本发明属于肿瘤靶向与控释给药技术领域,涉及一种基于温度和氧化双响应的聚合物制成的纳米递药系统,具体涉及一种能在近红外光照射下能实现光热化疗联合疗法的载药胶束及其制备方法。
背景技术:
肿瘤己经成为威胁人类健康的最严重疾病之一。临床上常用的癌症治疗手段有化学治疗、放射治疗和手术治疗等,其中,化学治疗是最常用和重要的治疗途径。但临床上所用的抗肿瘤药物在应用中有诸多的缺陷,如:水溶性剂稳定性差、药物毒副作用大,在治疗疾病的同时也杀死了人体的正常细胞。而药物传递系统和控制释放恰恰能够解决这些问题。药物控制释放是指将药物和适当载体按照一定的比例和形式制成制剂,在进入人体后控制药物在人体内部的作用部位、作用时间以及吸收和代谢的过程。和传统的直接用药方式相比较,药物控制释放的优点有:(1)可实现药物的主动或被动靶向传递,将药物直接作用与病变部位,降低了药物对正常人体细胞和组织的毒副作用;(2)可以对药物在人体内作用时间加以调节,适当延长药物作用的时间,尤其对需要长期用药的病人,可以减少频繁用药的痛苦;(3)由于药物载体的靶向作用,提高了药物的利用率,尤其对于比较昂贵的药物如抗肿瘤药物,具有很重要的意义。
常用的药物载体有无机材料纳米粒子、聚合物胶束、树枝状聚合物、脂质体以及聚合物纳米水凝胶等,其中,能对肿瘤组织微环境做出响应的环境敏感型的聚合物胶束具有良好的应用前景。环境敏感型聚合物胶束能够有效的将药物带到病灶部位,在肿瘤组织特殊环境的剌激下,迅速的释放药物,以减少药物对正常组织的毒副作用,更好地发挥药效。
吲哚菁绿(icg)是唯一被美国食品药品监督管理局(fda)批准,可用于临床使用的近红外荧光造影剂[1]。在临床上,icg被广泛应用于对肝功能、心输出量、视网膜的脉管系统的辅助诊断[2]。它还能作为荧光探针发射波长为820nm的近红外荧光,同时能作为感光剂,吸收光能并将其转化成热能或产生单线态氧,进而杀伤肿瘤细胞[3-4]。然而,icg在水溶液中很不稳定、在血液循环中容易被快速清除,分子间容易形成二聚体导致荧光淬灭[5]。这些不足严重限制了icg在肿瘤诊断及治疗方面的应用。研究人员近年来尝试利用各类纳米载体搭载icg,以期提高其稳定性、延长其血液循环时间并赋予其肿瘤靶向性[6]。
为了更好的控制药物释放和提高抗癌活性,本专利将阿霉素和吲哚菁绿包裹在双重响应的聚合物胶束中,制备成双重环境响应型聚合物载药胶束用于抗肿瘤药物递送。值得注意的是,在近红外光照射下,载药胶束的抗肿瘤活性好。
参考文献
1.frangionijv.invivonear-infraredfluorescenceimaging[j].curropinchembiol,2003,7(5):626-634.
2.rowelllb,blackmonjr,brucera.indocyaninegreenclearanceandestimatedhepaticbloodflowduringmildtomaximalexerciseinuprightman.journalofclinicalinvestigation[j],1964,43(8):1677.
3.o’nealdp,hirschlr,halasnj,etal.photo-thermaltumorablationinmiceusingnearinfrared-absorbingnanoparticles[j].cancerlett,2004,209(2):171-176.
4.chenwr,adamsrl,higginsak,etal.photothermaleffectsonmurinemammarytumorsusingindocyaninegreenandan808-nmdiodelaser:aninvivoefficacystudy[j].cancerlett,1996,98(2):169-173.
5.saxenavsadoqim,shaoj.polymericnanoparticulatedeliverysystemforindocyaninegreen:biodistributioninhealthymice[j].intjpharm,2006,308(1):200-204.
6.chenq,keh,daiz,.nanoscaletheranosticsforphysicalstimulus-responsivecancertherapies[j].biomaterials,2015,73:214-230.
技术实现要素:
有鉴于此,本发明提供了一种用于光热化疗联合疗法的纳米递药系统的制备方法。该载药胶束是由式(1)所示的聚硫化丙烯-b-聚(n-异丙基丙烯酰胺-co-n,n-二甲基丙烯酰胺)自聚集,并将阿霉素(dox)和吲哚菁绿(icg)包裹在胶束中制得而成。在808nm的近红外光的照射下,由于吲哚菁绿的光热效应,温度升高,胶束表面的亲水层变成疏水层,肿瘤细胞对载药胶束的摄取增加,同时,吲哚菁绿在光照的时候产生的单线态氧会氧化载药胶束,促进药物的释放。该纳米递药系统具有双重响应性,在近红外光照下能主动靶向病灶部位,具有抗肿瘤活性强的特点。
1.本发明提供了一种温度和氧化双响应的共聚物,具有式(1)所示的结构:
其中,所述-r1-r2,-r3优选自如下结构:
j,m,n为聚合度:m+n>20,5<j<60
其中,优选地,所述式(1)中的结构中:70>m+n>50,10<j<20
2.结构式(1)的聚合物,其单体包括硫化丙烯,n-异丙基丙烯酰胺,n,n-二甲基丙烯酰胺。
3.一种温度和氧化双响应的共聚物的制备方法,包括:
a.通过阴离子开环聚合反应,以硫化丙烯为单体制备得到聚硫化丙烯大分子引发剂;
b.以聚硫化丙烯为引发剂,n-异丙基丙烯酰胺,n,n-二甲基丙烯酰胺按一定比例加入,通过原子转移自由基聚合反应得到所述的共聚物。
4.载药胶束通过以下步骤制备:
a.将阿霉素,吲哚菁绿和两亲性聚合物溶一定比例溶于有机溶剂中;
b.将溶液缓慢匀速的滴入水中;
c.搅拌过夜然后透析除去有机溶剂。
5.本发明制备载药胶束,有机溶剂选自二甲基亚砜(dmso),n,n-二甲基甲酰胺(dmf),二氯甲烷(dcm),丙酮(at),本发明中优选为n,n-二甲基甲酰胺(dmf)。
6.本发明在制备载药胶束时,其特征在于阿霉素,吲哚菁绿与聚合物的质量比为1:1:2。
7.本发明制备的载药胶束,阿霉素的载药量为13%,吲哚菁绿的载药量为17%。
8.本发明制备的胶束,其特征在于在近红外光光照的条件下,载药胶束溶液的温度可以上升到最低临界溶解温度(lcst)以上,范围为37℃~55℃。
本发明的有益效果在于:
本发明原料来源广泛,所用的硫化丙烯、2-溴-2-甲基丙酰溴、甲醇钠甲醇溶液、n-异丙基丙烯酰胺、n,n-二甲基丙烯酰胺、阿霉素,吲哚菁绿,溶剂、催化剂、配位剂、引发剂、溴化剂、均可工业化生产,合成方法简单易行。合成的双响应性共聚物具有lcst的温度响应性、氧化响应性、共聚物在水中可以很容易地组装为稳定纳米胶束。所得到的纳米载药胶束在近红外光照射下实现了光热治疗与化学治疗的联合治疗,具有很强的抗肿瘤活性,在药物控制释放领域具有广泛的应用。
实施例一:
共聚合物的制备
材料与方法:
硫化丙烯,购自tci公司,2-溴-2-甲基丙酰溴,甲醇钠甲醇溶液购自百灵威公司,n-异丙基丙烯酰胺,n,n-二甲基丙烯酰胺购自adamas公司,阿霉素购自安耐吉公司,吲哚菁绿购自麦克林公司,反应中所用溶剂均重蒸除水干燥。
1.聚硫化丙烯大分子引发剂的合成,其步骤为:
采用阴离子开环聚合的方法合成,制备聚硫化丙烯。将20ml干燥四氢呋喃导氮气1h,然后加入tbp2ml,2-羟基乙酰硫酯162mg,甲醇钠甲醇溶液2.8ml反应几分钟,加入环硫丙烯1g,再反应一段时间,加入溴乙酰胺0.6ml,常温下反应2h,旋干溶剂,用甲醇沉淀,离心去掉上清液,反复用甲醇沉淀3次,得到无色油状物,将产物溶于20ml无水的二氯甲烷中,加入三个当量的三乙胺,再在冰浴条件下加入过量的2-溴-2-甲基丙酰溴,在冰浴下反应1h移到常温下反应24h,旋干溶剂,用甲醇反复沉淀,离心取下层油状物,得到大分子引发剂。
2.共聚合物的制备,其步骤为:
将大分子引发剂50mg,约300mgnipaam,dmmam0.05ml溶于1.5mldmf/h2o混合溶液中,导氮气除掉反应溶剂中的氧,将现制备好的0.2ml左右cucl/me6tren水溶液在氮气的保护下注入反应液中,在常温下反应过夜,反应结束后,反应液用碱性氧化铝柱过滤,旋干后用冰浴的乙醚沉淀。得到白色的固体粉末。通过核磁和ftir鉴定结构,如图1和图2所示。
实施例二:
载药胶束的制备
分别称取5mgdox,5mgicg,10mg共聚物,加入适量dmf溶解。在不断搅拌下,缓慢加入到10ml水中,继续搅拌8h,然后透析,除去dmf溶剂,透析结束后产品以0.22μm微孔滤膜滤过除菌。制备的好的胶束命名为dims。此外按照同种方法制备只载dox和只载icg的胶束,并分别命名为dms和ims。
实施例三:
载药胶束的光热实验测定
分别取0.5ml的h2o,5和20μg/mlicg溶液,5和20μg/ml载药胶束溶液,在808nm的近红外光下照射15min,用温度记录仪记录温度的变化情况,如图3所示,
可以看出载药胶束的最高温度是高于lcst的,能够引起胶束的相变。
实施例四:
载药胶束的药物累积释放量的测定
取2ml胶束溶液装入透析袋中,置于18mlpbs溶液中,在0h,4h,8h时,一组用近红外光照射20min,一组不照射,每隔2h取2mlpbs溶液,再加2ml新的pbs溶液,一直到12h,冻干后再用水溶解用紫外分光光度计测定药物的浓度,如图4所示(箭头代表照射时间)。
可以看出,在光照的条件下,药物释放的量明显增加。
在将透析袋中的胶束溶液冻干,用cdcl3溶解样品得到氢谱,得到图5结果,可以发现聚合物有被氧化。
实施例五:
载药胶束的体外药效实验
载药胶束的药效试验采用肺癌细胞(a549)作为实验对象,总共七个实验组,dox,icg(+),ims(+),dms,dims(+)和dims(-)(“+”,“-”代表光照和不光照)。每组设置5个浓度,对应的dox和icg浓度分别是:0.5μg/ml和0.7μg/ml,1μg/ml和1.4μg/ml,2μg/ml和2.8μg/ml,5μg/ml和7μg/ml,10μg/ml和14μg/ml。光照5min后,在培养箱孵育24h,加入mtt灭活,测定细胞存活率。重复测定三次计算平均值,结果如图6所示,可以看出dims在光照条件下抗癌活性极强。
在此说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述,但本领域的普通技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其做出各种各样的改变,而不偏离本发明的精神和范围。
附图说明:
图1共聚物1hnmr图
图2共聚物ft-ir图
图3载药胶束光热效应图
图4载药胶束药物累积释放图
图5光照后的1hnmr图
图6载药胶束体外药效图。