本发明涉及药物制剂领域，具体涉及的是一种单环刺螠纤溶酶口服纳米粒及其制备方法。
背景技术：
溶栓疗法被认为是治疗血栓性疾病最为有效的方法，溶栓药物也早已广泛应用于各种血栓性疾病的治疗。以尿激酶、组织型纤溶酶原激活剂(t-pa)为代表的临床溶栓剂虽然有效，但存在许多副作用，限制了其在临床的使用。因此，寻找更安全、更有效的溶栓药物，一直是学者们研究的目标。
最新研究发现，单环刺螠纤溶酶具有直接溶解血栓和激活纤溶酶原的双重溶栓作用，其主要特点是溶栓效果好，与现有溶栓物质相比，具有纤维蛋白特异性，不易诱发全身性纤维蛋白溶解，但同时也存在半衰期短、体内外易失活等缺点。因此，将单环刺螠纤溶酶制剂化的技术问题是此类药物的稳定性差，容易在胃肠道降解失活，体内生物利用度低。
目前，单环刺螠纤溶酶的制剂研究尚处于起步阶段，文献报道的相关制剂多为注射剂，其保存时间短，进入人体内后药物无包载，首过效应显著，选择性差。口服纳米粒作为一种新型药物剂型，近年来被越来越多地应用于蛋白、多肽及基因类药物的包载。通过制备口服纳米载药系统，能提高患者的顺应性，解决许多制剂技术难题，能防止药物被胃肠道的酸和酶破坏，有效提高药物稳定性和生物利用度。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种单环刺螠纤溶酶口服纳米粒，药物的毒副作用小、稳定性高、体内生物利用度高。
本发明的目的还在于提供一种单环刺螠纤溶酶口服纳米粒的制备方法，制备得到的单环刺螠纤溶酶口服纳米粒具有良好的包封率和载药量，粒径分布均匀。
为了达成上述目的，本发明的解决方案是：
一种单环刺螠纤溶酶口服纳米粒，按质量用量计，其处方包括如下用量比的组分：
所述高分子材料为天然高分子材料和生物可降解合成高分子材料中的一种或几种的混合，所述天然高分子材料为明胶、壳聚糖、海藻酸盐或者葡聚糖，所述生物可降解合成高分子材料为聚乳酸、聚己内酯酸。
所述高分子材料为α-巯基壳聚糖和聚丙烯酸钠-5100的混合物，所述α-巯基壳聚糖与所述聚丙烯酸钠-5100的质量用量比为1:2。
所述表面活性剂为烷基聚葡糖苷0810、木质素磺酸钠、(-)-双烷基双磺酸基二苯甲烷中的一种或几种的混合。
所述表面活性剂为烷基聚葡糖苷0810和(-)-双烷基双磺酸基二苯甲烷的混合物，所述烷基聚葡糖苷0810与所述(-)-双烷基双磺酸基二苯甲烷的质量用量比为3:1。
所述抗氧剂为2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、硫代二丙酸二月桂酯和硫代二丙酸二硬脂醇酯中的一种或几种的混合，所述抗氧剂的质量用量为所述单环刺螠纤溶酶的处方量的15％。
所述磷脂类物质为2-(甲基丙烯酰氧基)乙基-2-(三甲基氨基)乙基磷酸酯，所述单环刺螠纤溶酶与所述磷脂类物质的质量用量比为6:55，所述磷脂类物质与所述高分子材料的质量比为12:11。
所述冻干保护剂为糖类、白蛋白、聚乙二醇和丙二醇嵌段聚醚中的一种或几种的混合，所述冻干保护剂的质量用量为所述单环刺螠纤溶酶的处方量的50％。
一种单环刺螠纤溶酶口服纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)将处方量的高分子材料在25℃水浴条件下溶解于有机溶剂中，恒温磁力搅拌至完全溶解，溶解后所得高分子有机溶液的浓度为2.5mg/ml～20mg/ml；
(2)将处方量的单环刺螠纤溶酶溶解于上述所得的高分子有机溶液中，35℃～50℃下恒温水浴60min，所得单环刺螠纤溶酶高分子溶液的浓度为0.5mg/ml～5mg/ml，将单环刺螠纤溶酶高分子溶液作为油相，待用；
(3)将处方量的磷脂类物质溶于4％有机溶剂中，然后加入处方量的表面活性剂，用玻璃棒搅拌至完全溶解，于35℃～80℃下恒温水浴60min、55r·min-1下进行减压旋转蒸发除去有机溶剂，将此溶液作为水相，待用；
(4)在25℃下，向上述所得水相中加入处方量的抗氧剂，置于37℃恒温水浴振荡器中振摇30min；
(5)将油相以0.5ml/min～4ml/min的速度滴加入恒温磁力搅拌的水相中，使得油相与水相的体积比为1:2～1:12，磁力搅拌时，搅拌速度为2000rpm，温度为15℃～80℃，时间为30min；
(6)滴加结束后，继续搅拌2h，完全除去有机溶剂，得到纳米粒溶液；
(7)将除去有机溶剂的纳米粒溶液放入0.22um透析袋中透析12h，加入处方量的冻干保护剂，冷冻干燥10h，即得所述单环刺螠纤溶酶口服纳米粒。
步骤(2)中，恒温水浴的温度优选为50℃；步骤(3)中，恒温水浴的温度优选为80℃；步骤(5)中，将油相优选以4ml/min的速度滴加入恒温磁力搅拌的水相中，油相与水相的体积比优选为1:6，磁力搅拌时，温度优选为35℃。
采用上述技术方案后，本发明制备得到的单环刺螠纤溶酶口服纳米粒的粒径为100-200nm，包封率为80％以上，载药量在5.30％～19.35％，本发明具有以下优点，以高分子材料为载体，磷脂类物质作为磷脂材料，单环刺螠纤溶酶作为模型药物，采用高压乳匀法制备成具有良好生物相容性的纳米粒，可使单环刺螠纤溶酶在胃肠道中不被破坏，能降低其首过效应，减少不良反应，提高了其稳定性；同时添加了表面活性剂的纳米粒可提高药物的脂溶性，使单环刺螠纤溶酶更易透过生物膜进入血脑屏障，有效提高单环刺螠纤溶酶的生物利用度。
进一步，本发明采用l9(34)正交表进行处方筛选，以颗粒的粒径及包封率作为评价指标，对影响较大的因素进行处方正交实验，主要考察的因素及水平见表1，其中因素a为单环刺螠纤溶酶与磷脂类物质的质量比(m/m)；因素b为磷脂类物质与高分子材料的质量比(mg/mg)；因素c为高分子材料中α-巯基壳聚糖(α-tcs)和聚丙烯酸钠-5100(mw-5100)的质量比(mg/mg)；因素d为表面活性剂中烷基聚葡糖苷0810与(-)-双烷基双磺酸基二苯甲烷的质量比(m/m)。
表1正交实验设计的因素与水平设定
按表1中的设计的比例，分别制备不同规格的单环刺螠纤溶酶纳米口服粒，具体制备方法如下：
先将高分子材料α-巯基壳聚糖和聚丙烯酸钠-5100在25℃条件下溶解于有机溶剂二氯甲烷中，溶解后所得高分子有机溶液的浓度为2.5mg/ml～20mg/ml；将单环刺螠纤溶酶溶解于上述高分子有机溶液中，35℃～50℃恒温水浴60min，所得单环刺螠纤溶酶有机溶液的浓度为0.5mg/ml～5mg/ml，将此溶液作为油相备用；将磷脂类物质2-(甲基丙烯酰氧基)乙基-2-(三甲基氨基)乙基磷酸酯溶于4％有机溶剂丙二醇中；加入1.5ml20mg/ml的表面活性剂烷基聚葡糖苷0810、(-)-双烷基双磺酸基二苯甲烷，80℃恒温水浴60min，55r·min-1下进行减压旋转蒸发除去有机溶剂，将此溶液作为水相备用；在25℃下，向上述所得水相中加入抗氧剂2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚，置于37℃恒温水浴振荡器中振摇30min；将油相以4ml/min的速度滴加入磁力恒温搅拌的水相中，油相与水相的体积比为1:6；磁力搅拌时，搅拌速度为2000rpm，温度设定为35℃，时间设定为30min；滴加完后继续搅拌2h以完全除去有机溶剂，得到纳米粒溶液；将除去有机溶剂的纳米粒溶液加入0.22um透析袋中透析过夜12h，加入冻干保护剂丙二醇嵌段聚醚，冷冻干燥，即得单环刺螠纤溶酶口服纳米粒，实验结果见表2。
表2正交设计表l9(34)及实验结果
注：k1、k2、k3为综合评分指标。
表3粒径差分析
表4包封率方差分析
*p<0.05
由正交实验可得，单环刺螠纤溶酶口服纳米粒制备处方中的影响因素由主到次依次为：b＞a＞c＞d，这其中磷脂类物质与高分子材料的质量比对纳米粒影响最为显著，单环刺螠纤溶酶与磷脂类物质的质量比次之，表面活性剂中烷基聚葡糖苷0810与(-)-双烷基双磺酸基二苯甲烷的质量比和高分子材料的质量比影响较小。故处方优化时优先考虑磷脂类物质与高分子材料的质量比，在确保其比例最佳时，调节其它因素水平，获得最优处方。根据实验结果，可得最优水平组合为a3b3c1d1。
通过方差分析验证实验结果，如表3、表4。数据处理：方差数据＝实验数据/100后计算得到。结果可得，因素b即磷脂类物质与高分子材料的质量比以及因素a即单环刺螠纤溶酶与磷脂类物质的质量比对实验结果影响显著，进而验证了上述结论。
综上所述，确定单环刺螠纳米粒的最优处方为a3b3c1d1，即最佳处方为单环刺螠纤溶酶与磷脂类物质的质量比为1:6，磷脂类物质与高分子材料的质量比为12:11，高分子材料α-巯基壳聚糖和聚丙烯酸钠-5100的质量比为1:2，烷基聚葡糖苷0810与(-)-双烷基双磺酸基二苯甲烷比为3:1。
附图说明
图1为单环刺螠纤溶酶纳米口服粒及单环刺螠纤溶酶裸药经人工胃肠液后的凝胶电泳图，其中1.dnamarker、2.裸药+模拟胃液、3.纳米粒+模拟胃液、4.裸药+模拟肠液、5.纳米粒+模拟肠液；
图2为单环刺螠纤溶酶纳米口服粒降解释放后主要产物的质谱图。
具体实施方式
为了进一步解释本发明的技术方案，下面通过具体实施例来对本发明进行详细阐述。
一、单环刺螠纤溶酶口服纳米粒的制备
实施例一
1、处方及其用量
2、制备方法
(1)将处方量的高分子材料α-巯基壳聚糖和聚丙烯酸钠-5100在25℃水浴条件下溶解于10ml二氯甲烷中，恒温磁力搅拌至完全溶解，溶解后所得高分子有机溶液的浓度为5mg/ml；
(2)将处方量的单环刺螠纤溶酶溶解于上述所得的高分子有机溶液中，50℃下恒温水浴60min，所得单环刺螠纤溶酶高分子溶液的浓度为0.6mg/ml，将单环刺螠纤溶酶高分子溶液作为油相，待用；
(3)将处方量的磷脂类物质2-(甲基丙烯酰氧基)乙基-2-(三甲基氨基)乙基磷酸酯溶于5.5ml4％丙二醇中，然后加入处方量的表面活性剂烷基聚葡糖苷0810和(-)-双烷基双磺酸基二苯甲烷，用玻璃棒搅拌至完全溶解，80℃下恒温水浴60min，55r·min-1下减压旋转蒸发除去有机溶剂，将此溶液作为水相，待用；
(4)在25℃下，向上述所得水相中加入0.9mg抗氧剂2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚，置于37℃恒温水浴振荡器中振摇30min；
(5)将油相以4ml/min的速度滴加入恒温磁力搅拌的水相中，使得油相与水相的体积比为1:6，磁力搅拌时，搅拌速度为2000rpm，温度为35℃，时间为30min；
(6)滴加结束后，继续搅拌2h，完全除去有机溶剂，得到纳米粒溶液；
(7)将除去有机溶剂的纳米粒溶液放入0.22um透析袋中透析12h，加入3mg冻干保护剂2.5％丙二醇嵌段聚醚，所得溶液盛放在直径约150mm玻璃培养皿中,使溶液深度约为15mm，放置在冷冻干燥机中搁板上梯度降温置-4℃，溶液冻结后，冻结物在压强为30pa，-50℃的条件下进行真空冷冻干燥10h，即得单环刺螠纤溶酶口服纳米粒。
实施例二
1、处方及其用量
2、制备方法
(1)将处方量的高分子材料α-巯基壳聚糖和聚丙烯酸钠-5100在25℃水浴条件下溶解于10ml二氯甲烷中，恒温磁力搅拌至完全溶解，溶解后所得高分子有机溶液的浓度为10mg/ml；
(2)将处方量的单环刺螠纤溶酶溶解于上述所得的高分子有机溶液中，50℃下恒温水浴60min，所得单环刺螠纤溶酶高分子溶液的浓度为1.2mg/ml，将单环刺螠纤溶酶高分子溶液作为油相，待用；
(3)将处方量的磷脂类物质2-(甲基丙烯酰氧基)乙基-2-(三甲基氨基)乙基磷酸酯溶于5.5ml4％丙二醇中，然后加入处方量的表面活性剂烷基聚葡糖苷0810和(-)-双烷基双磺酸基二苯甲烷，用玻璃棒搅拌至完全溶解，80℃下恒温水浴60min，55r·min-1下减压旋转蒸发除去有机溶剂，将此溶液作为水相，待用；
(4)在25℃下，向上述所得水相中加入1.8mg抗氧剂2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚，置于37℃恒温水浴振荡器中振摇30min；
(5)将油相以4ml/min的速度滴加入恒温磁力搅拌的水相中，使得油相与水相的体积比为1:6，磁力搅拌时，搅拌速度为2000rpm，温度为35℃，时间为30min；
(6)滴加结束后，继续搅拌2h，完全除去有机溶剂，得到纳米粒溶液；
(7)将除去有机溶剂的纳米粒溶液放入0.22um透析袋中透析12h，加入6mg冻干保护剂2.5％丙二醇嵌段聚醚，所得溶液盛放在直径约150mm玻璃培养皿中,使溶液深度约为15mm，放置在冷冻干燥机中搁板上梯度降温置-4℃，溶液冻结后，冻结物在压强为30pa，-50℃的条件下进行真空冷冻干燥10h，即得单环刺螠纤溶酶口服纳米粒。
实施例三
1、处方及其用量
2、制备方法
(1)将处方量的高分子材料α-巯基壳聚糖和聚丙烯酸钠-5100在25℃水浴条件下溶解于15ml二氯甲烷中，恒温磁力搅拌至完全溶解，溶解后所得高分子有机溶液的浓度为13.3mg/ml；
(2)将处方量的单环刺螠纤溶酶溶解于上述所得的高分子有机溶液中，50℃下恒温水浴60min，所得单环刺螠纤溶酶高分子溶液的浓度为1.8mg/ml，将单环刺螠纤溶酶高分子溶液作为油相，待用；
(3)将处方量的磷脂类物质2-(甲基丙烯酰氧基)乙基-2-(三甲基氨基)乙基磷酸酯溶于10ml4％丙二醇中，然后加入处方量的表面活性剂烷基聚葡糖苷0810和(-)-双烷基双磺酸基二苯甲烷，用玻璃棒搅拌至完全溶解，80℃下恒温水浴60min，55r·min-1下减压旋转蒸发除去有机溶剂，将此溶液作为水相，待用；
(4)在25℃下，向上述所得水相中加入3.6mg抗氧剂2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚，置于37℃恒温水浴振荡器中振摇30min；
(5)将油相以4ml/min的速度滴加入恒温磁力搅拌的水相中，使得油相与水相的体积比为1:6，磁力搅拌时，搅拌速度为2000rpm，温度为35℃，时间为30min；
(6)滴加结束后，继续搅拌2h，完全除去有机溶剂，得到纳米粒溶液；
(7)将除去有机溶剂的纳米粒溶液放入0.22um透析袋中透析12h，加入12mg冻干保护剂2.5％丙二醇嵌段聚醚，所得溶液盛放在直径约150mm玻璃培养皿中,使溶液深度约为15mm，放置在冷冻干燥机中搁板上梯度降温置-4℃，溶液冻结后，冻结物在压强为30pa，-50℃的条件下进行真空冷冻干燥10h，即得单环刺螠纤溶酶口服纳米粒。
二、单环刺螠纤溶酶口服纳米粒的评价
1、纳米粒粒径的测定：
采用激光粒度测定仪测定，单环刺螠纤溶酶口服纳米粒的形状规则多呈球形，分散性好，粒子的粒径在100-200nm之间。
2、纳米粒的载药量及包封率的测定：
取新制备纳米粒200g，12000r/min离心30min，取上清液至酶标仪下测定上清液中游离的蛋白酶od值，采用以下公式计算纳米粒的包封率及载药量，其中xt为未经包封前酶的od值，xc为上清液中酶的od值，yt为整个纳米粒包封的单环刺螠纤溶酶的od值，结果如表5所示，结果表明，制备得到的单环刺螠纤溶酶口服纳米粒均符合制剂评价标准。
制剂评价标准：粒径：100～200nm；包封率：＞80％；载药量：1％～20％为合格制剂。
3、纳米粒稳定性的测定：
将实验制备的单环刺螠纤溶酶口服纳米粒及单环刺螠纤溶酶裸药置于透析袋中，透析袋先放入人工胃液中，在预设n的时间点0.5h、1h、2h、3h取样，然后将透析袋转移到人工肠液中，在预设的时间点4h、5h、6h、8h、12h取样，通过凝胶电泳检测单环刺螠纤溶酶口服纳米粒的稳定性，结果如图1所示，图中标记为3和5的单环刺螠纤溶酶口服纳米粒没有出现降解，没有单环刺螠纤溶酶的蛋白条带出现，进而表明该纳米粒能很好的保护单环刺螠纤溶酶免受胃液肠液的降解，延长纳米粒在胃肠道的滞留时间，更利于纳米粒被胃肠道细胞摄取。
待纳米粒完全降解释药后，经电喷雾四极杆-飞行时间串联质谱仪测定得，溶出物中主要成分的相对分子质量为24329，见图2。由sds-page分析，单环刺螠纤溶酶的相对分子质量在24000～28000之间，可证实溶出物为包载药物。
上述实施例和图式并非限定本发明的产品形态和式样，任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化或修饰，皆应视为不脱离本发明的专利范畴。