一种酸枣仁-远志提取物及其制备方法与在改善睡眠中的应用与流程

本发明涉及一种酸枣仁-远志提取物及其制备方法与在改善睡眠中的应用，属于中药制剂技术领域。

背景技术：

酸枣仁为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa(Bunge)Hu ex H.F.Chou的干燥成熟种子。酸枣仁中主要成分为黄酮类、皂苷类、多糖类、挥发油类等物质。黄酮类化合物主要有斯皮诺素、6″′-阿魏酰斯皮诺素、6″′-对香豆酰斯皮诺素、6″′-对羟基苯甲酰斯皮诺素等。皂苷类化合物主要有酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B等。现代药理研究表明酸枣仁具有镇静安神、抗焦虑、抗抑郁、增强记忆等作用。

远志为远志科植物远志Polygala tenuifolia Willd.或卵叶远志Polygala sibirica L.的干燥根。远志具有安神益智、祛痰消肿功效。常用于心肾不交引起的失眠，健忘等症。远志中主要成分为皂苷类、寡糖酯类、挥发油类、有机酸类等物质。皂苷类化合物主要有远志酸、远志皂苷A、远志皂苷B、细叶远志素等。现代药理研究表明，远志具有镇静安神、增强记忆、抗痴呆、抗衰老等作用。

研究表明，酸枣仁发挥镇静安神作用的化学物质是黄酮类、皂苷类、脂肪油类、生物碱类。斯皮诺素、酸枣仁皂苷A是酸枣仁发挥镇静安神的主要单体化合物。

远志发挥镇静安神作用的化学物质是皂苷类。细叶远志皂苷是远志发挥镇静安神的主要单体化合物。目前对远志在镇静安神方面的研究，尤其是作用机制方面的研究还不足。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种酸枣仁-远志提取物，含有较高的总黄酮及总皂苷，能够用于改善睡眠问题。

本发明所提供的酸枣仁-远志提取物的制备方法，包括如下步骤：

将酸枣仁和远志粉碎后混合，经脱脂后利用乙醇水溶液进行提取，经过滤得到提取液；所述提取液经分离纯化即得所述酸枣仁-远志提取物。

上述的制备方法中，所述酸枣仁与所述远志的质量比可为1～2：1～2，具体可为1：1、2：1或1：2；

所述提取的条件如下：

所述乙醇水溶液的体积浓度为65％；

温度为70℃；

时间为60min；

液固比为10mL/g；

本发明是根据所述总黄酮、总皂苷含量测定方法中总黄酮、总皂苷的含量，得到上述最优参数的，其中总皂苷指的是提取液中酸枣仁皂苷与远志皂苷质量之和。

上述的制备方法中，采用大孔吸附树脂分离纯化所述提取液，如D101大孔吸附树脂；

所述分离纯化的条件如下：

依次采用蒸馏水、体积浓度为30％的乙醇水溶液、体积浓度为50％的乙醇水溶液和体积浓度为70％的乙醇水溶液进行洗脱，洗脱体积分别为8BV、8BV、8BV和4BV；体积浓度为30％的乙醇水溶液的洗脱液中黄酮纯度为37.8％，体积浓度为70％的乙醇水溶液中皂苷纯度为45.0％。

在上述条件下对所述提取液进行分离纯化，经3次试验，得到的酸枣仁-远志提取物中，黄酮平均纯度约37.5％，皂苷平均纯度约45.0％。

按照如下方式装柱：将所述大孔吸附树脂用95％乙醇水溶液浸泡24h，采用湿法装柱。用95％乙醇水溶液洗脱至流出液1份加5份水不出现浑浊，然后用大量蒸馏水洗至无醇味。

上述方法制备得到的酸枣仁-远志提取物也是本发明的保护范围。

本发明提供的酸枣仁-远志提取物能够改善睡眠水平，具体表现为：提高脑组织中5-HT在总蛋白中的含量、降低脑组织中NE在总蛋白中的含量、降低脑组织中GABA在总蛋白中的含量、降低脑组织中DA在总蛋白中的含量。

本发明具有如下优点：

(1)得到了提取药对总黄酮、总皂苷的最佳提取分离纯化工艺，实现了有效成分的富集，提取条件温和，得率高；

(2)得到了镇静安神最佳有效部位，其药理活性明显提高，为酸枣仁-远志镇静安神新型保健品的开发提供有效的部位，减少了药物的服用量；

(3)得到的有效部位的镇静安神作用效果明显，组织学检查对肝、肾无影响。

附图说明

图1为乙醇浓度对提取液中总黄酮、总皂苷得率的影响。

图2为液固比对提取液中总黄酮、总皂苷得率的影响。

图3为提取时间对提取液中总黄酮、总皂苷得率的影响。

图4为提取温度对提取液中总黄酮、总皂苷得率的影响。

图5为乙醇浓度、温度的等高线图和响应曲面图。

图6为液固比、温度的等高线图和响应曲面图。

图7为总黄酮、总皂苷的泄露曲线。

图8为总黄酮、总皂苷的洗脱曲线，其中，1～4号表示蒸馏水洗脱液；5～8号表示30％乙醇洗脱液；9～12号表示50％乙醇洗脱液；13～16号表示70％乙醇洗脱液；17～20号表示90％乙醇洗脱液。

图9为斯皮诺素(a1)、30％洗脱样品(a2)和70％洗脱样品(a3)的色谱图。

图10为远志皂苷元(b1)、30％洗脱样品(b2)和70％选择题样品(b3)的色谱图。

图11为斯皮诺素的标准曲线。

图12为远志皂苷元的标准曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、酸枣仁-远志提取液的制备

1、总黄酮、总皂苷含量测定方法的建立

1.1供试品的制备

粉碎药材→混匀(酸枣仁、远志质量比为2:1)→石油醚脱脂→脱脂药材粉末→热回流提取法→过滤→测定总黄酮、总皂苷得率。

注：总皂苷为提取液中酸枣仁皂苷与远志皂苷质量之和。

1.2线性关系考察

总黄酮标准曲线：以斯皮诺素为标准品，甲醇为溶剂，斯皮诺素浓度C(mg/mL)与吸光度A的回归方程A＝44.533C+0.0081，r＝0.9998，在5～17μg/mL线性关系良好。

总皂苷标准曲线：以酸枣仁皂苷A、远志皂苷元为标准品，采用香草醛-高氯酸显色法，酸枣仁皂苷A质量C1(mg)与吸光度A1回归方程为A1＝1.9C1+0.0357，r＝0.9983，在0.1～0.4mg线性关系良好；远志皂苷元质量C2(mg)与吸光度A2回归方程为A2＝14.04C2-0.1397，r＝0.9962，在0.0200～0.0702mg线性关系良好。

1.3精密度、重复性和稳定性试验

取酸枣仁皂苷A对照品溶液，连续测定6次，计算RSD为0.0632％，仪器精密度良好。

对于同一批药材，按照1.1项下供试品溶液的制备方法平行制备6份，分别测定总黄酮、酸枣仁皂苷和远志皂苷的含量，RSD分别为0.0240％、0.607％和0.0895％，重复性良好。

精密取供试品，分别在0、2、4、6、8、12h下测得总黄酮、酸枣仁皂苷和远志皂苷的浓度或质量，RSD分别为0、0.319％和0.0850％，稳定性良好。

1.4加样回收试验

称取药材6份，精密加入适量的对照品斯皮诺素、酸枣仁皂苷A和远志皂苷元，热回流提取，计算RSD。结果如表1、表2和表3所示。

表1总黄酮加样回收试验

表2酸枣仁皂苷加样回收试验

表3远志皂苷加样回收试验

2、单因素试验设计与结果分析

2.1乙醇浓度对总黄酮和总皂苷得率影响

在提取温度80℃，时间60min，液固比10mL/g时，研究乙醇浓度(体积)：50％、60％、70％、80％、90％对总黄酮和总皂苷得率影响。结果如图1可知随着乙醇浓度升高总皂苷得率增加，70％时达到最大值。而乙醇浓度60％与70％时，黄酮得率基本相同，其他趋势与总皂苷相同。确定适宜乙醇浓度为70％。

2.2液固比对总黄酮和总皂苷得率影响

在乙醇浓度70％，提取时间60min，提取温度80℃时，研究液固比：6mL/g、8mL/g、10mL/g、12mL/g、14mL/g对总黄酮和总皂苷得率的影响。由图2可知，液固比为10mL/g黄酮得率最大。总皂苷得率随着液固比增加而增大，考虑到后期的浓缩，确定适宜液固比10mL/g。

2.3提取时间对总黄酮和总皂苷得率影响

在乙醇浓度70％，液固比10mL/g，提取温度80℃时，考察提取时间：20min、40min、60min、80min、100min对总黄酮和总皂苷得率影响。可知60min时黄酮和皂苷得率均达到最大，确定适宜提取时间为60min。

2.4提取温度对总黄酮和总皂苷得率影响

在乙醇浓度70％，提取时间60min，液固比10mL/g时，考察提取温度：40℃、50℃、60℃、70℃、80℃对总黄酮和总皂苷得率影响。结果如图4可知适宜提取温度为70℃。

3、响应曲面设计结果及分析

根据单因素试验结果，在各因素最大得率附近进行方差分析。乙醇浓度、液固比、时间、温度四个因素，黄酮得率方差分别为：0.0016、0.0017、0.0097、0.0091，皂苷得率方差分别为：0.973、0.236、0.148、0.211。选择方差大的3个因素，由于黄酮得率方差极小，故选择以皂苷得率为响应指标设计响应曲面试验。响应曲面设计选择液固比、乙醇浓度、温度三因素。

3.1总皂苷响应曲面试验与结果

表4总皂苷响应曲面设计试验方案与结果

注：液固比编码水平“0”为10mL/g；乙醇浓度编码水平“0”为60％；温度编码水平“0”为70℃

表5回归模型的方差分析结果

应用Design-Expert V8.0.6软件对表4数据进行多元回归拟合及显著性检验，结果为表5所示。因素A、B、C与总皂苷得率Y之间的二次多项回归方程为：Y＝9.31+0.27×A+0.21×B+0.061×C-0.20×A×C+0.35×B×C-0.25×B²-0.48×C²，R²＝0.9303，模型复相关系数r＝0.9645，说明该模型对试验实际情况拟合良好，试验误差较小。整体模型的P<0.05，表明该二次方程模型有显著性；模型失拟项P>0.05，表明模型选择较为合适，整体说明应用该响应曲面模型预测总皂苷的提取试验是可行的。因素A、B(P<0.05)对提取效果的线性效应均显著，因素B²、C²(P<0.05)对提取效果的曲面效应均显著；因素AC、BC(P<0.05)对提取效果的交互影响均有显著性。

3.2响应曲面图与工艺预测

等高线的形状反映出交互效应的强弱大小，两因素交互作用显著则等高线为椭圆形，相反为圆形，由图可知乙醇浓度与温度、液固比与温度交互影响对皂苷得率均影响显著且前者影响更大。在三维图中，表现是三维图陡峭。通过软件对模型极值求解和分析等高线得到最佳提取工艺：液固比为12.00mL/g，乙醇浓度64.33％，温度70.11℃，时间60.00min，预测得率为9.62％。

3.3验证试验

考虑到实际操作、后续处理及成本，将提取方案修正为液固比10mL/g、乙醇浓度65％、温度70℃、时间60min。对该方案进行三次验证性实验，总黄酮平均得率2.60％，总皂苷平均得率9.40％。

实施例2、酸枣仁-远志提取物的制备

1、大孔树脂工艺参数考察与优化

1.1提取物的制备与大孔树脂的预处理

将酸枣仁、远志分开粉碎成粗粉，以质量比2:1过筛混匀。用石油醚进行脱脂，脱脂药材粉末用10倍量65％乙醇水溶液(mL/g)，在70℃下提取两次得提取液，每次1h。用D101大孔吸附树脂对提取液进行分离纯化。

将D101大孔吸附树脂用95％乙醇水溶液浸泡24h，采用湿法装柱。用95％乙醇水溶液洗脱至流出液1份加5份水不出现浑浊，然后用大量蒸馏水洗至无醇味。

1.2泄露曲线考察

采用实施例1中的最佳条件下，即液固比10mL/g、乙醇浓度65％、温度70℃、时间60min所获得的提取药液，用于本实例中。其总黄酮浓度1.14mg/mL，总皂苷浓度4.54mg/mL。取8mL预处理过的D101大孔树脂湿法装柱，以流速0.5BV/h上样进行动态吸附。当流出液中物质浓度为原液浓度的1/10时表示达到泄漏点。结果如图7可知，当总皂苷达到最大上样量时，黄酮还未达到。最终确定8mL大孔吸附树脂柱可吸附9.12mg的总黄酮，36.32mg的总皂苷。

1.3洗脱剂浓度的考察

按1.2中操作上样，依次用蒸馏水，不同浓度乙醇：30％、50％、70％、90％各4BV进行动态洗脱，洗脱流速为1BV/h，按以1BV/份收集流分，计算洗脱率，绘制洗脱曲线，如图8所示。

表6洗脱剂浓度考察

注：(1)“--”表示未检出；(2)A代表总黄酮；B代表总皂苷；(3)被测成分洗脱率＝[洗脱液被测成分量(mg)/树脂吸附被测成分量(mg)]×100％

结果表明，蒸馏水用量3BV时，洗脱液中未检测出总黄酮和总皂苷，用50％乙醇，洗脱率均较高。30％乙醇洗脱黄酮效果虽不及50％乙醇，但30％洗脱液中总黄酮量多于总皂苷量。故30％乙醇用来洗脱总黄酮，50％、70％乙醇洗脱总皂苷。

1.4洗脱剂用量的考察

取5mL预处理过的D101大孔吸附树脂，按最大上样量上样，依次用蒸馏水、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇进行梯度洗脱。当用蒸馏水8BV时Molish反应为阴性，30％、50％乙醇8BV、70％乙醇4BV、30％乙醇洗脱黄酮纯度为37.8％，70％洗脱皂苷纯度45.2％。故用蒸馏水、30％、50％乙醇8BV，70％乙醇4BV依次洗脱(1BV等于8mL)。

1.5验证试验

取3份8mL提取液，按上述条件上样及洗脱，3次试验，黄酮平均纯度为37.5％，皂苷平均纯度为45.0％。

实施例3、协同戊巴比妥钠睡眠实验结果

各水提液对小鼠睡眠的影响如表7和表8所示。

表中，药对水提液指的是酸枣仁和远志粉碎混合经脱脂后用水提取得到的水提液；酸枣仁水提液指的是酸枣仁粉碎混合经脱脂后用水提取得到的水提液；远志水提取液指的是远志粉碎混合经脱脂后用水提取得到的水提液。

表7各水提液对小鼠30min入睡率的影响

表8各水提液组对小鼠睡眠水平的影响

与空白组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与药对水提液比较：^△P＜0.05，^△△P＜0.01

与空白组相比，药对水提液、酸枣仁水提液、远志水提液均能增加阈下剂量戊巴比妥钠30min入睡百分率，药对水提液和远志水提液均能缩短小鼠睡眠潜伏期，延长小鼠睡眠持续时间。与药对水提液相比，酸枣仁水提液组、远志水提液组小鼠睡眠持续时间缩短，说明酸枣仁远志配伍具有协同作用。

上述实验结果表明，药对水提液对小鼠睡眠水平影响更强，进一步说明了酸枣仁，远志配伍可改善小鼠睡眠水平。

表9药对水提液，70％洗脱部位对小鼠30min入睡率的影响

表10药对水提液，70％洗脱部位对小鼠睡眠水平的影响

与空白组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与药对水提组比较：^ΔΔP＜0.01

与空白组相比，70％洗脱部位各剂量组均能增加阈下剂量戊巴比妥钠30min入睡百分率，缩短阈上剂量戊巴比妥钠小鼠睡眠潜伏期。与药对水提液比，70％洗脱部位各剂量组均能增加30min入睡百分率。由实验结果可知，70％洗脱部位能改善小鼠睡眠。

表11药对水提液，30％洗脱部位对小鼠30min入睡率的影响

表12药对水提液，30％洗脱部位对小鼠睡眠水平的影响

与空白组比较：**P＜0.01；与药对水提组比较：^△P＜0.05，^△△P＜0.01

与空白组相比，30％洗脱部位高、中、低剂量均能增加30min入睡百分率，缩短小鼠睡眠潜伏期，延长睡眠持续时间。与药对水提组相比，30％部位高、中、低剂量组30min内的小鼠入睡百分率均增加，30％部位中剂量组小鼠睡眠潜伏期缩短。

由实验结果可知，30％洗脱部位可改善小鼠睡眠水平，并且比药对水提液效果好。

表13不同洗脱部位对小鼠30min入睡率的影响

表14不同洗脱部位对小鼠睡眠水平的影响

与30％部位高剂量相比：^★P＜0.05，^☆P＞0.05

按生药量计算，30％洗脱部位高剂量组和70％洗脱部位低剂量组给药量相等，因此对这两组进行比较。

与70％洗脱部位低剂量相比，30％洗脱部位高剂量能够增加30min入睡率，并且延长小鼠睡眠持续时间，缩短睡眠潜伏期。说明30％洗脱部位比70％洗脱部位效果好。

通过协同戊巴比妥钠睡眠实验研究得出，酸枣仁-远志药对配伍有意义，并且其30％洗脱部位效果最好。

实施例4、30％洗脱部位对PCPA失眠模型小鼠神经递质含量的影响

表15各组小鼠5-HT、NE、GABA、DA在总蛋白中含量变化

与空白组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较：^ΔP＜0.05，^ΔΔP＜0.01

采用的复方酸枣仁胶囊由重庆希尔安药业有限公司提供，成分：酸枣仁(制)、左旋延胡索乙素，辅料为淀粉；规格：每粒装0.4g(含左旋延胡索乙素60mg)。

PCPA是5-HT的合成抑制剂，造成睡眠昼夜节律消失，达到完全失眠，NE是以兴奋中枢和觉醒功能为主，两者之间存在相互抑制。DA也主要在觉醒状态中起着极其重要的作用。由表15中的数据可以看出，与正常组相比，模型组小鼠大脑组织中5-HT、在总蛋白中比例显著降低，NE、DA、GABA在总蛋白中比例含量升高，说明实验造模成功。

GABA是抑制性神经递质，但模型组小鼠GABA在总蛋白中比例升高，可能原因是：(1)小鼠失眠过程中机体长时间维持清醒状态，体力大量消耗，内环境紊乱，导致氨基酸类神经递质代谢的改变，(2)神经元的持续兴奋状态导致兴奋性神经递质的过度利用和消耗，抑制性神经递质则相对过量储存和堆积，从而拮抗兴奋性递质的神经毒性对神经元的损伤而发挥保护性抑制作用。

与模型组相比，30％部位各给药组的小鼠脑组织中5-HT在总蛋白比例均显著升高，30％部位低剂量组小鼠脑组织中NE在总蛋白比例显著下降，30％部位高剂量组小鼠脑组织中GABA在总蛋白中比例显著降低，30％部位中剂量组小鼠DA在总蛋白比例显著降低，说明30％洗脱部位可能通过作用于5-HT、NE、GABA、DA来改善小鼠失眠。

实施例5、HPLC法测酸枣仁-远志不同洗脱部位中斯皮诺素与远志皂苷元含量

1方法与结果

1.1对照品溶液的制备

分别精密称取斯皮诺素对照品2.3mg，远志皂苷元2.7mg于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀后分别得0.23mg/mL，0.27mg/mL的对照品溶液，临用前用0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

1.2供试品溶液的制备

1.2.1 30％、70％洗脱部位斯皮诺素供试品溶液的制备

精密称取30％洗脱部位冻干粉43.2mg于10mL容量瓶中，70％洗脱部位冻干粉80.7mg于5mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，临用前用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

1.2.2 30％、70％洗脱部位远志皂苷元供试品溶液的制备

精密称取30％洗脱部位冻干粉0.271g，70％洗脱部位0.1016g分别置于圆底烧瓶中，各加20mL10％盐酸使溶解，置于沸水浴中回流2h，滤过得褐色沉淀与滤纸上，用甲醇少量多次洗滤纸，使沉淀溶解并过滤于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

1.3色谱条件

1.3.1斯皮诺素

色谱柱：Venusil XBP C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈(A)—水(B)，梯度洗脱(0～10min，12％A→19％A；10～16min，19％A→20％A；16～22min，20％A→100％A；22～30min；100％A；30～35min，100％A→12％A)；检测波长：335nm；体积流量：1mL·min^-1；柱温：30℃。进样量：10μL。

在上述条件下，样品中斯皮诺素达到基线分离，样品中其他成分对分析无明显干扰，见色谱图9。

1.3.2远志皂苷元

色谱柱：Venusil XBP C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈(A)—0.1％磷酸溶液(B)；梯度洗脱(0～10min，10％A；10～30min，10％A→65％A；30～50min，65％)；体积流量：1mL·min^-1；检测波长：210nm；柱温：30℃；进样量：10μL。

在上述条件下，样品中远志皂苷元达到基线分离，样品中其他成分对分析无明显干扰，见色谱图10。

1.4标曲制备

精密量取1、3、4、5、6μL斯皮诺素对照品溶液，分别按1.3.1项下色谱条件进样测定；精密量取1、2、4、6、8、10、20μL远志皂苷元对照品，分别按1.3.2项下色谱条件进行测定；记录峰面积，以进样量为横坐标(X)、峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线，得斯皮诺素回归方程：Y＝2360X+4.8946，r＝0.9997，结果表明，斯皮诺素进样量在0.2245～1.3542μg范围内线性关系良好；远志皂苷元回归方程：Y＝1279.1X+45.453，r＝0.9999，结果表明，远志皂苷元进样量在0.2619～5.238μg范围内线性关系良好。结果如图11和图12所示。

1.5样品测定

取1.2.1项下30％、70％洗脱部位冻干粉供试品溶液各10μL，按照1.3.1项色谱条件分别进样测定。取1.2.2下30％洗脱部位供试品溶液20μL，70％洗脱部位供试品溶液10μL，按照1.3.2项下色谱条件分别进样测定。得出供试品溶液中斯皮诺素、远志皂苷元含量，实验结果如表16所示。

表16不同洗脱部位中斯皮诺素、远志皂苷元的含量

注：“—”代表无。