本发明涉及药物载体的研究与制备领域，具体涉及一种制备原料为较高分子量的丝胶蛋白与γ-聚谷氨酸的一种丝胶蛋白和γ-聚谷氨酸自组装体纳米药物缓释胶束的制备方法及用途。
背景技术：
丝胶蛋白是包裹在丝素纤维表层的一种天然大分子蛋白，是构成蚕丝的主要蛋白，在纺织业丝胶蛋白被当作一种副产品而被丢弃，每年约有50000吨的丝胶蛋白被当作废弃物处理，浪费了大量的天然蛋白资源。丝胶蛋白具有良好的生物活性，抗肿瘤活性及细胞粘附性，为其在生物医药及保健品领域的应用奠定了基础，已经有人将丝胶蛋白与丙烯酸(aa)通过聚合反应制备出一种新颖的粘膜粘附性高聚物，但是这种聚合方法是有毒的操作过程。目前只有有关丝胶蛋白自身在溶液中组装研究的报导，还没有任何丝胶蛋白与其他蛋白或者聚合物之间进行自组装的研究报导。
聚谷氨酸（γ-pga）是一种非常理想的药物载体，具有优良的生物相容性、可降解性、成纤维性及成膜性，也是一种非常优良的靶向药物载体。是一种对人体和环境无害的天然高分子材料。目前已经有研究将γ-聚谷氨酸与乙二醇、n-三甲基壳聚糖及胆甾醇等高分子物质通过组装制备药物载体的报导，但还没有将其与蛋白质进行组装制备可控纳米胶束的报导。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是丝胶蛋白与丙烯酸(aa)的聚合反应有毒的操作过程，目前还没有任何丝胶蛋白与其他蛋白或者聚合物之间进行自组装的研究，提供一种无毒无污染的丝胶蛋白和γ-聚谷氨酸自组装体纳米胶束的制备方法及用途。
为解决上述技术问题，本发明采用下述技术方案：一种丝胶蛋白和γ-聚谷氨酸自组装体纳米胶束的制备方法，包括以下步骤：1）：选择分子量在12000-24000da的丝胶蛋白和分子量为10-120ku的γ-聚谷氨酸；2）制备相同质量浓度的丝胶蛋白溶液与γ-聚谷氨酸溶液：分别将分子量在12000-24000da的丝胶蛋白和分子量为10-120ku的γ-聚谷氨酸溶解在去离子水中，配制成质量浓度相同且范围为0.3-2%的溶液；3）制备丝胶蛋白和γ-聚谷氨酸自组装体。
1）丝胶蛋白与γ-聚谷氨酸的选择和准备
要想通过自组装制备纳米胶束，在丝胶蛋白的选择上就要既保证蛋白分子有足够的生物活性，又要保证其具有相对的水溶性，否则无法制备水溶性的纳米自组装体，从而会导致其应用受到限制。丝胶蛋白因为其提取方法的不同而导致了其分子量从几万到30多万不等，易溶性丝胶蛋白的分子量12000-24000da之间，而普通丝胶蛋白分子量在50000-98000da之间，易溶性丝胶蛋白粉在低温及高温的溶解度比普通丝胶蛋白分子量高的多，这样就为其利用创造了非常有利的条件，可用于制备各种类型的医用生物材料。本发明所制备及使用的纳米胶束是在液体环境中使用的，因此本发明选择分子量在12000-24000da的丝胶蛋白作为制备自组装纳米胶束的原料之一，本发明分子量范围的丝胶蛋白和γ-聚谷氨酸可以直接购买。
γ-聚谷氨酸的分子量一般在10-2000ku之间，为了组装制备纳米胶束得到热动力稳定的自组装体系，本发明使用分子量较小的γ-聚谷氨酸，其分子量选择为10-120ku的γ-聚谷氨酸。
2）制备相同质量浓度的丝胶蛋白溶液与γ-聚谷氨酸溶液
制备相同质量浓度的丝胶蛋白溶液与γ-聚谷氨酸溶液：分别将分子量在12000-24000da的丝胶蛋白和分子量为10-120ku的γ-聚谷氨酸溶解在去离子水中，配制成质量浓度相同且范围为0.3-2%的溶液；自组装胶束的制备及应用环境应在酸性环境下进行（ph≤7）。
3）制备丝胶蛋白和γ-聚谷氨酸自组装体
制备原理：γ-聚谷氨酸的等电点为2.2，而丝胶蛋白的等电点为3.7，当将两种蛋白质溶液混合时，如果将体系的ph值调节至两种蛋白的等电点之间时（ph2.3-3.6），此时γ-聚谷氨酸会带负电荷而丝胶蛋白会带正电荷，而经过试验，这两种物质之间因为复杂的相互作用及蛋白质构象改变的原因不会产生沉淀，而通过正负电荷的相互吸引作用发生了组装和结合，形成了新的自组装纳米胶束。此时形成的纳米胶束比较稳定，但其相互之间只是以静电作用相互结合，要想其在各种使用环境中处于比较稳定的状态，就必须对其结构进行固定，因为γ-聚谷氨酸连接有-cooh、-nh2和-co官能团，而丝素蛋白则含有-cooh、-nh2、-oh，-hs等活性官能团，因此可以利用这些活性化学基团，使用交联剂，通过分子链内及分子链间的交联形成共价网络结构，使其组装体结构得到稳固。
制备过程：步骤3）所述的丝胶蛋白和γ-聚谷氨酸自组装体的制备步骤为：a、将步骤2）制备的相同质量浓度的丝胶蛋白溶液与γ-聚谷氨酸溶液按照质量比（4:1、2:1、1:1、1:2、1:4）的比例混合制得混合溶液；b、加入混合溶液1至3倍体积的邻苯二甲酸-盐酸缓冲液（ph2.2-3.8），浓度为0.05mol/l，使用0.01mol/l的盐酸在在此范围内微调ph值至ph2.2-3.7，放入超声装置中超声1-3小时，超声功率300w，频率40khz；c、将步骤b制得的混合溶液装入反应器中，分别在（20-50℃）的温度范围内进行恒温组装4-12小时，随后加入0.005-0.1%的交联剂乙烯砜，交联1-3小时进行胶束的结构固定，制备好丝胶蛋白和γ-聚谷氨酸自组装纳米胶束。
4）丝胶蛋白和γ-聚谷氨酸自组装体纳米胶束的用途：将制备的丝胶蛋白和γ-聚谷氨酸自组装纳米胶束用于疏水性药物的包埋，选用姜黄素及β-胡萝卜素作为包埋药物对其包埋及缓释性能进行检测。自组装体形貌及药物包埋数据见图1-图3及表1。
本发明利用γ-聚谷氨酸与丝胶蛋白，首次通过静电组装的方法制备出γ-聚谷氨酸和丝胶蛋白纳米自组装体，可以应用抗癌药物及疏水性药物的包埋，具有较为广阔的应用前景。
附图说明
图1是实施例1的自组装体形貌；
图2是实施例2的自组装体形貌；
图3是实施例2的自组装体形貌。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种丝胶蛋白和γ-聚谷氨酸自组装体纳米胶束的制备方法，包括以下步骤：
1）丝胶蛋白与γ-聚谷氨酸的选择
丝素蛋白分子量选择为12000-24000da，γ-聚谷氨酸的分子量选择为10ku。
2）丝胶蛋白与γ-聚谷氨酸溶液的制备
将一定质量的丝胶蛋白与γ-聚谷氨酸分别溶解在去离子水中配制成质量浓度均为0.3%的水溶液备用。
3）制备丝胶蛋白和γ-聚谷氨酸自组装体
将质量浓度都为0.3%的丝胶蛋白及γ-聚谷氨酸溶液，按照质量比例4:1混合，加入2倍体积的邻苯二甲酸-盐酸缓冲液（ph2.2-3.8）（0.05mol/l），使用0.01mol/l的盐酸在此范围内微调ph值至3.5，放入超声装置中超声1小时，功率300w，频率40khz。将混合溶液装入反应器中，在20℃的温度范围内进行恒温组装4小时，随后加入0.005%的交联剂乙烯砜，交联1小时进行胶束结构固定，制备好丝胶蛋白和γ-聚谷氨酸自组装纳米胶束。
4）将制备的丝胶蛋白和γ-聚谷氨酸自组装纳米胶束用于姜黄素疏水性药物的包埋并进行检测。自组装体形貌及药物包埋数据见图1及表1。
实施例2
一种丝胶蛋白和γ-聚谷氨酸自组装体纳米胶束的制备方法，包括以下步骤：
1）丝胶蛋白与γ-聚谷氨酸的选择
丝胶蛋白分子量在12000-24000da，γ-聚谷氨酸的分子量选择为70ku。
2）丝胶蛋白与γ-聚谷氨酸溶液的制备
将一定质量的丝胶蛋白与γ-聚谷氨酸溶解在去离子水中配制成质量浓度为0.9%的溶液备用。
3）制备丝胶蛋白和γ-聚谷氨酸自组装体
制备过程：将相同质量浓度为0.9%，质量比例为2:1的丝胶蛋白和γ-聚谷氨酸溶液混合，加入3倍体积的邻苯二甲酸-盐酸缓冲液（ph2.2-3.8）（0.05mol/l），使用0.01mol/l微调ph值至3.0，放入超声装置中超声2小时，功率300w，频率40khz。将混合溶液装入反应器中，在30℃的温度范围内进行恒温组装6小时，随后加入0.01%的交联剂乙烯砜，交联2小时进行胶束的结构固定，制备好丝胶蛋白和γ-聚谷氨酸自组装纳米胶束。
4）将制备的丝胶蛋白和γ-聚谷氨酸自组装纳米胶束用于疏水性药物β-胡萝卜素的包埋，自组装体形貌及药物包埋数据见图2及表1。
实施例3
一种丝胶蛋白和γ-聚谷氨酸自组装体纳米胶束的制备方法，包括以下步骤：
1）丝胶蛋白与γ-聚谷氨酸的选择
丝胶蛋白的分子量选择在12000-24000da，γ-聚谷氨酸的分子量选择为120ku。
2）丝胶蛋白与γ-聚谷氨酸溶液的制备
自组装胶束的制备及应用环境应在酸性环境下进行（ph≤7）,将一定质量的丝胶蛋白与γ-聚谷氨酸溶解在去离子水中配制成质量浓度为1.2%的溶液备用。
3）制备丝胶蛋白和γ-聚谷氨酸自组装体
将质量浓度为1.2%，质量比例为1:1的丝胶蛋白和γ-聚谷氨酸溶液混合，加入3倍体积的邻苯二甲酸-盐酸缓冲液（ph2.2-3.8）（0.05mol/l），使用0.01mol/l的盐酸微调ph值至3.3，放入超声装置中超声2小时，功率300w，频率40khz。将混合溶液装入反应器中，在50℃的温度范围内进行恒温组装10小时，随后加入0.03%的交联剂乙烯砜，交联3小时进行胶束的结构固定，制备好丝胶蛋白和γ-聚谷氨酸自组装纳米胶束。
4）将制备的丝胶蛋白和γ-聚谷氨酸自组装纳米胶束用于疏水性药物姜黄素的包埋，对其包埋及缓释性能进行检测。自组装体形貌及药物包埋数据见图3及表1。
实施例4
一种丝胶蛋白和γ-聚谷氨酸自组装体纳米胶束的制备方法，包括以下步骤：1）：选择分子量为15000-20000da的丝胶蛋白和分子量为100ku的γ-聚谷氨酸；2）制备相同质量浓度的丝胶蛋白溶液与γ-聚谷氨酸溶液：分别将分子量在15000-20000da的丝胶蛋白和分子量为100ku的γ-聚谷氨酸溶解在去离子水中，配制成质量浓度相同且范围为2%的溶液；
3）制备丝胶蛋白和γ-聚谷氨酸自组装体：a、将步骤2）制备的相同质量浓度的丝胶蛋白溶液与γ-聚谷氨酸溶液按照质量比1:2的比例混合制得混合溶液；b、加入混合溶液2倍体积的邻苯二甲酸-盐酸缓冲液（ph2.2-3.8），浓度为0.05mol/l，使用0.01mol/l的盐酸在此范围内微调ph值至（ph2.2-3.8），放入超声装置中超声2小时，超声功率300w，频率40khz；c、将步骤b制得的混合溶液装入反应器中，分别在（20-50℃）的温度范围内进行恒温组装8小时，随后加入0.1%的交联剂乙烯砜，交联2小时进行胶束的结构固定，制备好丝胶蛋白和γ-聚谷氨酸自组装纳米胶束。
4）将制备的丝胶蛋白和γ-聚谷氨酸自组装纳米胶束用于疏水性药物姜黄素的包埋。
实施例5
一种丝胶蛋白和γ-聚谷氨酸自组装体纳米胶束的制备方法，包括以下步骤：1）：选择分子量为16000-18000da的丝胶蛋白和分子量为80ku的γ-聚谷氨酸；2）制备相同质量浓度的丝胶蛋白溶液与γ-聚谷氨酸溶液：分别将分子量在16000-18000da的丝胶蛋白和分子量为80ku的γ-聚谷氨酸溶解在去离子水中，配制成质量浓度相同且范围为2%的溶液；
3）制备丝胶蛋白和γ-聚谷氨酸自组装体：a、将步骤2）制备的相同质量浓度的丝胶蛋白溶液与γ-聚谷氨酸溶液按照质量比1:4的比例混合制得混合溶液；b、加入混合溶液2倍体积的邻苯二甲酸-盐酸缓冲液（ph2.2-3.8），浓度为0.05mol/l，使用0.01mol/l的盐酸在在此范围内微调ph值至（ph2.2-3.8），放入超声装置中超声2小时，超声功率300w，频率40khz；c、将步骤b制得的混合溶液装入反应器中，分别在（20-50℃）的温度范围内进行恒温组装8小时，随后加入0.3%的交联剂乙烯砜，交联1小时进行胶束的结构固定，制备好丝胶蛋白和γ-聚谷氨酸自组装纳米胶束。
4）将制备的丝胶蛋白和γ-聚谷氨酸自组装纳米胶束用于疏水性药物姜黄素的包埋。
表1.丝胶蛋白和γ-聚谷氨酸自组装纳米胶束的包埋及缓释性能
由图1-图3可以看出，不同条件下所组装制备的丝胶蛋白和γ-聚谷氨酸自组装纳米胶束的形貌及粒径是不同的，但其都在30-95nm之间，是一种纳米胶束，实施例1和实施例2形貌为立方体形，实施例3为近似球形。并且经过实验检测，从表1可以看出其对疏水性药物姜黄素或β-胡萝卜素具有较高的包封率和载药量。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
1.本发明利用较高分子量的可溶性丝胶蛋白与不同分子量的γ-聚谷氨酸为
原料，首次把γ-聚谷氨酸与天然蛋白质类物质利用自组装技术制备出自组装纳米胶束。
2.所利用的原料丝胶蛋白是一种纺织业的副产品，价格低廉，与γ-聚谷氨酸合用可以大大降低药物载体的制备成本。
3.制备原料属于天然高分子物质，制备过程属于绿色环保的制备过程，没有有害物质的添加及引入，因此是一种绿色制备复合胶束的制备方法。
4.实验证明，此法制备的纳米复合胶束具有较高的包封率和载药量，具有良好的缓释性能，具有良好的应用前景。