本发明属于生物医学领域，具体涉及人心房利钠肽anp在制备癌症治疗药物中的应用。
背景技术：
目前临床上使用的抗肿瘤化学治疗药物均有不同程度的毒副作用，有些严重的毒副反应是限制药物剂量或使用的直接原因。这些药物在杀死肿瘤细胞的同时对正常组织杀死能力也比较强，尤其是人体中生长发育比较旺盛的血液系统以及淋巴组织等，从而造成患者表现出严重的副作用，并引起人体免疫系统发生改变，促进了癌症的发展，影响患者化疗预后。因此，研发具有低毒性、高效性和高特异性的抗癌药物成为热点。目前人们已从许多生物中分离出具有抗癌活性的小分子肽或环肽，而且安全有效。在人体中α-人心房利钠肽(α-humanartrialnatriureticpeptide，α-hanp，亦简称anp)由心房肌细胞合成并释放，anp具有利尿、利钠、舒张血管平滑肌、调控细胞增殖，有极佳的水、钠、血压维持效果，但是在肿瘤作用中未见使用。
技术实现要素：
鉴于目前抗肿瘤化疗药物的存在的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种人心房利钠肽anp在制备癌症治疗药物中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明通过研究发现人心房利钠肽anp具有抑制癌细胞生长和迁移的作用，而且对人体的正常细胞基本无影响。基于此，本发明提供如下应用：
人心房利钠肽anp在制备抑制癌细胞生长的药物中的应用。
人心房利钠肽anp在制备抑制癌细胞迁移的药物中的应用。
人心房利钠肽anp在制备癌症治疗药物中的应用。
所述的人心房利钠肽anp是一种具有环状结构的肽类激素，由28个氨基酸组成的，其氨基酸序列为：slrrsscfggrmdrigaqsglgcnsfry，其中7号位的半胱氨酸和23号位的半胱氨酸形成二硫键，相对分子量为3080.5da。
所述的癌细胞包括胶质瘤细胞、舌鳞癌细胞、肝癌细胞。
本发明具有如下优点和有益效果：人心房利钠肽anp对人正常细胞无不利影响，其能够抑制癌细胞增殖和癌细胞迁移，可使癌细胞线粒体膜电位的降低诱导癌细胞凋亡。将人心房利钠肽anp用于制备癌症治疗药物无毒副作用，具有很好的应用前景。
附图说明
图1是不同浓度anp对ln-229细胞处理24h的存活率结果图。
图2是ln229细胞hoechst33342细胞核染色分析图(400×)。
图3是ln229细胞dapi细胞核染色分析图(400×)。
图4是ln-229细胞经pi染色流式检测细胞周期图；a是阴性对照组ck，b是0.05μmanp处理组，c是1μmanp处理组，d是5μmanp处理组。
图5是anp对ln229细胞不同时间段的迁移图(100×)。
图6是anp对ln229细胞迁移的影响结果图。
图7是jc-1法检测ln229细胞线粒体膜电位图(400×)。
图8是ao/eb法检测ln229细胞凋亡图(400×)。
图9是annexinv/pi法检测ln229细胞凋亡图；a是阴性对照组ck，b是2mm过氧化氢处理组，c是0.05μmanp处理组，d是5μmanp处理组。
图10是不同浓度人舌鳞癌细胞anp对scc-9处理的影响。
图11是人舌鳞癌细胞scc-9经pi染色流式检测细胞周期图；a是阴性对照组ck，b是5μmanp处理组，c是10μmanp处理组。
图12是不同浓度anp对人肝癌细胞hepg2处理24h的影响结果图。
具体实施方式
本发明具体实施方式利用anp多肽，将其添加到细胞培养基中，使得癌细胞增殖受到抑制，而且抑制癌细胞的迁移，导致其线粒体膜电位的降低以及诱导凋亡。下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
1.细胞模型
1.1材料与方法
1.1.1材料
1.1.1.1细胞株：人胶质瘤细胞ln-229，该细胞株为已经商品化的生物材料。
1.1.1.2试剂：dmem粉末(购于gibco公司，美国)，胎牛血清(购于生工生物工程(上海)股份有限公司，中国)。
1.1.1.3人心房利钠肽anp由杭州中肽生化有限公司合成。其氨基酸序列为：slrrsscfggrmdrigaqsglgcnsfry(c7&c23bridge)；分子量为：3080.5da；纯度为：95％。
1.1.2方法和结果
1.1.2.1anp配制
取适量ddh2o、微量离心管和枪头进行高压灭菌。将anp粉剂用无菌水在生物安全柜中配制成20μmol/l和200μmol/l两种浓度备用。为了避免反复冻融造成多肽的降解，分别将这两种浓度的anp进行分装，做好标记，保存于-20℃冰箱。
1.1.2.2人胶质瘤细胞ln-229的培养与处理
将人胶质瘤细胞ln-229用含有10％胎牛血清(fbs)的dmem培养基培养，根据不同检测要求加入不同浓度的anp，阴性对照组(controlcheck；ck)则不加anp，培养条件均为37℃、5％co2的恒温培养箱(以下均简称培养箱)。
1.1.2.3ln-229细胞的增殖检测
取对数生长期的ln-229细胞用胰蛋白酶消化后离心收集，然后进行细胞计数，最终将细胞浓度调整至5×104/ml。接种到96孔板中，添加细胞悬液，每孔加入100μl，这样待测细胞的密度为5000个/孔(边缘孔用无菌pbs或无菌水填充)，轻轻拍打96孔板使每孔细胞分布均匀。置于培养箱培养过夜。用移液枪小心吸取每孔的培养基，弃掉，然后加入含有anp的培养基，使其终浓度分别为0.05、0.5、1、5和10μm，阴性对照为不加anp的培养基，置于培养箱培养24h。药物处理24h后，倒置显微镜观察药物的作用。每孔加入15-20μl的0.5％mtt溶液，继续培养4h。mtt加入培养4h后，甲臜结晶可充分形成。用移液枪小心弃去上清。每孔加入150μl二甲基亚砜，酶联免疫检测仪低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在570nm处测量各孔的吸光值。按下式计算存活率与抑制率：存活率(％)＝实验组平均od值/阴性对照平均od值×100％；抑制率(％)＝1－存活率。
从图1中数据可以看出anp对ln-229在24h的处理下有抑制作用，在浓度为0.5μm～10μm之间，对ln-229的存活率对其浓度呈依赖性，即浓度越高存活率越低，在浓度为10μm时处理24h后，存活率为68.59％±2.17％；但是在较低浓度0.05μm时亦有较好的抑制效果，处理24h后存活率为85.4％±3.57％。
1.1.2.4ln-229细胞核形态染色
前一天下午将ln-229细胞计数，细胞数量调整至5×104/ml左右。将细胞悬液制备好后，用移液枪轻轻混匀，向96孔板中，添加细胞悬液，每孔加入100μl，这样待测细胞的密度为5000个/孔(边缘孔用无菌pbs或无菌水填充)，轻轻拍打96孔板使每孔细胞分布均匀。置于培养箱培养过夜。用移液枪小心吸取每孔的培养基，弃掉，再加入含有浓度为0.05μmanp的培养基，阴性对照组不加anp，置于培养箱培养24h。使用前先根据用量，将hoechst33342储存溶液(2.5mg/ml)或dapi储存溶液(1mg/ml)配制成含有5μg/mlhoechst33342或2μg/mldapi的pbs染色工作液，其中染色工作液添加终浓度为0.25％的tritonx-100。小心弃去每孔的培养液，用pbs洗涤1-2次。96孔板每孔加100μl染色工作液即可。室温放置5-10min。倒置荧光显微镜下观察，拍照记录。
在ck组中ln-229细胞核经hoechst33342或dapi着色呈现出亮蓝色，且绝大部分细胞核形态规则呈卵形或椭球型，染色均匀；0.05μmanp处理组的细胞核染色也呈亮蓝色，但细胞核形态上出现典型的改变，出现碎裂，而且由于dna的凝聚染色更强(图2和图3)，表明细胞凋亡的现象。
1.1.2.5ln-229细胞的周期检测
实验前一天下午将ln-229细胞计数，细胞数量调整至1×105个/ml左右。将稀释好的细胞悬液均匀地铺到24孔板中，每孔500μl，约50000个细胞。置于培养箱培养过夜。用移液枪小心吸取每孔的培养基，弃掉，再加入含有anp的培养基，使其终浓度分别为0.05、1和5μm，阴性对照为不加anp的培养基，置于培养箱培养24h。离心收集细胞，弃上清，用预冷pbs洗细胞两次。先加300μlpbs将细胞重悬，再加入700μl预冷无水乙醇(最好是在-20℃预冷)使乙醇浓度为70％，于4℃固定过夜，或-20℃长期固定。离心收集细胞，以1ml的pbs洗细胞一次，加入80μlpbs含100μg/ml碘化丙啶(pi)，0.25％triton-100，4℃避光孵育30min。流式细胞仪检测，pi选用fl2通道检测。检测步骤用流式细胞仪按标准操作进行。
用anp处理人胶质瘤细胞ln-22924h后与ck组相比，ln-229细胞处于g0/g1期的数量的差异较小，g2/m期的数量略有增加(图4)。
1.1.2.6ln-229细胞的迁移检测
实验前一天下午将ln-229细胞接种到35mm细胞培养皿中(事先用记号笔在35mm皿底部用直尺均匀地划3-5条横线)，使其汇合度在70％-80％，置于培养箱培养。待到细胞汇合度达到100％，用无污染的200μl枪头垂直于孔板按照底部直线进行划痕，每个皿都用同一个枪头划以保证各个划痕宽度尽量一致，弃去培养基，用pbs洗涤1-2次以除去划下来的细胞碎片。加入1.5ml含1％fbs的dmem培养基。于倒置显微镜下观察，并选择合适的划痕位置进行拍照记录。实验组加入终浓度为0.05μm的anp到培养基中处理ln-229细胞，阴性对照组不加anp。置于培养箱培养。每隔12小时进行拍照记录，直到培养48h终止处理。按下式计算迁移速率：迁移速率＝0.5×迁移距离/时间。
与ck组相比，在细胞培养12、24和36h期间，用0.05μm处理ln-229细胞组细胞划痕愈合的能力较弱(图5)，迁移速率均有所降低，24h和36h迁移速率差别更加明显(图6)。
1.1.2.7ln-229细胞线粒体膜电位(△ψm)检测
前一天下午将ln-229细胞计数，细胞数量调整至1×105/ml左右。将稀释好的细胞悬液均匀地铺到96孔板中，每孔100μl，大约5000个细胞。置于培养箱培养过夜。用移液枪小心吸取每孔的培养基，弃掉，实验组加入含终浓度为0.05μmanp的培养基，阴性对照组加入等量不含anp的培养基，置于培养箱培养24h。96孔板每孔所需jc-1染色工作液的量为30μl，其它培养器皿的用量以此类推。配制jc-1染色工作液100μl：0.5μl200×jc-1+80μl超纯水，再加20μl5×jc-1染色缓冲液，用移液枪反复吹打以便混匀jc-1或剧烈涡旋混匀。阳性对照的设置：在染色前20min，用终浓度为4-8mm的过氧化氢处理细胞，置于培养箱中孵育20min。吸除培养液，用pbs洗涤细胞一次，加入100μl无胎牛血清的培养基。加入30μljc-1染色工作液，充分混匀。细胞培养箱中37℃孵育20min。在孵育期间，将5×jc-1染色缓冲液用超纯水稀释成1×，配制适量并冰浴备用。孵育完后，小心弃上清，用1×jc-1染色缓冲液洗涤2次。加入100μl细胞培养基。倒置荧光显微镜观察，并且拍照记录。
由于ln-229细胞未发生凋亡，因此经jc-1染色后ck组呈红色荧光；0.05μmanp处理24h后呈绿色荧光(图7)，则表明anp可诱导ln-229细胞线粒体膜电位降低。
1.1.2.8ao/eb染色细胞凋亡检测
前一天下午将ln-229细胞计数，细胞数量调整至5×104/ml左右。将细胞悬液制备好后，用移液枪轻轻混匀，向96孔板中，添加细胞悬液，每孔加入100μl，这样待测细胞的密度为5000个/孔(边缘孔用无菌pbs或无菌水填充)，轻轻拍打96孔板使每孔细胞分布均匀。置于培养箱培养过夜。用移液枪小心吸取每孔的培养基，弃掉。anp处理组为培养基中添加终浓度为0.05μmanp；阴性对照组中培养基不加anp；阳性对照组用终浓度为2mm过氧化氢的培养基处理，置于培养箱培养24h。使用前先根据用量，将ao溶液(200μg/ml)和eb(200μg/ml)溶液按1:1混合，配制成含有1μg/mlao和1μg/mleb的pbs染色工作液，先用现配。小心弃去每孔的培养液，用pbs洗涤1-2次。96孔板每孔加100μl染色工作液即可。室温放置2-5min后于倒置荧光显微镜下观察并且拍照记录。
ln-229细胞经ao/eb染色后(图8)，ck组细胞细胞核着绿色且结构正常，红色荧光几乎观察不到，表现为活细胞；0.05μmanp处理24h后一部分细胞细胞核呈现出红色荧光，而且细胞核呈固缩状或片段状，表现出凋亡的现象。
1.1.2.9annexinv/pi染色细胞凋亡检测
实验前一天下午将ln-229细胞计数，细胞数量调整至1×105个/ml左右。将稀释好的细胞悬液均匀地铺到24孔板中，每孔500μl，大约50000个细胞。置于培养箱培养过夜。用移液枪小心吸取每孔的培养基，弃掉。anp处理组设置两个：一组向培养基中添加终浓度为0.05μmanp，另一组为5μm；阴性对照组中培养基不加anp；阳性对照组用终浓度为2mm过氧化氢的培养基处理，置于培养箱培养24h。先吸去培养液，再用pbs洗1-2次，接着用适量无edta的胰酶消化后，(若用含edta的胰酶消化收集后，用pbs洗涤1-2次)于室温2000rpm离心5～10min，收集细胞每管1-5×104个细胞。用预冷pbs(4℃)重悬细胞一次，2000rpm离心5～10min，洗涤细胞；加入100μl的assaybuffer悬浮细胞；加入1μl的100×annexinv-ifluor488混匀后，再加1μl100×pi混匀；避光，室温孵育30～60min。在用流式细胞仪检测之前，补加100-200μl的assarybuffer。annexinv-ifluor488用fl1通道，pi用fl3通道检测。q1-ll区域细胞：pi﹣/annexinv﹣，代表活细胞；q1-ul区域细胞：pi﹢/annexinv﹣，代表非凋亡的死细胞；q1-li区域细胞:pi﹣/annexinv﹢，代表早期凋亡细胞；q1-u区域细胞：pi﹢/annexinv﹢，代表晚期凋亡细胞。
流式细胞检测分析表明，与ck组相比，2mm的过氧化氢处理24h可诱导ln-229细胞凋亡，而且早期凋亡细胞占绝大多数，比ck组多61.6％，晚期凋亡细胞比ck组多11％；与ck组相比，0.05μmanp处理24h可诱导ln-229细胞凋亡，早期和晚期的细胞数量都有所增加，早期凋亡细胞比ck组多16.9％，晚期凋亡细胞比ck组多9.2％；与ck组相比，5μmanp处理24h可诱导ln-229细胞凋亡，均为早期凋亡细胞，比ck组多48.4％(图9)。可见anp的浓度对于ln-229的凋亡有影响。
实施例2
1.1细胞模型
1.1材料与方法
1.1.1材料
1.1.1.1细胞株：人舌鳞癌细胞scc-9，该细胞株为已经商品化的生物材料。
1.1.1.2试剂：dmem/f12培养基(购于hyclone公司，美国)，胎牛血清(购于生工生物工程(上海)股份有限公司，中国)。
1.1.2方法
1.1.2.1人舌鳞癌细胞scc-9的培养与处理
将人舌鳞癌细胞scc-9用含有10％胎牛血清(fbs)的dmem/f12培养基培养，根据不同检测要求加入不同浓度的anp，阴性对照组(controlcheck；ck)则不加anp，培养条件均为37℃、5％co2的恒温培养箱(以下均简称培养箱)。
1.1.2.2scc-9细胞的增殖检测
取对数生长期的scc-9细胞用胰蛋白酶消化后离心收集，进行细胞计数，用dmem/f12培养基(含10％fbs)最终将细胞浓度调整至5×104/ml。接种到96孔板中，添加细胞悬液，每孔加入100μl，这样待测细胞的密度为5000个/孔(边缘孔用无菌pbs或无菌水填充)，轻轻拍打96孔板使每孔细胞分布均匀。置于培养箱培养过夜。用移液枪小心吸取每孔的培养基，弃掉，然后再加入含有anp的培养基，使其终浓度分别为5、10、15和20μm，阴性对照为不加anp的培养基，置于培养箱分别培养24h和48h。药物处理24h和48h后，倒置显微镜观察药物的作用效果。每孔加入15-20μl的0.5％mtt溶液，继续培养4h。mtt加入培养4h后，甲臜结晶可充分形成。将用移液枪小心弃去上清。每孔加入150μl二甲基亚砜，在酶联免疫检测仪低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在570nm处测量各孔的吸光值。按下式计算存活率与抑制率：存活率(％)＝实验组平均od值/阴性对照平均od值×100％；抑制率(％)＝1-存活率。
anp对scc-9在24h和48h的处理下都有抑制作用，而且随着作用时间越长抑制效果有所提高，在浓度为5μm-20μm之间，对scc-9细胞的存活率对其浓度呈依赖性，即浓度越高存活率越低。在浓度为5μm时，处理24h后存活率有98.82％±0.89％，处理48h后存活率为96.31％±4.86％；在浓度为20μm时，处理24h后存活率为90.99％±1.55％，处理48h后存活率为86.34％±3.42％。在用浓度为15μm和20μm的α-hanp处理scc-9细胞48h后，两个处理组的存活率几乎差别不大，仅相差0.005％(图10)。
1.1.2.3scc-9细胞的周期检测
实验前一天下午将scc-9细胞计数，细胞数量调整至1×105/ml左右。将稀释好的细胞悬液均匀地铺到24孔板中，每孔500μl，大约50000个细胞。置于培养箱培养过夜。用移液枪小心吸取每孔的培养基，弃掉，然后再加入含有不同浓度的anp的培养基继续培养，阴性对照为不加anp的培养基，置于培养箱培养48h。离心收集细胞，弃上清，用预冷pbs洗细胞两次。先加300μlpbs将细胞重悬，再加入700μl预冷无水乙醇(最好是在-20℃预冷)使乙醇浓度为70％，于4℃固定过夜，或-20℃长期固定。离心收集细胞，以1ml的pbs洗细胞一次，加入80μlpbs含100μg/ml碘化丙啶(pi)，0.25％triton-100，4℃避光孵育30min。流式细胞仪检测，pi选用fl2通道检测。检测步骤用流式细胞仪按标准操作进行。
用anp处理人舌鳞癌细胞scc-948h后与ck组相比，scc-9细胞处于g0/g1期的数量的差异较小，g2/m期的数量略有降低，而且出现亚g1期(图11)，有部分细胞凋亡。
实施例3
1.细胞模型
1.1材料与方法
1.1.1材料
1.1.1.1细胞株：人肝癌细胞hepg2，该细胞株为已经商品化的生物材料。
1.1.1.2试剂：dmem粉末(购于gibco公司，美国)，胎牛血清(购于生工生物工程(上海)股份有限公司，中国)。
1.1.2方法
1.1.2.1人肝癌细胞hepg2的培养与处理
将人肝癌细胞hepg2用含有10％胎牛血清(fbs)的dmem培养基培养，根据不同检测要求加入不同浓度的anp，阴性对照组(controlcheck；ck)则不加anp，培养条件均为37℃、5％co2的恒温培养箱(以下均简称培养箱)。
1.1.2.2hepg2细胞的增殖检测
取对数生长期的hepg2细胞用胰蛋白酶消化后离心收集，进行细胞计数，最终将细胞浓度调整至5×104个/ml。接种到96孔板中，添加细胞悬液，每孔加入100μl，这样待测细胞的密度为5000个/孔(边缘孔用无菌pbs或无菌水填充)，轻轻拍打96孔板使每孔细胞分布均匀。置于培养箱培养过夜。用移液枪小心吸取每孔的培养基，弃掉，再加入含有anp的培养基，使其终浓度分别为0.05、0.5和5μm，阴性对照为不加anp的培养基，置于培养箱培养24h。药物处理24h后，用倒置显微镜下观察药物的作用。每孔加入15-20μl的0.5％mtt溶液，继续培养4h。mtt加入培养4h后，甲臜结晶可充分形成。将用移液枪小心弃去上清。每孔加入150μl二甲基亚砜，在酶联免疫检测仪低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在570nm处测量各孔的吸光值。按下式计算存活率与抑制率：存活率(％)＝实验组平均od值/阴性对照平均od值×100％；抑制率(％)＝1-存活率。
anp对hepg2在24h的处理下有抑制作用，在浓度为0.05μm和5μm的处理下，有几乎相同的抑制效果，0.05μm处理24h后的存活率为84.29％±0.38％，5μm处理24h后的存活率为84.78％±0.25％(图12)。这与ln-229在0.05μm有较好的抑制效果基本一致。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>湖北汉元基因技术有限公司
<120>人心房利钠肽anp在制备癌症治疗药物中的应用
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
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2025