本发明涉及中药领域，特别涉及一种具有改善贫血功能的组合物及其制备方法与用途。
背景技术：
：贫血是指单位容积循环血液内的血红蛋白量、红细胞数和红细胞压积低于正常的病理状态。贫血对身体的伤害极大，贫血患者往往有：1、软弱无力：疲乏、困倦，是因肌肉缺氧所致。为最常见和最早出现的症状。2、皮肤、粘膜苍白：皮肤、粘膜、结膜以及皮肤毛细血管的分布和舒缩状态等因素的影响。一般认为睑结合膜、手掌大小鱼际及甲床的颜色比较可靠。3、心血管系统：心悸为最突出的症状之一，有心动过速，在心尖或肺动脉瓣区可听到柔和的收缩期杂音，称为贫血性杂音，严重贫血可听到舒张期杂音。严重贫血或原有冠心病，可引起心绞痛、心脏扩大、心力衰竭。4、呼吸系统：急或呼吸困难，大都是由于呼吸中枢低氧或高碳酸血症所致。5、中枢神经系统：头晕、头痛、耳鸣、眼花、注意力不集中、嗜睡等均为常见症状。晕厥甚至神志模糊可出现于贫血严重或发生急骤者，特别是老年患者。6、消化系统：食欲减退、腹胀、恶心、便秘等为最多见的症状。7、生殖系统：妇女患者中常有月经失调，如闭经或月经过多。在男女两性中性欲减退均多见。8、泌尿系统：贫血严重者可有轻度蛋白尿及尿浓缩功能减低。进一步研究表明贫血患者往往死于心律不齐，心率过速，胸闷，头晕，冷汗淋漓，四肢冰冷。缺铁性贫血(IDA)是全世界发病率最高的营养缺乏性疾病之一。世界50亿人口中约有1/3的人贫血。而IDA或铁营养不良的人群约占5亿。在发展中国家铁缺乏(ID)发生率是发达国家的4倍。在我国大约有20％的人口存在IDA或铁营养不良。为了改善ID，并进行合理、安全有效的补铁，新一代补铁剂的研究具有重要的现实意义。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供一种一种具有改善贫血功能的组合物及其制备方法与用途。该组合物具有改善动物缺铁性贫血的作用。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种组合物，包括当归、红枣、黄芪、阿胶、珍珠粉和中预铁。在本发明的一些具体实施方案中，当归、红枣、黄芪、阿胶、珍珠粉和中预铁的质量比为(50～250):(20～100):(50～300):(20～100):(1～10):(1～10)。在本发明的一些具体实施方案中，所述组合物还包括益母草、桑椹、银耳、莲子或茯苓中的一种或两者以上的混合物。在本发明的一些具体实施方案中，以质量份计，所述组合物包括如下组分：本发明还提供了所述组合物的制备方法，取配方量的各组分水提。本发明还提供了所述组合物的制备方法，包括如下步骤：步骤1：取配方量的当归、黄芪、益母草、茯苓、红枣、桑椹混合后，与10～12倍质量的水混合，于80～100℃提取1.5～2.5h，过滤，收集滤液作为第一提取液；取滤渣与8～10倍质量的水混合，于80～100℃提取1～2h，过滤，收集滤液作为第二提取液；合并所述第一提取液和第二提取液，制得提取液；步骤2：取配方量的莲子和银耳混合后，与10～20倍质量的水混合，于80～100℃提取1～2h，过滤，收集滤液；步骤3：取步骤1制得的提取液和步骤2制得的滤液混合后过滤，收集滤液、浓缩，制得浓缩液；步骤4：取配方量的阿胶与15～25倍量的水混合，于80～90℃加热至溶解，制得阿胶液；步骤5：取步骤3制得的浓缩液与水混合配制获得质量浓度为5～10％的中草药液，加热，与步骤4制得的所述阿胶液、配方量的珍珠粉、配方量的中预铁混合，超滤。在本发明的一些具体实施方案中，步骤3中过滤包括一级过滤和二级过滤；所述一级过滤的目数为80～100目，所述二级过滤的目数为100～120目。在本发明的一些具体实施方案中，步骤3中所述浓缩的真空度为-0.01～-0.02Mpa，所述浓缩的温度为50～60℃，所述浓缩液中固形物含量为20％～30％。在本发明的一些具体实施方案中，步骤5中所述加热的温度为80～100℃，所述混合的时间为15～45min。本发明还提供了所述组合物或上述制备方法制得的组合物在制备贫血的药物中的应用。在本发明的一些具体实施方案中，所述贫血为缺铁性贫血。本发明提供了一种组合物，包括当归、红枣、黄芪、阿胶、珍珠粉和中预铁。在一些实施例中，当归、红枣、黄芪、阿胶、珍珠粉和中预铁的质量比为(50～250):(20～100):(50～300):(20～100):(1～10):(1～10)。在本发明的另一些具体实施方案中，所述组合物还包括益母草、桑椹、银耳、莲子或茯苓中的一种或两者以上的混合物。本发明提供的组合物具有改善动物缺铁性贫血的作用。具体实施方式本发明公开了一种具有改善贫血功能的组合物及其制备方法与用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明提供的组合物的制备方法包括如下步骤：提取1：当归，黄芪，益母草，茯苓，红枣，桑椹中草药第一次提取10～12倍水，提取时间1.5～2.5小时，第二次提取8～10倍水，提取时间1～2小时。以缸内液体微沸腾时开始计时。提取2：莲子、银耳加入10～20倍的水，提取1～2小时，以缸内液体微沸腾时开始计时。过滤：将提取1和提取2提取液经过二级过滤系统(第一级80～100目，第二级100～120目)过滤后，置于暂存缸内，待浓缩。浓缩：将所有提取液抽入双效浓缩设备进行真空浓缩(真空度为-0.01～-0.02Mpa,温度为50～60℃)，浓缩至固形物含量约25±5％。阿胶溶解：(备注：先将阿胶粉碎成细颗粒)往不锈钢锅中加入约阿胶15～25倍量净化水，加热至80℃以上，然后慢慢倒入粉碎好的阿胶，并不断搅拌，至阿胶完全溶解即可。中草药浓缩液的稀释及加热：将制得的中草药浓缩液加入一定量的纯净水，配制成5～10％中草药液，并将此中草药液倒入冷热缸内，搅拌加热至80℃，停止加热。投料：将步骤四阿胶液、珍珠粉、中预铁加入步骤五浓缩液中，待所有配料完全加入后，再搅拌15～45min。超滤：将配制液抽入超速离心机，转速15000rpm，一次超滤，最后灌装即得口服液。在本发明条件下，经口给予贫血模型大鼠0.83ml/kg·bw、1.67ml/kg·bw、5.00ml/kg·bw剂量的本发明提供的组合物后，5.00ml/kg·bw剂量组大鼠血红蛋白与低铁对照组比较差异有显著性(P<0.05)；三个剂量组大鼠血红蛋白升高幅度平均达到l0g/L以上；5.00ml/kg·bw剂量组红细胞内游离原卟啉与对照组比较差异有显著性(P<0.05)。提示该样品具有改善动物缺铁性贫血功能。本发明提供的组合物2倍浓缩液对ICR种雌、雄小鼠的最大耐受剂量(MTD)大于20.88g/kg·bw，属无毒级。Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验结果均为阴性。以2.08ml/kg·bw、4.17ml/kg·bw、8.33ml/kg·bw剂量的本发明提供的组合物2倍浓缩液给大鼠灌胃30天。实验期间，动物生长发育良好，各剂量组体重、增重、食物利用率、血常规指标、血生化指标、脏器重量及脏器/体重比值与对照组比较，无显著性差异(P>0.05)。大体解剖和组织病理检查未见明显与样品有关的异常改变。提示本发明提供的组合物30天喂养对大鼠未见明显毒副作用。试验结果表明：服用本发明提供的组合物后，试食组血红蛋白与试食前及试食后对照组比较，差异均有显著性(P<0.05)，且与试验前比较，上升值大于10.0g/L：试食组人群红细胞内游离原卟啉浓度下降，与试食前及试食后对照组比较，差异均无显著性(P>0.05)；试食后血清铁蛋白与试食前及试食后对照组比较，差异均有显著性(P<0.05)。根据《改善缺铁性贫血功能评价方法》(国食药监保化[2012]107号)中规定的评判标准，提示本发明提供的组合物具有改善缺铁性贫血功能(成人)。本发明提供的一种具有改善贫血功能的组合物及其制备方法与用途中所用原料及试剂均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1步骤1：取配方量的当归、黄芪、红枣混合后，与10倍质量的水混合，于80℃提取1.5h，过滤，收集滤液作为第一提取液；取滤渣与10倍质量的水混合，于90℃提取1.5h，过滤，收集滤液作为第二提取液；合并第一提取液和第二提取液，制得提取液；步骤2：取配方量的莲子和银耳混合后，与10～20倍质量的水混合，于80℃提取1h，过滤，收集滤液；步骤3：取步骤1制得的提取液和步骤2制得的滤液混合后过滤(过滤包括一级过滤和二级过滤；一级过滤的目数为80～100目，二级过滤的目数为100～120目)，收集滤液，于真空度为-0.01Mpa、温度为55℃的条件下浓缩，制得浓缩液，浓缩液中固形物含量为20％；步骤4：取配方量的阿胶与20倍量的水混合，于85℃加热至溶解，制得阿胶液；步骤5：取步骤3制得的浓缩液与水混合配制获得质量浓度为5％的中草药液，加热至90℃，与步骤4制得的阿胶液、配方量的珍珠粉、配方量的中预铁混合30min，超滤。实施例2步骤1：取配方量的当归、黄芪、红枣混合后，与12倍质量的水混合，于100℃提取2.5h，过滤，收集滤液作为第一提取液；取滤渣与8倍质量的水混合，于100℃提取2h，过滤，收集滤液作为第二提取液；合并第一提取液和第二提取液，制得提取液；步骤2：取配方量的莲子和银耳混合后，与10～20倍质量的水混合，于100℃提取2h，过滤，收集滤液；步骤3：取步骤1制得的提取液和步骤2制得的滤液混合后过滤(过滤包括一级过滤和二级过滤；一级过滤的目数为80～100目，二级过滤的目数为100～120目)，收集滤液，于真空度为-0.02Mpa、温度为60℃的条件下浓缩，制得浓缩液，浓缩液中固形物含量为30％；步骤4：取配方量的阿胶与25倍量的水混合，于90℃加热至溶解，制得阿胶液；步骤5：取步骤3制得的浓缩液与水混合配制获得质量浓度为10％的中草药液，加热至80℃，与步骤4制得的阿胶液、配方量的珍珠粉、配方量的中预铁混合15min，超滤。实施例3步骤1：取配方量的当归、黄芪、红枣混合后，与11倍质量的水混合，于90℃提取2.0h，过滤，收集滤液作为第一提取液；取滤渣与9倍质量的水混合，于80℃提取1h，过滤，收集滤液作为第二提取液；合并第一提取液和第二提取液，制得提取液；步骤2：取配方量的莲子和银耳混合后，与10～20倍质量的水混合，于90℃提取1h，过滤，收集滤液；步骤3：取步骤1制得的提取液和步骤2制得的滤液混合后过滤(过滤包括一级过滤和二级过滤；一级过滤的目数为80～100目，二级过滤的目数为100～120目)，收集滤液，于真空度为-0.015Mpa、温度为50℃的条件下浓缩，制得浓缩液，浓缩液中固形物含量为25％；步骤4：取配方量的阿胶与15倍量的水混合，于80℃加热至溶解，制得阿胶液；步骤5：取步骤3制得的浓缩液与水混合配制获得质量浓度为7％的中草药液，加热至100℃，与步骤4制得的阿胶液、配方量的珍珠粉、配方量的中预铁混合45min，超滤。实施例4步骤1：取配方量的当归、黄芪、益母草、茯苓、红枣、桑椹混合后，与12倍质量的水混合，于80℃提取1.5h，过滤，收集滤液作为第一提取液；取滤渣与9倍质量的水混合，于90℃提取1h，过滤，收集滤液作为第二提取液；合并第一提取液和第二提取液，制得提取液；步骤2：取配方量的莲子和银耳混合后，与15倍质量的水混合，于80℃提取1h，过滤，收集滤液；步骤3：取步骤1制得的提取液和步骤2制得的滤液混合后经一级过滤和二级过滤；一级过滤的目数为90目，二级过滤的目数为100目；收集滤液，于真空度为-0.015Mpa、温度为50℃的条件下浓缩，制得浓缩液，浓缩液中固形物含量为25％；步骤4：取配方量的阿胶与15倍量的水混合，于85℃加热至溶解，制得阿胶液；步骤5：取步骤3制得的浓缩液与水混合配制获得质量浓度为8％的中草药液，加热至90℃，与步骤4制得的阿胶液、配方量的珍珠粉、配方量的中预铁混合30min，超滤。实施例5步骤1：取配方量的当归、黄芪、益母草、茯苓、红枣、桑椹混合后，与10倍质量的水混合，于100℃提取2.5h，过滤，收集滤液作为第一提取液；取滤渣与10倍质量的水混合，于80℃提取2h，过滤，收集滤液作为第二提取液；合并第一提取液和第二提取液，制得提取液；步骤2：取配方量的莲子和银耳混合后，与20倍质量的水混合，于100℃提取2h，过滤，收集滤液；步骤3：取步骤1制得的提取液和步骤2制得的滤液混合后经一级过滤和二级过滤；一级过滤的目数为100目，二级过滤的目数为120目；收集滤液，于真空度为-0.02Mpa、温度为60℃的条件下浓缩，制得浓缩液，浓缩液中固形物含量为30％；步骤4：取配方量的阿胶与25倍量的水混合，于80℃加热至溶解，制得阿胶液；步骤5：取步骤3制得的浓缩液与水混合配制获得质量浓度为10％的中草药液，加热至100℃，与步骤4制得的阿胶液、配方量的珍珠粉、配方量的中预铁混合15min，超滤。实施例6步骤1：取配方量的当归、黄芪、益母草、茯苓、红枣、桑椹混合后，与11倍质量的水混合，于90℃提取2.0h，过滤，收集滤液作为第一提取液；取滤渣与8倍质量的水混合，于100℃提取1.5h，过滤，收集滤液作为第二提取液；合并第一提取液和第二提取液，制得提取液；步骤2：取配方量的莲子和银耳混合后，与1倍质量的水混合，于90℃提取1.5h，过滤，收集滤液；步骤3：取步骤1制得的提取液和步骤2制得的滤液混合后经一级过滤和二级过滤；一级过滤的目数为80目，二级过滤的目数为110目；收集滤液，于真空度为-0.01Mpa、温度为55℃的条件下浓缩，制得浓缩液，浓缩液中固形物含量为20％；步骤4：取配方量的阿胶与20倍量的水混合，于90℃加热至溶解，制得阿胶液；步骤5：取步骤3制得的浓缩液与水混合配制获得质量浓度为5％的中草药液，加热至80℃，与步骤4制得的阿胶液、配方量的珍珠粉、配方量的中预铁混合45min，超滤。对比例1组方：步骤1：取配方量的当归、黄芪、红枣混合后，与10倍质量的水混合，于80℃提取1.5h，过滤，收集滤液作为第一提取液；取滤渣与10倍质量的水混合，于90℃提取1.5h，过滤，收集滤液作为第二提取液；合并第一提取液和第二提取液，制得提取液；步骤2：取步骤1制得的提取液过滤(过滤包括一级过滤和二级过滤；一级过滤的目数为80～100目，二级过滤的目数为100～120目)，收集滤液，于真空度为-0.01Mpa、温度为55℃的条件下浓缩，制得浓缩液，浓缩液中固形物含量为20％；步骤3：取配方量的阿胶与20倍量的水混合，于85℃加热至溶解，制得阿胶液；步骤4：取步骤3制得的浓缩液与水混合配制获得质量浓度为5％的中草药液，加热至90℃，与步骤3制得的阿胶液、配方量的珍珠粉、配方量的乳酸亚铁混合30min，超滤。对比例2组方步骤1：取配方量的熟地、黄芪、红枣混合后，与10倍质量的水混合，于80℃提取1.5h，过滤，收集滤液作为第一提取液；取滤渣与10倍质量的水混合，于90℃提取1.5h，过滤，收集滤液作为第二提取液；合并第一提取液和第二提取液，制得提取液；步骤2：取步骤1制得的提取液过滤(过滤包括一级过滤和二级过滤；一级过滤的目数为80～100目，二级过滤的目数为100～120目)，收集滤液，于真空度为-0.01Mpa、温度为55℃的条件下浓缩，制得浓缩液，浓缩液中固形物含量为20％；步骤3：取配方量的阿胶与20倍量的水混合，于85℃加热至溶解，制得阿胶液；步骤4：取步骤3制得的浓缩液与水混合配制获得质量浓度为5％的中草药液，加热至90℃，与步骤3制得的阿胶液、配方量的珍珠粉、配方量的中预铁混合30min，超滤。实施例7本发明提供的组合物改善缺铁性贫血功能动物试验1材料和方法1.1样品：实施例1～6提供的组合物，由无限极(中国)有限公司提供，人体口服推荐剂量为每日l0ml，体重按60kg计算，折合剂量0.167ml/kg·bw。1.2实验动物与环境：SPF级初断乳雌性SD大鼠60只，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证号SCXK(湘)2011-0003，饲料由北京科澳协力饲料有限公司提供，许可证号SCXK(京)2014-0010。实验环境为屏障环境。实验期间实验环境温度22℃～24℃，湿度54％～58％。实验动物使用许可证号为SYXK(湘)2010-0010号。1.3剂量选择、分组与受试物给予方式：自试验开始喂给大鼠低铁饲料及去离子水，采用不锈钢笼具及食罐，同时，剪尾取血法放血，5天一次，每次0.3-0.5ml，实验过程中避免铁污染。自第3周开始每周选取部分大鼠采尾血测定血红蛋白(Hb)，直至多数大鼠Hb低于l00g/L时，测定全部大鼠的体重及血红蛋白含量，选取Hb<l00g/L的大鼠40只，作为试验模型动物，根据贫血大鼠Hb水平和体重将其随机分为0.83ml/kg·bw、1.67ml/kg·bw、5.00ml/kg·bw三个试验组(相当于人体推荐剂量的5、10、30倍)和低铁对照组，每组10只，单笼饲养。低、中、高剂量组分别取样品16.6ml、33.4ml、l00.0ml加蒸馏水至200mL，对照组给予等体积蒸馏水，灌胃量l.0mL/l00g·bw，每天灌胃1次。各组继续给予低铁饲料和去离子水，连续30天。1.4主要仪器：1.4.1722S分光光度计。1.4.2RF-5301荧光光度计。1.5实验方法：1.5.1血红蛋白的检测(氰化高铁法)：于造模末期和恢复试验末测定大鼠血红蛋白含量。取尾血10μL加入2.5mL含铁氰化钾的试剂中，混匀，放置15分钟；选用0.5厘米光径比色杯，于540nm波长下，以试剂调零，将所得样品管光密度乘以736，即为血红蛋白浓度(g/L)。1.5.2红细胞内游离原卟啉的检测：试验结束时，取尾血20μL，经肝素抗凝剂处理后，采用荧光分光光度计法测定红细胞内游离原卟啉。1.6实验数据统计：用Excel、Spss软件进行统计分析。2结果2.1本发明提供的组合物对大鼠体重的影响由表1可见，各剂量组实验初、实验中朔、实验末大鼠体重及实验期间大鼠体重增长与对照组比较，差异无显著性(P>0.05)。表1样品对大鼠体重的影响注：与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。2.2本发明提供的组合物对大鼠血红蛋白的影响试验前各组大鼠的血红蛋白含量无明显差异。实验后，各剂量组血红蛋白与对照组比较有升高，高剂量组与对照组比较差异有显著性(p<0.05)(见表2)。三个剂量组血红蛋白前后升高幅度平均为12.73g/L。表2样品对大鼠血红蛋白的影响注：与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。2.3本发明提供的组合物对大鼠红细胞内游离原卟啉的影响由表3可见，各剂量组大鼠的红细胞内游离原卟啉与对照组比较有降低趋势，高剂量组与对照组比较差异有显著性(p<0.05)。表3样品对大鼠红细胞内游离原卟啉的影响注：与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.013.小结在本实验室条件下，经口给予贫血模型大鼠0.83ml/kg·bw、1.67ml/kg·bw.5.00ml/kg·bw剂量的本发明提供的组合物后，5.00ml/kg·bw剂量组大鼠血红蛋白与低铁对照组比较差异有显著性(p<0.05)；三个剂量组大鼠血红蛋白升高幅度平均达到10g/L以上；5.00ml/kg·bw剂量组红细胞内游离原卟啉与对照组比较差异有显著性(p<0.05)。提示该样品具有改善动物缺铁性贫血功能。实施例8急性经口毒性试验、三项遗传毒性试验(Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验及小鼠精子畸形试验)、30天喂养实验《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)本发明提供的组合物毒理学实验1材料和方法1.1样品：实施例4制得的组合物，由无限极(中国)有限公司提供，人体口服推荐剂量为每日、10ml，体重按60kg计算，折合剂量0.167ml/kg·bw。因推荐量较大，每次取原液3000ml用旋转蒸发仪浓缩至1500ml成为2倍浓缩液，供试验用。折合2倍浓缩液推荐剂量0.0833ml/kg·bw。1.2实验动物及环境：SPF级ICR种小鼠由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证号SCXK(湘)2011-0003，SPF级昆明种小鼠、SD大鼠和饲料由长沙市天勤生物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号SCXK(湘)2014-0011。实验环境为屏障环境。实验期间实验环境温度21℃～24℃，湿度52％～60％。实验动物使用许可证号为SYXK(湘)2010-0010号。1.3小鼠急性毒性试验：采用最大耐受剂量法，选用体重为18g～22g的ICR种小鼠20只，雌雄各半。测2倍浓缩液比重为1.044g/ml，给小鼠经口灌胃1次，灌胃体积为0.2ml/l0g·bw，折合剂量为20.88g/kg·bw，灌胃前禁食16小时，灌胃后连续观察两周，记录中毒表现及死亡情况。1.4Ames试验：采用经鉴定符合要求的鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97a、TA98、TA100、TA102四株菌株进行试验。采用多氯联苯(PCB)诱导的大鼠肝微粒体酶(S-9)作为体外代谢活化系统。试验设五个剂量，分别为5000μg/皿、1000μg/皿、200μg/皿、40μg/皿、8μg/皿，同时设自发回变、溶剂对照和阳性突变剂对照。样品配制时，取样品2倍浓缩液1.25g加蒸馏水定容至25ml，其浓度为50mg/ml，以此液为原液，取5ml加蒸馏水至25ml配成10mg/ml，取10mg/ml浓度的液体5ml加蒸馏水至25ml配成2mg/ml，如此类推配成0.4mg/ml和0.08mg/ml浓度组，0.103MPa20min灭菌备用。试验时，在顶层琼脂中加入0.lml试验菌株增菌液、0.lml受试物溶液和0.5mlS-9混合液(当需要代谢活化时)，混匀后倒入底层培养基平板上。37℃培养48小时，计数每皿菌落数。如果受试物的回变菌落数超过自发回变菌落数的2倍以上，并有剂量-反应关系者定为阳性。每个剂量设三个平行皿，整套试验在相同试验条件下重复一次。1.5小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验：采用间隔24小时两次经口灌胃法进行试验。取体重为25～30g的昆明种小鼠50只，随机分为5组，每组10只，雌雄各半。以0.04g/kg·bw剂量的环磷酰胺为阳性对照，蒸馏水为阴性对照。试验组高、中、低剂量分别为10.00g/kg·bw、5.00g/kg·bw.2.50g/kg·bw，分别取样品2倍浓缩液50.00g、25.00g和12.50g加蒸馏水至100ml，阳性对照取0.100环磷酰胺加蒸馏水定容至50ml，配成相应的受试液给小鼠灌胃(0.2ml/10g·bw)。末次给样后6小时颈椎脱臼处死动物，取胸骨骨髓用小牛血清稀释涂片，甲醇固定，Giemsa染色。光学显微镜下，每只动物计数1000个嗜多染红细胞(PCE)，微核发生率以含微核的PCE千分率计。计数200个嗜多染红细胞，计算嗜多染红细胞与成熟红细胞的比值(PCE/NCE)。用Spss软件进行统计分析。1.6小鼠精于畸形试验：取体重25g～35g的雄性昆明种小鼠25只，随机分为5组，每组5只。以0.04g/kg·bw剂量的环磷酰胺为阳性对照，蒸馏水为阴性对照。试验组高、中、低剂量分别为10.00g/kg·bw、5.00g/kg·bw、2.50g/kg·bw，分别取样品2倍浓缩液50.00g.25.00g和12.50g加蒸馏水至100ml，配成相应的受试液给小鼠灌胃(0.2ml/10g·bw)。每日灌胃一次，连续5天，于末次灌胃后的第30天处死动物，取副睾涂片，伊红染色，每只动物计数1000个结构完整的精子，计算畸变精子发生率。用Spss软件进行统计分析。1.730天喂养试验：1.7.1剂量组选择与受试物给予方式：取SD大鼠80只，雌雄各半。将实验动物随机分为四组，即对照组及三个受试物组，每组20只，雌雄各半。设2倍浓缩液低、中、高剂量分别为以2.08ml/kg·bw、4.17ml/kg·bw、8.33ml/kg·bw，分别相当于人体推荐剂量的25、50、100倍。低、中、高剂量受试液配制时，分别取样品2倍浓缩液41.6ml、83.4ml，166.6ml加蒸馏水定容至200ml，对照组给予等体积蒸馏水，每日灌胃一次，灌胃体积为l.0ml/100g·bw，连续30天。1.7.2主要仪器与试剂：主要仪器：SYSMEXXT-2000i全自动血球计数仪，BECKMANCOULTERAU680全自动生化分析仪等。主要试剂：总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、血糖(GLU)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)试剂盒购自上海复星长征医学科学有限公司；肌酐(Cr)试剂盒购自上海申能—德赛诊断技术有限公司。1.7.3实验方法：实验期间所有动物单笼饲养，自由摄食饮水，每天观察动物的活动和生长情况，每周加食2次，记录给食量和剩食量，每周称一次体重，计算进食量和食物利用率，给受试物30天后禁食16小时采血。禁食前和禁食后(采血前)称量动物体重。采血时，每只大鼠摘眼球采集两份血：抗凝血用SYSMEXXT-2000i全自动血球计数仪测定血红蛋白(Hb)、红细胞压积(HCT)，进行红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、血小板(PLT)计数及WBC分类。非抗凝血分离血清，用BECKMANCOULTERAU680全自动生化分析仪测定TP、ALB、ALT、Cr、BUN、AST、CHOL、TG和GLU。采血后颈椎脱臼处死动物作大体解剖，称肝、肾、脾、睾丸重量，计算脏/体比值，取肝、肾、脾、胃、十二指肠、睾丸、卵巢作病理切片检查。在对各剂量组动物作大体检查未发现明显病变和生化指标改变时，只进行最高剂量组及对照组动物主要脏器的组织病理学检查，如发现病变则对较低剂量组相应器官及组织进行检查。1.7.4实验数据统计：用Excel、Spss软件进行统计分析。分析时，先对数据进行方差齐性检验，若方差齐，采用单因素方差分析进行总体比较，发现差异再用Dunnett法进行多个剂量组与一个对照组均数间的两两比较。若方差不齐则对原始数据进行适当的变量转换，满足方差齐性检验后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到方差齐的目的，改用秩和检验进行统计，发现总体比较有差异，则采用不要求方差齐性的Tamhane'sT2检验进行两两比较。结果2.1急性经口毒性试验表4样品急性经口毒性试验小鼠体重结果注：与对比例相比，*P＜0.05，**P＜0.01表5样品小鼠急性毒性试验结果由表4、5可见，以20.88g/kg·bw剂量的本发明提供的组合物2倍浓缩液给两种性别的ICR种小鼠灌胃后未见明显中毒症状，观察14天无死亡。观察期末将受试动物处死进行解剖检查，肝、脾、肾、胃、肠、心、肺等主要脏器，未见明显异常改变。本发明提供的组合物2倍浓缩液对ICR种雌、雄小鼠的最大耐受剂量(MTD)大于20.88g/kg·bw。根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)中的急性毒性分级标准，属无毒级。对本发明实施例1～3、实施例5～6制得的组合物进行上述试验，试验结果与实施例4制备的组合物的试验结果无显著差异(P＞0.05)。取对比例1～3制得的组合物进行上述试验，试验结果与实施例4制备的组合物的试验结果具有显著差异(P＜0.05)。表明本发明提供的组合物对ICR种雌、雄小鼠的最大耐受剂量(MTD)大于20.88g/kg·bw。根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)中的急性毒性分级标准，属无毒级。2.2Ames试验表6样品Ames试验结果(第一次)阳性对照：TA97a+S9、TA98+S9、TA100+S9采用2-AF(剂量:10.0μg/皿)；TA97a-S9、TA98-S9采用9-芴酮(剂量；0.2μg/皿)；TA100-S9采用NaN3(剂量：1.5μg/皿)；TA102+S9采用l，8-二羟蒽醌(剂量：50.0μg/皿)；TA102-S9采用MMC(剂量：0.5μg/皿)。表7同。表7样品Ames试验结果(第二次)由表6、7可见，对TA97a、TA98、Tal00、TA102四株试验菌株，加与不加S-9，样品各剂量组回变菌落数均未超过自发回变菌落数的2倍，亦无剂量—反应关系。2.3小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验表8实施例4制得的组合物对小鼠骨髓微核发生率的影响***与阴性对照组比较，P<0.001由表8可见，实施例4制得的组合物各剂量组微核率与阴性对照组比较差异无显著性(P>0.05)，而环磷酰胺组与阴性对照组比较差异有显著性(P<0.01)。样品各剂量组PCE/NCE比值未少于阴性对照组的20％，表明该样品对小鼠骨髓细胞未见明显毒性。对本发明实施例1～3、实施例5～6制得的组合物进行上述试验，试验结果与实施例4制备的组合物的试验结果无显著差异(P＞0.05)。取对比例1～3制得的组合物进行上述试验，试验结果与实施例4制备的组合物的试验结果具有显著差异(P＜0.05)。表明本发明提供的组合物PCE/NCE比值未少于阴性对照组的20％，表明该样品对小鼠骨髓细胞未见明显毒性。2.4小鼠精子畸形试验：表9实施例4制得的组合物对小鼠精子畸形发生率的影响**与阴性对照组比较，P<0.01由表9可见，实施例4制得的组合物各剂量组小鼠精子畸形发生率与阴性对照组比较差异无显著性(P>0.05)，而环磷酰胺阳性对照组与阴性对照组比较差异有显著性(P<0.01)。对本发明实施例1～3、实施例5～6制得的组合物进行上述试验，试验结果与实施例4制备的组合物的试验结果无显著差异(P＞0.05)。取对比例1～3制得的组合物进行上述试验，试验结果与实施例4制备的组合物的试验结果具有显著差异(P＜0.05)。表明本发明提供的组合物PCE/NCE比值未少于阴性对照组的20％，表明该样品对小鼠骨髓细胞未见明显毒性。2.530天喂养试验30天喂养期间，各组动物生长发育良好，无异常行为和中毒症状，无死亡。2.5.1对大鼠体重及食物利用率的影响见表10-15。喂养期间，各剂量组雌雄鼠各时点体重、末重和增重、每周及总进食量、每周及总食物利用率与对照组比较差异无显著性(P>0.05)。表10实施例4制得的组合物对大鼠体重的影响表11实施例4制得的组合物对大鼠食物利用率(第1周)的影响表12实施例4制得的组合物对大鼠食物利用率(第2周)的影响表13实施例4制得的组合物对大鼠食物利用率(第3周)的影响表14实施例4制得的组合物对大鼠食物利用率(第4周)的影响表15实施例4制得的组合物对大鼠总食物利用率的影响2.5.2对大鼠血常规指标的影响见表16-17。各剂量组雌雄大鼠的血红蛋白、红细胞总数、红细胞压积、血小板数、白细胞总数及分类与对照组比较，差异无显著性(P>0.05)。表16实施例4制得的组合物30天喂养试验血液学检查结果表17实施例4制得的组合物对大鼠WBC计数及其分类的影响续表17实施例4制得的组合物对大鼠WBC计数及其分类的影响2.5.3对大鼠生化指标的影响见表18-19。各剂量组雌雄大鼠的总蛋白、白蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、胆固醇、甘油三酯、尿素氮、肌酐、血糖与对照组比较均无显著性差异(P>0.05)。表18实施例4制得的组合物30天喂养试验末期生化检验结果表19实施例4制得的组合物30天喂养试验末期生化检验结果2.5.4对大鼠实验末禁食后体量、脏器重量和脏器，体重比值的影响由表20-21可见，各剂量组大鼠的实验末禁食后体重及肝脏、肾脏、脾脏、睾丸的绝对重量和肝/体、脾/体、肾/体、雄鼠睾/体比值与对照组比较，差异无显著性(P>0.05)。表20实施例4制得的组合物对大鼠实验末禁食后体重及脏器重量的影响表21实施例4制得的组合物对大鼠脏体比的影响2.5.5大体解剖及组织学检查结果2.5.5.1大体解剖检查共检查对照组和各剂量组共80只大鼠，雌、雄各半。剖检后肉眼观察，心、肺、肝、脾、肾、胃、肠、睾丸(卵巢)等主要脏器的色泽、大小、形态结构等均未见明显异常。2.5.5.2镜下检查检查高剂量组及对照组大鼠各20只，雌、雄各半。肝脏：被膜完整，肝小叶结构清楚，其中高剂量组雌鼠1只肝细胞见点状坏死。肾脏：被膜完整，肾小球、肾小管结构正常。其中对照组雌鼠1只、高剂量组雄鼠1只肾间质见少量炎性细胞浸润。胃肠：各层结构清楚，粘膜上层完整，粘膜下各层无异常。脾脏：被膜完整，脾小梁结构正常，红、白髓比例正常。卵巢：上皮与白膜正常，各级卵泡发育良好，无异常。睾丸：曲精管内各级生精细胞发育良好，无异常。上述检查结果表明，高剂量组雌、雄大鼠的肝、脾、肾、胃、肠、睾丸(卵巢)均未见明显与试验因素有关的病理组织学变化。对本发明实施例1～3、实施例5～6制得的组合物进行上述试验，试验结果与实施例4制备的组合物的试验结果无显著差异(P＞0.05)。取对比例1～3制得的组合物进行上述试验，试验结果与实施例4制备的组合物的试验结果具有显著差异(P＜0.05)。表明本发明提供的组合物饲喂动物后，动物生长发育良好，各剂量组体重、增重、食物利用率、血常规指标、血生化指标、脏器重量及脏器/体重比值与对照组比较，无显著性差异(P>0.05)。大体解剖和组织病理检查未见明显与样品有关的异常改变。提示本发明提供的组合物30天喂养对大鼠未见明显毒副作用。3小结本实验室条件下，本发明提供的组合物2倍浓缩液对ICR种雌、雄小鼠的最大耐受剂量(MTD)大于20.88g/kg·bw，属无毒级。Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验结果均为阴性。以2.08ml/kg·bw、4.17ml/kg·bw、8.33ml/kg·bw剂量的本发明提供的组合物2倍浓缩液给大鼠灌胃30天。实验期间，动物生长发育良好，各剂量组体重、增重、食物利用率、血常规指标、血生化指标、脏器重量及脏器/体重比值与对照组比较，无显著性差异(P>0.05)。大体解剖和组织病理检查未见明显与样品有关的异常改变。提示本发明提供的组合物30天喂养对大鼠未见明显毒副作用。4检验结论：在本实验条件下，对本发明提供的组合物2倍浓缩液进行下述毒理学实验，结果如下：1.急性经口毒性试验：对ICR种雌、雄小鼠的最大耐受剂量(MTD)大于20.88g/kg·bw，属无毒级。2.三项遗传毒性试验：Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验结果均为阴性。3.30天喂养试验：以2.08ml/kg·bw、4.17ml/kg·bw、8.33ml/kg·bw剂量的样品给大鼠灌胃30天，实验期间，动物生长发育良好，各剂量组体重、增重、食物利用率、血常规指标、血生化指标、脏器重量及脏器/体重比值与对照组比较，无显著性差异(P>0.05)。大体解剖和组织病理检查未见明显与样品有关的异常改变。提示本发明提供的组合物30天喂养对大鼠未见明显毒副作用。实施例9改善缺铁性贫血功能人体试食试验《改善缺铁性贫血功能评价方法》(国食药监保化[2012]107号)1材料和方法1.1样品：本发明实施例提供的组合物1号(实施例4制得的组合物)、2号(安慰剂组——安慰剂为水，下同)，均由无限极(中国)有限公司提供，二者在包装、外观、色泽及口感上基本一致。人口服每日1次，每次1支。1.2受试对象1.2.1纳入标准：受试者为小细胞低色素贫血，且有明确的缺铁原因和临床表现的成人男性，Hb80g/L-130g/L；成人女性，Hb80g/L-120g/L。1.2.2排除标准：1.2.2.1合并有心、脑血管、肝、肾、消化道等严重疾病及精神病患者。1.2.2.2过敏体质或对该受试样品过敏者。1.2.2.3严重贫血患者。1.2.2.4短期内服用与受试功能有关的物品，影响到对结果的判断者。1.2.2.5未按规定服用受试样品，资料不全影响功效或安全性判断者。1.3试验方法：1.3.1试验设计及分组采用自身和组间两种对照设计。按受试者的血红蛋白水平随机分为试食组和对照组，尽可能考虑影响结果的主要因素如性别、年龄、经济状况等，进行均衡性检验，以保证组间的可比性。1.3.2受试祥品的剂量和使用方法试食组按推荐服用方法、服用量服用受试产品，对照组服用安慰剂。受试样品给予时间30天。试验期间不改变原来的饮食习惯，正常饮食。2.观察指标：各项观察指标于试食试验开始及结束时各测定一次。2.1安全性指标2.1.1一般状况：试验前详细询问并了解受试者的精神、睡眠、饮食和大小便等情况，测量试验前后体重、血压、心率变化。2.1.2血、尿、便常规检查2.1.3肝、肾功能检查2.1.4腹部B超、胸透、心电图检查(各项指标在试验前检查一次)2.1.5不良反应观察。2.2膳食调查。于试验开始前、结束前进行三天的询问法膳食调查，观察饮食因素对试验结果的影响。2.3症状观察食欲不振、乏力、烦燥、头晕、眼花、精神不集中、心慌、气短等。2.4功效性观察：2.4.1血红蛋白测定。2.4.2红细胞内游离原卟啉：采用RF-540荧光光度计进行检测。2.4.3血清铁蛋白测定：采用ACS180全自动化学发光免疫分析仪进行检测。2.5结果判定受试样品组与对照组比较，血红蛋白升高且平均升高幅度三lOg/L，血清铁蛋白增加，血清运铁蛋白饱和度升高，红细胞游离原口h啉降低，经统计处理差异有显著性，即可分别判定该指标结果阳性。3数据处理及结果判定：试验数据为计量资料，可用t检验进行分析。凡自身对照资料可以采用配对t检验，两组均数比较采用成组t检验，后者需进行方差齐性检验，对非正态分布或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态方差齐后，用转换的数据进行t检验；若转换数据仍不能满足正态方差齐要求，改用t’检验或秩和检验；但变异系数太大(如CV>50％)的资料应用秩和检验。结果判定：试验前后自身比较和试验后组间比较，血红蛋白指标差异有显著性：同时，试食组自身前后比较，血红蛋白平均升高幅度≥10g/L，血清铁蛋白、红细胞内游离原卟啉/血清运铁蛋白饱和度二项指标中一项指标阳性，可判定该受试样品具有改善缺铁性贫血功能。4.结果双盲法观察结束揭晓：服食1号者为本发明实施例4提供的组合物，服食2号者为安慰剂。4.1一般情况：初始试验人群试食组52例，对照组52例，试食前后，受试者精神、睡眠、饮食、大小便状况未见异常。对照组：男/女为24/28，年龄55.67±9.17岁；试食组：男/女为24/28，年龄55.67±9.16岁。4.2安全性观察4.2.1红细胞计数观察服用本发明提供的组合物前红细胞计数无显著性差异(P>0.05)。试验后试食组红细胞计数与试食前及试食后对照组比较，差异无显著性(P>0.05)。结果见表22。表22试食前后红细胞计数4.2.2体重、血压、心率、尿常规、大便常规、白细胞及生化指标变化情况试食前、后试食组及对照组体重、血压、心率均未见明显异常改变，尿常规、大便常规、白细胞及生化指标测定均在正常范围内。结果见表23。表23体重、血压、心率、尿常规、大便常规、白细胞及生化指标测定结果4.2.3心电图、腹部B超、胸透检查，均在正常范围内。4.2.4试食期间未见明显不良反应。4.3主要营养素摄入情况试食组和对照组贫血人群的能量摄入、膳食蛋白质摄入、膳食铁摄入试食前后差异无显著性(P>0.05)。结果见表24。表24试食前后主要营养素摄入情况4.4功效指标观察4.4.1本发明提供的组合物对血红蛋白的影响试食前试食组与对照组血红蛋白含量，差异无显著性(P>0.05)，试食后试食组血红蛋白有所升高，自身前后及与试食后对照组比较，差异均有显著性(P<0.05)。试食组试食后血红蛋白较试食前平均上升13.14g/L。结果见表25。表25试食前后血红蛋白的变化(g/L，)组别试食前试食后对照组109.17±9.90110.25±9.86试食组109.13±8.74122.27±5.35***###注：***与试食前比较P<0.001###与对照组比较P<0.0014.4.2本发明提供的组合物对红细胞内游离原卟啉浓度的影响试食前试食组与对照组红细胞内游离原卟啉浓度，差异无显著性(P>0.005)，试食后试食组红细胞内游离原卟淋浓度下降，自身前后及与试食后对照比较，差异均无显著性(P>0.05)。结果见表26。表26试食前后红细胞内游离原卟啉水平(μg/L，)组别试食前试食后对照组913.77±81.92909.75±81.86试食组913.67±82.64868.77±76.00*#注：*与试食前比较P<0.05#与对照组比较P<0.054.4.3本发明提供的组合物对血清铁蛋白的影响试食前试食组与对照组血清铁蛋白，差异无显著性(P>0.05)，试食后试食组与试食前及试食后对照组血清铁蛋白比较，差异均有显著性(P<0.05)。结果见表27。表27试食前后血清铁蛋白水平(ng/mL，)组别试食前试食后对照组22.33±4.4822.42±4.49试食组22.26±4.5324.72±3.81*#注：*与试食前比较P<0.05#与对照组比较P<0.054.5脱失率经过30天试验后，对照组有0例受试者因间断服用受试品无法判断效果被筛除；试食组0例受试者因间断服用受试品无法判断效果被筛除。最后有效试验人群对照组52例，试食组52例。结果见表28。表28试验脱失率组别对照组(例)试食组(例)试食前5252脱失数00脱失率0.00％0.00％对本发明实施例1～3、实施例5～6制得的组合物进行上述试验，试验结果与实施例4制备的组合物的试验结果无显著差异(P＞0.05)。取对比例1～3制得的组合物进行上述试验，试验结果与实施例4制备的组合物的试验结果具有显著差异(P＜0.05)。表明本发明提供的组合物饲喂动物后，试食组血红蛋白与试食前及试食后对照组比较，差异均有显著性(P<0.05)，且与试验前比较，上升值大于10.0g/L：试食组人群红细胞内游离原卟啉浓度下降，与试食前及试食后对照组比较，差异均无显著性(P>0.05)；试食后血清铁蛋白与试食前及试食后对照组比较，差异均有显著性(P<0.05)。根据《改善缺铁性贫血功能评价方法》(国食药监保化[2012]107号)中规定的评判标准，提示本发明提供的组合物具有改善缺铁性贫血功能(成人)。5小结试验结果表明：服用本发明提供的组合物后，试食组血红蛋白与试食前及试食后对照组比较，差异均有显著性(P<0.05)，且与试验前比较，上升值大于10.0g/L：试食组人群红细胞内游离原卟啉浓度下降，与试食前及试食后对照组比较，差异均无显著性(P>0.05)；试食后血清铁蛋白与试食前及试食后对照组比较，差异均有显著性(P<0.05)。根据《改善缺铁性贫血功能评价方法》(国食药监保化[2012]107号)中规定的评判标准，提示本发明提供的组合物具有改善缺铁性贫血功能(成人)。6检验结论：试验结果表明：服用本发明提供的组合物后，试食组血红蛋白与试食前及试食后对照组比较，差异均有显著性(P<0.05)，且与试验前比较，上升值大于10.0g/L；试食组人群红细胞内游离原卟啉浓度下降，与试食前及试食后对照组比较，差异均无显著性(P>0.05)；试食后血清铁蛋白与试食前及试食后对照组比较，差异均有显著性(P<0.05)。根据《改善缺铁性贫血功能评价方法)(国食药监保化[2012]107号)中规定的评判标准，提示本发明提供的组合物具有改善缺铁性贫血功能(成人)。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3