照erbb2适配体、以及erbb2适配体-sirna缀合物(其中具有优异抗癌功效的有效抗癌剂、即sirna与具有癌细胞靶向功能的erbb2靶适配体结合)的分别处理乳腺癌细胞系后，进行wst-1测定。在细胞活力和细胞增殖的比较中，证明erbb2适配体-sirna缀合物具有比erbb2适配体好得多的功效，从而验证了在乳腺癌细胞系中的优异功效(图16)。实施例16.缺端胶原-[适配体-药物缀合物]复合物对乳腺癌的体外功效通过wst-1测定在体外进行缺端胶原-[erbb2适配体-sirna缀合物]复合物对乳腺癌细胞系、即bt-474和mcf-7的细胞抑制功效验证。在用裸erbb2、没有活性的缺端胶原-[对照适配体-sirna缀合物]复合物、以及缺端胶原-[erbb2适配体-sirna缀合物]复合物(其中具有优异抗癌功效的有效抗癌剂、即sirna与具有癌细胞靶向功能的erbb2靶适配体结合)分别处理乳腺癌细胞系后，进行wst-1测定。在细胞活力和细胞增殖的比较中，证实了erbb2适配体-sirna缀合物具有比对照组、即缺端胶原-[对照适配体-sirna缀合物]复合物适配体好得多的功效，从而验证了在乳腺癌细胞系中的优异功效(图17)。实施例17.as1411-dox加合物对肝癌的体外功效以与上面执行的相同的方式，通过wst-1测定在体外进行作为适配体-药物缀合物的as1411-dox加合物以及作为对照适配体的对照-dox加合物对乳腺癌细胞系、即hepg2和huh-7的细胞抑制功效验证。从结果确认，as1411-dox加合物具有比对照-dox加合物好得多的功效，从而验证了该组合物的活性性能(图18)。实施例18.缺端胶原-[适配体-药物缀合物]复合物对肝癌的体外功效以与实施例17中所述的相同的方式，制备肝细胞系，并将制备的乳腺癌细胞系分别用具有抗癌效果的缺端胶原-[as1411-dox加合物]复合物、没有靶向功能的缺端胶原-[cro-dox-adduct]复合物和缺端胶原-dox处理，然后通过wst-1测定进行功效验证。正如预测，结果显示，与对照组、即缺端胶原-[cao-dox-加合物]复合物相比，具有靶向功能的缺端胶原-[as1411-dox加合物]复合物具有显著的功效。此外，在单独施用dox以及胶原的情况下，观察到由于非选择性细胞渗透引起的细胞抑制(图19)。体外功效验证实施例19.缺端胶原-[as1411-gem缀合物]复合物(溶胶-凝胶型)在胰腺癌动物模型中的功效验证动物模型的准备：准备6周龄balb/c雌性裸鼠作为体内肿瘤模型。实验中使用的小鼠的平均重量为20g。人源性胰腺癌细胞系，即capan-1细胞购自atccco.，并被增殖。通过将增殖的capan-1细胞以多达5×107细胞的量皮下注射到小鼠中以形成肿瘤。通过在注射后2-3周每天观察，目视检查肿瘤的生长，并使用卡尺测量肿瘤的大小。复合物的功效验证：在肿瘤生长至合适的大小后，将如下表3中所示的每种缺端胶原-[as1411-gem缀合物]复合物(溶胶-凝胶型)通过注射器直接注射到每只小鼠中生长肿瘤的部位(表3)。[表3]此外，为了确定缺端胶原-[as1411-gem缀合物]复合物(溶胶-凝胶型)的抗癌效果，在预定的时间段内观察肿瘤大小的变化和植入物重量的变化(图20和图21)。与对照组、即单独注射0.5％缺端胶原的情况相比，上述实验组显示出显著的癌症抑制功效，并且观察到抗癌效果随着更高的浓度而增加(图22)。在复合物移植后过30天的时间，从每组切除肿瘤。对所有切除的肿瘤进行重量测量和拍照，然后将实际肿瘤尺寸相互比较(图23)。实施例20.缺端胶原-[as1411-gem缀合物]复合物(贴剂型)和缺端胶原-[as1411-gem缀合物]复合物(支架型)在胰腺癌动物模型中的功效验证[表4]处理浓度处理数存活小鼠数缺端胶原-[as1411-gem缀合物]复合物(贴剂型)33缺端胶原-[as1411-gem缀合物]复合物(支架型)33缺端胶原-[cro-gem缀合物]复合物(贴剂型)33缺端胶原-[cro-gem缀合物]复合物(支架型)33dpbs0.5％缺端胶原33以与实施例19中所述相同的方式制备肿瘤动物模型，然后，分别将通过与实施例8和9中所述相同的方法制备的缺端胶原-[as1411-gem缀合物]复合物(贴剂型)和缺端胶原-[as1411-gem缀合物]复合物(支架型)移植到肿瘤动物模型中的肿瘤周围(图24)。为了确定移植的缺端胶原-[as1411-gem缀合物]复合物(贴剂型)和缺端胶原-[as1411-gem缀合物]复合物(支架型)的抗癌效果，在预定的时间段内观察肿瘤大小的变化和植入物重量的变化。从结果来看，确认了缺端胶原-[as1411-gem缀合物]复合物(支架型)具有比缺端胶原-[as1411-gem缀合物]复合物(贴剂型)好得多的抗癌功效(图25)。实施例21.缺端胶原-[erbb2适配体-sirna缀合物]复合物(溶胶-凝胶型)在乳腺癌动物模型中的功效验证动物模型的准备：准备6周龄balb/c雌性裸鼠作为体内肿瘤模型。实验中使用的小鼠的平均重量为20g。人源性胰腺癌细胞系，即bt-474细胞购自atccco.，并被增殖。通过将增殖的bt-474细胞以多达1×107细胞的量皮下注射到小鼠中以形成肿瘤。通过在注射后2-3周每天观察，目视检查肿瘤的生长，并使用卡尺测量肿瘤的大小。[表5]缺端胶原-[erbb2适配体-sirna缀合物]复合物(溶胶-凝胶型)的功效验证：在肿瘤生长到合适的大小后，将如上表5中所示的缺端胶原-[erbb2适配体-sirna缀合物]复合物(溶胶-凝胶型)通过注射器直接注射到每只小鼠中生长肿瘤的部位。此外，为了确定缺端胶原-[erbb2适配体-sirna缀合物]复合物(溶胶-凝胶型)的抗癌效果，在预定的时间段内观察肿瘤大小的变化和植入物重量的变化。与对照组、即单独注射0.5％缺端胶原的情况相比，观察到显著的癌症抑制功效(图26)。在注射缺端胶原-[erbb2适配体-sirna缀合物]复合物(溶胶-凝胶型)后过30天的时间，从每组切除肿瘤。对所有切除的肿瘤进行拍照，然后将实际肿瘤尺寸相互比较(图27)。实施例22缺端胶原-[erbb2适配体-sirna缀合物]复合物(贴剂型)和缺端胶原-[erbb2适配体-sirna缀合物]复合物(支架型)在乳腺癌动物模型中的功效验证以与实施例21中所述相同的方式制备肿瘤动物模型，然后，分别将通过与实施例7和8中所述相同的方法制备的缺端胶原-[erbb2适配体-sirna缀合物]复合物(贴剂型)和缺端胶原-[erbb2适配体-sirna缀合物]复合物(支架型)移植到肿瘤动物模型中肿瘤的周围。为了确定移植的缺端胶原-[erbb2适配体-sirna缀合物]复合物(贴剂型)和缺端胶原-[erbb2适配体-sirna缀合物]复合物(支架型)的抗癌效果，在预定的时间段内观察肿瘤大小的变化和植入物重量的变化。从结果来看，确认了缺端胶原-[erbb2适配体-sirna缀合物]复合物(支架型)具有比缺端胶原-[erbb2-gem缀合物]复合物(贴剂型)好得多的抗癌功效(图28)。实施例23.缺端胶原-[as1411-dox加合物]复合物(溶胶-凝胶型)在肝癌动物模型中的功效验证动物模型的准备：准备6周龄balb/c雌性裸鼠作为体内肿瘤模型。实验中使用的小鼠的平均重量为20g。人源性肝癌细胞系，即huh-7细胞购自atccco.，并被增殖。通过将增殖的huh-7细胞以多达5×106细胞的量皮下注射到小鼠中以形成肿瘤。通过在注射后2-3周每天观察，目视检查肿瘤的生长，并使用卡尺测量肿瘤的大小。[表6]缺端胶原-[as1411-dox加合物]复合物(溶胶-凝胶型)的功效验证：肿瘤长到适当的大小后，将如上表6所示的缺端胶原-[as1411-dox加合物]复合物(溶胶-凝胶型)，通过注射器直接注射到每只小鼠中生长肿瘤的部位。此外，为了确定复合物的抗癌效果，在预定的时间段内观察肿瘤大小的变化和植入物重量的变化。与对照组、即单独注射0.5％缺端胶原以及没有活性的缺端胶原-[cro-dox加合物]复合物(溶胶-凝胶型)的情况相比，观察到缺端胶原-[as1411-dox加合物]复合物(溶胶-凝胶型)具有显著的癌症抑制功效(图26)。在移植缺端胶原-[as11-dox加合物]复合物(溶胶-凝胶型)后过30天的时间，从每组切除肿瘤。对所有切除的肿瘤进行拍照，然后将实际肿瘤尺寸相互比较(图30)。【工业实用性】本发明的复合物在体内稳定，并可应用于抗癌治疗剂和抗炎治疗剂。当前第1页12