豆芋叶多糖的抗肿瘤用途的制作方法

本发明涉及医药领域，具体涉及一种豆芋叶多糖的抗肿瘤用途。

背景技术

肝病，在现代医学指的是以解剖形态学为基础的肝脏器官的疾病，例如病毒性急、慢性肝炎、肝硬化、血吸虫肝病、脂肪肝、肝脏囊肿以及肝脏海绵状血管瘤等等。肝病主要发病原因是乙肝病毒感染，长期的慢性炎症引起肝细胞过度的代偿性增殖会诱发肝癌。全世界约20亿人群曾感染乙肝，3.5亿慢性乙肝病毒携带者中30％发展成肝硬化；我国乙肝病毒感染者达1.2亿，约有20％慢性肝炎患者发展为肝硬化和肝癌患者，80％-90％的肝癌患者经历“慢性肝炎-肝硬化-肝癌”的过程。肝癌也称为癌中之王，全世界恶性肿瘤中发病率排第五，病死率位列前三，男性病死率为第二。我国是肝病高发国家，肝癌患者占全球约50％，每年新发患者在10万以上，在我国所有肿瘤中肝癌的致死率高居第二位，每年死于肝病患者超过30万人，其中半数为肝癌。

目前用于治疗癌症的化学药物仍存在许多弊端，例如药物在作用于癌症肿瘤细胞的同时也对正常细胞产生了毒副作用，使患者产生严重的不良反应等问题。近年来基于天然植物药具有毒副作用较低、无致突变性及可以通过增强自身免疫力而促进癌症肿瘤细胞凋亡等特点，对其抗癌抗肿瘤作用的研究不断深入。

豆芋(apiosamericanamedikus)原产于北美洲东部的加拿大至美国佛罗里达州的南部地区，属多年生豆科植物(蝶形叶科亚科)。其可食用部分为地下块茎，且其蛋白质含量高于其他植物块茎，是一种既营养又有经济价值的作物，因而常被印第安人作为主食。豆芋自2009年国内引种成功，并被逐渐在富阳、金华、龙游、温州等地推广种植。研究表明豆芋不同部位(花、藤、叶、块茎)均含有丰富的游离氨基酸、可溶性蛋白、多糖、皂苷、黄酮、异黄酮、维生素c、维生素e和矿物质等成分。其中，豆芋较高含量的维生素e、总皂苷和异黄酮，具有极大的开发潜力。因此，目前很多营养与保健食品的研究人员都非常关注有肿瘤预防的研究与话题，但对于豆芋叶提取物的抗肿瘤活性鲜有报道。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种豆芋叶多糖的抗肿瘤用途，为医学、食品科学等领域开发天然抗肿瘤制剂提供新资源。

为解决上述技术问题，本发明提供一种豆芋叶多糖的抗肿瘤用途：

所述豆芋叶多糖用于制备抗肿瘤的食品或药物的应用。

作为本发明豆芋叶多糖的抗肿瘤用途的改进：

所述抗肿瘤食品或药物为缓解因肿瘤导致体重下降的食品或药物。

作为本发明豆芋叶多糖的抗肿瘤用途的进一步改进：

所述抗肿瘤食品或药物为降低肿瘤体积和重量的食品或药物。

作为本发明豆芋叶多糖的抗肿瘤用途的进一步改进：

所述抗肿瘤食品或药物为调节血清中细胞因子分泌情况的食品或药物。

作为本发明豆芋叶多糖的抗肿瘤用途的进一步改进：

所述豆芋叶多糖的制备方法包括以下步骤：

①、豆芋叶多糖粗品的制备：

1.1、按照1g：8～12ml(较佳为1g:10ml)的料液比将豆芋叶和蒸馏水混合后先进行提取(提取的同时也实现了灭酶)，然后打浆，再离心(4000r/min离心30min)，取上清液抽滤并收集滤液；

1.2、将离心所得的滤渣代替豆芋叶按步骤1.1重复提取两次，合并三次滤液，旋蒸浓缩(至原体积1/4～1/6)得到浓缩液；

1.3、将步骤1.2所得浓缩液于搅拌条件下加入乙醇(纯乙醇)至乙醇最终浓度为85±5％，4±1℃下静置24±2h后收集沉淀，得豆芋叶粗多糖；

②、豆芋叶粗多糖的纯化，依次进行以下步骤：

a、活性炭脱色：

将豆芋叶粗多糖用蒸馏水溶解(蒸馏水的用量只需能保证豆芋叶粗多糖溶解即可)，得豆芋叶粗多糖溶液，在豆芋叶粗多糖溶液中加入活性炭搅拌后过滤；

注：上述豆芋叶粗多糖溶液中加入活性炭于80±10℃水浴锅中搅拌45±5min后过滤；豆芋叶粗多糖与活性炭的质量比为10～20:1；

以所得的滤液替代上述豆芋叶粗多糖溶液重复上述加入活性炭及搅拌后过滤的脱色过程，直至最终所得的滤液呈无色，得脱色后多糖粗品溶液；

b、sevage法脱蛋白：

在脱色后多糖粗品溶液中加入sevage试剂，于磁力搅拌器中1000±100转/min转速搅拌30±5min，然后离心，除去位于下层的水层和位于上层的溶剂层之间的变性蛋白；所述sevage试剂由正丁醇：氯仿＝1:4～6的体积比混合而得；

以所得的除去变性蛋白后的所得物替代上述脱色后多糖粗品溶液重复上述加入sevage试剂、磁力搅拌、离心，除去变性蛋白的脱蛋白过程5～8次，得除去蛋白质的多糖溶液；

将除去蛋白质的多糖溶液旋蒸浓缩直至为原体积的8～12％，将浓缩液于-70～-90℃预冻5～7h，然后用真空冷冻干燥机干燥成粉末状，得到豆芋叶多糖。

本发明通过在裸鼠皮下接种肝癌细胞huh7使其成瘤，同时给予豆芋叶多糖干预，监测实验过程中裸鼠体重、肿瘤体积的变化情况。干预实验结束后剥离皮下肿瘤，记录瘤重并对血清中细胞因子分泌情况进行检测，发现豆芋叶多糖干预具有显著的抗肿瘤效果。本发明的豆芋叶多糖的用法为口服，用量每次约150～250mg，每日三次。

本发明同现有技术相比，具有以下优点：

1、本发明首次发现豆芋叶多糖能够有效的减轻裸鼠皮下肿瘤重量，体现显著的抗肿瘤活性，具有良好的开发前景。

2、本发明为豆芋叶多糖提供了新的医疗用途，拓展了一个新的应用领域。

附图说明

图1为本发明中不同浓度豆芋叶多糖对小鼠体重的影响。

图2为本发明中不同浓度豆芋叶多糖对小鼠肿瘤体积的影响。

图3为本发明中不同浓度豆芋叶多糖对小鼠肿瘤重量的影响。

图4为本发明中不同浓度豆芋叶多糖对抑瘤率的影响。

图5为本发明中不同浓度豆芋叶多糖对小鼠血清γ-干扰素(ifn-γ)的影响。

图6为本发明中不同浓度豆芋叶多糖对小鼠血清白细胞介素-2(il-2)的影响。

图7为本发明中不同浓度豆芋叶多糖对小鼠血清白细胞介素-6(il-6)的影响。

图8为本发明中不同浓度豆芋叶多糖对小鼠血清肿瘤坏死因子-α(tnf-α)的影响。

注：本发明图1～图8中：

control代表对照组(灌胃生理盐水)。

5-fu代表阳性对照组(灌胃150mg/(kg·d)5-氟尿嘧啶)。

l代表低剂量组(灌胃100mg/(kg·d)豆芋叶多糖)。

m代表中剂量组(灌胃200mg/(kg·d)豆芋叶多糖)。

h代表高剂量组(灌胃300mg/(kg·d)豆芋叶多糖)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、豆芋叶多糖的抗肿瘤用途，如图1-图8所示，豆芋叶多糖具有显著的抗肿瘤效果。豆芋叶多糖具体制备步骤如下：

(1)、豆芋叶多糖粗品的制备：

(1.1)、按照1g:10ml的料液比，称取豆芋叶100g加入1000ml蒸馏水，80℃水浴4h进行提取(提取的同时也实现了灭酶)，然后打浆，再离心(4000r/min离心30min)，将离心所得的上清液抽滤并收集滤液；

(1.2)、将步骤(1.1)离心所得的滤渣代替步骤(1.1)中豆芋叶，重复提取2次，合并三次滤液旋转蒸发浓缩直至为原体积的1/5，得浓缩液。

(1.3)、将步骤(1.2)所得浓缩液于搅拌条件下加入乙醇(纯乙醇)至乙醇最终浓度为85％，4℃下静置24h后收集沉淀，得豆芋叶粗多糖；

(2)、豆芋叶多糖粗品的的纯化，依次进行以下步骤

a、活性炭脱色：

将豆芋叶粗多糖置于烧杯中用蒸馏水溶解(蒸馏水的用量只需能保证豆芋叶粗多糖溶解即可)，得豆芋叶粗多糖溶液，在豆芋叶粗多糖溶液中加入活性炭于80±10℃水浴锅中搅拌45min后过滤；豆芋叶粗多糖与活性炭的质量比为15:1；

以所得的滤液替代上述豆芋叶粗多糖溶液重复上述加入活性炭及搅拌后过滤的脱色过程3次，此时最终所得的滤液呈无色，得脱色后多糖粗品溶液；

b、sevage法脱蛋白：

按照4:1的体积比，在400ml脱色后多糖粗品溶液中加入100mlsevage试剂，于磁力搅拌器中1000转/min转速搅拌30min，然后离心，通过分液漏斗除去位于下层的水层和位于上层的溶剂层之间的变性蛋白；所述sevage试剂由正丁醇：氯仿＝1：5的体积比混合而得；

以所得的除去变性蛋白后的所得物替代上述脱色后多糖粗品溶液重复上述加入sevage试剂、剧烈振荡、离心，除去变性蛋白的脱蛋白过程5次，得除去蛋白质的多糖溶液；

将除去蛋白质的多糖溶液旋蒸浓缩得到浓缩液(约为原体积的10％)，将浓缩液在-80℃预冻6h，然后用真空冷冻干燥机48h(真空冷冻干燥机设定的工艺参数为-40℃，1.2pa)将其干燥成粉末状(含水率≤0.1％)，得到豆芋叶多糖。

将上述制备获得的豆芋叶多糖进行干预皮下荷瘤小鼠，观察其体重和瘤体积变化，实验结束剥离肿瘤并记录各组小鼠肿瘤重量，同时检测血清中细胞因子分泌情况，具体步骤为：

1、实验动物分组与处理；

将肝癌细胞huh7在37℃、95％湿度和5％co2孵箱中培养，增殖若干板后，胰酶消化细胞，无血清dmem培养基重悬细胞，收集细胞，注射于6周龄裸鼠腋下，每只注射约一百万个细胞，10天后待肿瘤体积均成0.2cm3即可给药，此时为实验开始第1天。

组别设计分别为：对照组，灌胃生理盐水；阳性对照组，灌胃150mg/(kg·d)5-氟尿嘧啶(5-fu)；低剂量豆芋叶多糖组(l)，灌胃100mg/(kg·d)豆芋叶多糖；中剂量豆芋叶多糖组(m)，灌胃200mg/(kg·d)豆芋叶多糖；高剂量豆芋叶多糖组(h)，灌胃300mg/(kg·d)豆芋叶多糖，每组10只。实验期间小鼠自由进食和饮水，实验持续28天。

2、记录豆芋叶多糖对实验小鼠体重的影响：

实验期间每4天记录体重。根据图1可知，随着实验周期延长，阳性对照5-fu组裸鼠体重下降最为明显，对照组在实验第八天后体重几乎平稳无明显增加。同对照组和阳性药物5-fu组相比，低、中、高三个剂量豆芋叶多糖干预均能缓解因荷瘤后裸鼠体重的下降。以上结果表明豆芋叶多糖具有缓解荷瘤裸鼠体重下降的功效。

实施例2、豆芋叶多糖对小鼠肿瘤体积的影响；

测定实施例1中灌胃28天后的小鼠肿瘤体积(处死前)，结果如图2所示，对照组肿瘤体积最大，同对照组相比阳性对照组和不同浓度豆芋叶多糖干预组对肿瘤体积的增加具有一定的抑制作用，且阳性药物组肿瘤体积最小。以上结果表明豆芋叶多糖能够缓解荷瘤裸鼠肿瘤体积的增大。

实施例3、豆芋叶多糖对小鼠肿瘤重量和抑瘤率的影响；

将实施例1中灌胃28天后的小鼠禁食12h，眼眶取血后将小鼠颈椎脱臼处死，剥离腋下肿瘤并称重记录。按照公式：抑瘤率＝(1-实验组瘤块重量/对照组瘤块重量)*100％。结果如图3，图4所示，阳性对照组和不同浓度豆芋叶多糖干预组对肿瘤的生长均具有抑制作用，且阳性药物组抑瘤率最高。

实施例4、豆芋叶多糖对小鼠血清细胞因子分泌情况的影响；

将实施例1中灌胃30天后的小鼠禁食12h，眼眶取血后将小鼠颈椎脱臼处死，血液样品1500转离心15min，取血清保存并采用elisa试剂盒(武汉基因美生物科技有限公司)根据说明书对血清中细胞因子ifn-γ、il-2、il-6和tnf-α的分泌情况进行测定，结果分别如图5-8所示。结果表明，同对照组相比不同浓度豆芋叶多糖干预组均能提高血清中il-2和il-6的分泌。但只有中剂量组和高剂量组能够显著提高血清中ifn-γ和tnf-α分泌情况。

综上本发明提出一种豆芋叶多糖的抗肿瘤用途，为医学、食品科学等领域开发天然抗肿瘤产品提供新资源。以上列举的仅为本发明的实施的若干实例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。