化合物在制备治疗转移性癌症的药物中的应用的制作方法

本申请涉及一种治疗受试者中的转移性癌症的方法，具体但不唯一地包括向受试者特别是哺乳动物施用小化合物。本申请还涉及一种抑制癌细胞转移的方法。

背景技术

癌症转移是指癌细胞从身体的一部分扩散到癌细胞附近的组织、器官或甚至身体的远端部位。一些癌细胞可以具有穿透血管和淋巴管的能力，且因此通过血液循环和淋巴系统围绕身体行进。一旦癌细胞转移，则通常在身体的第二部位发现新的肿瘤，且这就是所谓的转移性癌症。癌症传播的常见部位包括(但不局限于)骨、肝和肺。

一旦癌细胞发生转移，可能难以控制。转移作为死亡主因的比例约占癌症死亡总数的90％。虽然目前存在治疗某些类型的转移性癌症的方法，但是发现大多数目前可用的方法不如预期的那样有效。尤其是目前市场上没有能够有效治疗或抑制癌症转移的药物。

由于转移性癌症的治疗选择有限，所以仍然对有效抵抗癌症转移且治疗转移性癌症的新的化合物存在强烈的需求。

发明概述

发明人发现，一种小化合物化合物1(vacuolin-1)具有针对癌细胞的抗转移作用，具体地是可以损害黏着斑(focaladhesion)的分解动力(disassemblydynamic)以在体外抑制各种肿瘤细胞的侵袭。实验结果也证明，使用化合物1预处理癌细胞可以显著抑制异种移植小鼠中的肿瘤细胞的肿瘤接种能力。此外，发现化合物1有效地抑制人肺癌细胞和人乳腺癌细胞在异种移植小鼠模型中的转移。此外，还发现化合物1在小鼠中不具有明显的急性、亚急性和亚慢性毒性。因此，认为本发明的化合物对抗癌症的转移是有效的，且用于治疗转移性癌症。

在第一方面，本发明提供了一种化合物在制备治疗转移性癌症的药物中的应用，其中所述化合物具有式i的结构：

其中x是氢、羟基或卤素。

在实施方式中，化合物具有式i的结构且x是卤素。具体地，化合物具有式ii的结构，

在实施方式中，癌症选自由膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肺癌、卵巢癌、皮肤癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌和骨癌组成的组。优选地，转移性癌是乳腺癌、肝癌或肺癌。

在实施方式中，化合物被制备成通过选自口服递送、静脉内递送、皮内递送、腹腔递送和肌肉递送的途径施用的药物。

在进一步的实施方式中，化合物连同一种或多种化疗药物或免疫治疗药物被施用至受试者。优选地，化疗药物选自由紫杉酚、5-氟尿嘧啶(5-fu)和坦罗莫司组成的组，且免疫治疗药物是程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)或程序性死亡配体1(pd-l1)抑制剂。

在第二方面，本发明还涉及一种化合物在制备抑制癌细胞转移的药物中的应用，该药物与所述癌细胞接触，其中所述化合物具有式i的结构：

其中x是氢、羟基或卤素。

优选地，化合物具有如上所述的式ii的结构，

具体地，化合物以约为2μm或更高的浓度与癌细胞接触。

本领域技术人员将会理解，本文描述的发明可进行本文具体描述以外的变化和修改。本发明包括所有这些变化和修改。本发明也包括说明书中提及或指出的所有步骤和特征，单独地或共同地，以及这些步骤或特征的任何和所有组合。

本发明的其他特征和方面将通过考虑以下详细描述和附图变得明显。

附图简述

图1a显示了化合物1对癌细胞即hela细胞、a549细胞、cne-1细胞和用不同浓度(2μm、5μm和10μm)的化合物1处理的人肺癌干细胞(hlcsc)的迁移的影响。图1b显示了从化合物1对hlcsc的基质胶侵袭测定获得的结果。图1c显示了化合物1对hlcsc的肿瘤球形成的影响。图1d是从荧光体-y397fak免疫印迹分析获得的图且显示了用化合物1处理的细胞中pfak(y397)和fak的相对量。图1e显示了受到诺考达唑(nocodazole)处理的细胞在不同时间段的粘着斑蛋白显微荧光图像。图1f显示了比较化合物1处理的细胞中的与对照组的诺考达唑的释放后粘着斑的拆卸。

图2a是显示用于测试化合物1预处理对裸小鼠中的癌细胞(即hlcsc)的体内作用的方法的示意图，以便确定化合物1是否对癌细胞侵袭具有抑制活性。图2b是针对具有用二甲基亚砜(dmso)预处理的lcsc的对照组和用化合物1预处理的lcsc的处理组测量的肿瘤体积的图，其中治疗组显示肿瘤体积显著减小。

图3a是显示用于测试化合物1对裸小鼠中的hlcsc转移的体内作用的方法的示意图，以确定化合物1是否具有抗转移活性。图3b显示了用化合物1处理后的切除的肺的照片和显微图像并与对照组比较。图3c是显示对照组和治疗组的切除的肺中存在的转移性结节的数量的图。

图4a是显示用于测试化合物1对裸小鼠中的人乳腺癌细胞转移的体内作用的方法的示意图以便确定化合物1是否具有抗转移活性。图4b显示了化合物1处理后通过crimaestro2获得的小鼠的图像且与对照组相比。

图5a是显示用于测定在用小鼠乳腺癌4to7细胞注射的正常balb小鼠中的化合物1的抗转移活性的方法的示意图。图5b显示了切除的肺和对照组和用2.5mg/kg的化合物1处理的治疗组中的小鼠肺的显微镜图像。图5c显示治疗组和对照组中的小鼠中计数的转移性结节数量的图。

图6a是显示用于测定用fluc-mcherry表达的4to7细胞注射的正常小鼠中的化合物1的抗转移性的方法的示意图。图6b显示了对照组和用2.5mg/kg化合物1处理的治疗组中的小鼠的图像。

图7a是显示用于测定用fluc-mcherry表达的4t1细胞注射到脂肪垫中的正常雌性小鼠中的化合物1的抗转移性的方法的示意图。图7b显示了对照组和用2.5mg/kg化合物1处理的治疗组中的小鼠的图像。

图8a是显示了对照组和用250mg/kg化合物1处理的治疗组中的小鼠在2周的化合物1急性毒性评估中的体重的图。图8b显示了治疗后的小鼠的不同器官的显微组织学图像。

图9a是显示了对照组和用10mg/kg化合物1处理的治疗组中的小鼠在2周的化合物1亚急性毒性评估中的体重的图。图9b显示了治疗后的小鼠的不同器官的显微组织学图像。

图10a是显示了对照组和用5mg/kg化合物1处理的治疗组中的小鼠在3个月的化合物1亚慢性毒性评估中的体重的图。图10b显示了治疗后的小鼠的不同器官的显微组织学图像。

具体实施方式

除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。

正如本文中使用的，“包含”意指包括以下要素但不排除其他要素。“基本上由......组成”意指材料由各要素以及通常的且不可避免的杂质如副产物和通常源自用于获得该材料的各制备或方法的组分诸如痕量的其他组分或溶剂组成。“由...组成”意指材料仅由相应的要素组成，即形成。正如本文中使用的，形式“一个(a)”，“一个(an)”和“所述(the)”旨在包括单数和复数形式，除非上下文另有明确说明。

本发明的第一方面提供了一种治疗罹患转移性癌症的受试者中的转移性癌症的方法，包括以下步骤：将有效量的具有式i结构的化合物施用至受试者，

其中x是氢、羟基或卤素。

正如本文中使用的，转移性癌症是指具有从受试者体内的一个部位扩散到受试者体内的第二部位的能力的癌细胞，尤其是扩散到不相邻的身体部位的能力的癌细胞。癌症可以选自由膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肺癌、卵巢癌、皮肤癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌和骨癌组成的组。

在优选的实施方式中，癌症是乳腺癌、肝癌或肺癌。

“治疗”转移性癌症尤其包括抑制癌细胞的迁移、抑制癌细胞侵袭其他组织、抑制在第二部位形成转移性癌细胞、抑制癌细胞中的黏着斑的分解动力，和/或减轻转移性癌症的一种或多种症状。具体而言，术语治疗包括抑制癌细胞的迁移、抑制癌细胞侵袭其他组织或抑制转移性癌细胞形成在第二部位。

表述“有效量”通常表示足以产生治疗上期望的结果的量，其中结果的确切性质根据治疗的具体情况发生变化。本发明的化合物可以以有效量，即适于治疗或预防受试者(尤其是哺乳动物)中的转移性癌症或抑制癌细胞转移的量，被包含在组合物中，具体地是药物组合物中，这也取决于施用组合物的频率和次数。在一个实施方式中，本发明的化合物可以以约2μm或2.5mg/kg或更高的浓度施用于受试者。在其他实施方式中，化合物可以以约2.5mg/kg、5mg/kg、8mg/kg或10mg/kg的浓度被施用。

术语“受试者”具体地是指动物或人，具体地是哺乳动物且最优选人。即在最优选的实施方式中，受试者是罹患癌症或转移性癌症的人。受试者也可以是处于转移风险的癌症患者。

当将化合物以药物或药物组合物的形式提供给受试者时，技术人员能够根据药物组合物的形式选择合适的药学上可耐受的赋形剂，并且知道用于制备药物组合物的方法以及能够根据药学上可耐受的赋形剂的种类和药物组合物的形式选择合适的制备药物组合物的方法。

在实施方式中，本发明的化合物具体地用于与一种或多种化疗或免疫治疗药物组合。优选地，化疗药物可以选自由紫杉酚、5-氟尿嘧啶和坦罗莫司组成的组，且免疫治疗药物可以是程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)或程序性死亡配体1(pd-l1)抑制剂。本领域技术人员能够加入用于缓解受试者的症状的其他治疗化合物。

对于本发明的化合物，式i化合物是具有抗癌细胞转移作用的小化合物。认为本文公开的化合物能够抑制癌细胞的迁移和/或侵袭，且因而预防或抑制癌细胞的转移。

该化合物具有式i的结构

其中x是氢、羟基或卤素。优选地，卤素可以选自碘、溴、氯或氟，尤其是碘。

在一个实施方式中，该化合物具有式ii的结构，也称为vacuolin-1，在本文可代指为化合物1：

在本发明的实施方式中，本文公开的化合物通过选自口服递送、静脉内递送、皮内递送、腹腔递送和肌肉递送的途径施用至受试者。具体地，该化合物通过腹腔递送施用至受试者。本领域技术人员能够根据受试者身体内的靶向位点配制药物组合物中的化合物。

由以上可理解到，本发明也涉及一种化合物在制备治疗转移性癌症的药物中的应用，其中所述化合物和转移性癌症如上所定义。具体地，所述化合物具有式i的结构：

其中x是氢、羟基或卤素。

优选地，所述化合物具有式ii的结构，

本发明进一步提供了一种抑制癌细胞的转移的方法，包括使癌细胞与有效量的具有式i结构的化合物接触的步骤，

其中x是氢，羟基或卤素。

具体地，该化合物可以具有式i的结构且x是卤素。

优选地，该化合物具有式ii的结构，

该化合物可以联合一种或多种化疗或免疫治疗药物与癌细胞接触。化疗药物可以选自紫杉酚、5-氟尿嘧啶和坦罗莫司。免疫治疗药物可以是pd-1或pd-l1抑制剂。如上所述，本领域技术人员能够根据癌细胞的类型选择合适的化疗或免疫疗法药物。

癌细胞可以是膀胱癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞、肾癌细胞、肺癌细胞、卵巢癌细胞、皮肤癌细胞、胰腺癌细胞、前列腺癌细胞、肝癌细胞和骨癌细胞。在具体的实施方式中，癌细胞是乳腺癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞或其组合。

在实施方式中，化合物以约2μm或更高的浓度，具体地是约2μm、约5μm、约8μm或约10μm的浓度与癌细胞接触。在一个具体的实施方式中，该化合物以2μm的浓度接触癌细胞。

认为本发明公开的化合物能够治疗转移性癌症和/或抑制癌细胞的迁移和侵袭。因此，本发明还涉及一种预防处于转移风险的癌症患者中的转移的方法。具体地，该方法包括以下步骤：将有效量的具有式i结构的化合物施用至患者，此步骤如上所述。

可理解地，本发明也涉及一种种化合物在制备抑制癌细胞转移的药物中的应用，该药物与所述癌细胞接触，其中所述化合物和癌细胞如上所定义。

下面描述了进一步证明化合物1的抗转移作用的实验

实施例

实施例1

化合物1对癌细胞的迁移和侵袭的影响

hela细胞、a549细胞，cne-1细胞和人肺癌干细胞(hlcsc)被温育并用不同浓度的化合物1处理，即2μm、5μm和10μm。参照图1a，化合物1显著减小了由单个癌细胞产生的集落的尺寸和数目。化合物1显著抑制了hela细胞、a549细胞、cne-1细胞和hlcsc的迁移和侵袭，如分别通过图1a和1b中的跨膜迁移测定法和基质胶侵袭测定显示的，且被认为使其对自噬性溶酶体的影响相关，如lc3-1和lc3-ii的蛋白质测定中显示的。

此外，如图1c所示，化合物1显著抑制了hlcsc的肿瘤球形成。这些数据表明，化合物1是一种有效的体外抗肿瘤剂。

实施例2

化合物1对黏着斑动力学的时空调控的影响

自噬或内体运输通过改变微管动力学或表面蛋白的表现，或细胞外基质(ecm)蛋白质的分泌而有助于肿瘤细胞的迁移和侵袭。而且，黏着斑(fa)动力学是细胞迁移的关键过程。在这方面，评估了化合物1对黏着斑动力学的时空调控的影响。磷光体-y397fak免疫印迹用于评估化合物1对磷酸化和fak的去磷酸化动力学的影响。细胞也用诺考达唑处理，然后用诺考达唑去除和化合物1温育，分别针对fa和应力纤维用抗体染色抗纽蛋白和叶状蛋白。

参照图1e和1f，用诺考达唑处理细胞以便解聚微管来诱导和稳定黏着斑的形成，显示由纽蛋白染色模式(绿色)，而去除诺考达唑导致微管再生，这导致时间依赖模式的黏着斑的数量减少，直到黏着斑重新形成。参照图1e和1f，化合物1处理的细胞显著抑制了黏着斑的分解，表现为由诺考达唑释放后的一致的纽蛋白斑点染色。黏着斑激酶(fak)在y397上的磷酸化和去磷酸化是黏着斑动力学的另一种读数。

一致地，参考图1d，细胞的化合物1处理消除fak的磷酸化和去磷酸化动力学，正如通过磷光体-y397fak免疫印迹测定的。因此，这些数据表明化合物1损害黏着斑的分解动力学来抑制肿瘤细胞的迁移/侵袭。

实施例3

化合物1预处理对癌细胞的影响

由于化合物1显示为没有细胞毒性但在体外显著抑制癌细胞的侵袭，因此对异种移植肿瘤种植测试了化合物1在预处理方面的能力。将裸小鼠分成4个对照组和4个处理组，每组有6只裸小鼠。参考图2a，用dmso或10μm化合物1预处理lcsc48小时，然后经由皮下注射来注射到裸小鼠中。4周后，测量小鼠的肿瘤发病率以确定化合物1的预处理是否可以抑制小鼠中的入侵癌细胞。

下面的表1显示了治疗4周后测量的结果

基于上述结果和图2b，对人肺癌干细胞进行的化合物1预处理显著抑制了裸小鼠中的肺癌干细胞的肿瘤种植能力。对1×10⁶细胞的细胞种植浓度进行了统计分析，p<0.05。

实施例4

化合物1对癌细胞的抗转移作用

在肿瘤进展过程中，最危险的变化是从局部生长的肿瘤变化成转移性杀手。由于化合物1明显抑制癌症干细胞和癌细胞的迁移，因而发明人测试了化合物1抑制裸小鼠中异种移植瘤的转移的能力。

参照图3a，简言之，通过尾静脉将5×10⁵tflc3b表达的lcsc注射到裸小鼠中。尾静脉注射后24小时，每周进行3次化合物1(2.5mg/kg)的腹腔(ip)注射。8周后，处死所有的小鼠。将肺切除，并固定在pbs中的4％多聚甲醛中。计数切除的肺中的转移结节并进行苏木精/伊红(h&e)。

参考图3b和3c，化合物1处理显著地抑制了lcsc的转移，表现为与对照组相比，肺部中数量少得多的肿瘤结节和化合物1治疗组中的正常肺组织学。

类似地，在异种移植小鼠模型中评估了化合物1在人乳腺癌细胞ca1a中的抗转移作用。参考图4a，简要地，通过尾静脉将5×10⁵fluc-mcherry表达的ca1a细胞注射到裸小鼠中。尾静脉注射24小时后，每周进行3次化合物1(2.5mg/kg)和含有dmso的pbs的腹腔注射。通过每周2次crimaestro对小鼠成像以评估肿瘤进展。8周后，处死所有的小鼠。

如图4b所示，化合物1处理显著抑制人乳腺癌细胞ca1a的转移。

为了排除免疫缺陷(裸小鼠)对药物作用的影响，通过将小鼠乳腺癌4to7尾静脉注射到正常的balb小鼠中，然后每天腹腔注射化合物1(2.5mg/kg)24小时建立另一个转移瘤模型，如图5a所示。

如图5b所示，4to7细胞显示出比人类肺癌干细胞强得多的转移能力。化合物1处理显示出对野生型小鼠中的4to7细胞明显的抗转移作用，正如由比对照组少得多的肺中的肿瘤结节和正常的肺组织学。

由于4to7细胞比肺癌干细胞更具转移性，所以fluc-mcherry表达的4to7细胞通过尾静脉被注射到正常小鼠中，然后腹腔注射化合物1(2.5mg/kg)24小时，如图6a所示。通过每周2次crimaestro对小鼠进行成像以评估肿瘤进展。2周后处死小鼠，计数肺中的肿瘤集落数。如图6b所示，化合物1显著抑制正常小鼠中的4to7细胞的转移。

还评估了另一种转移模型中的化合物1的抗转移作用。参照图7a，fluc-mcherry表达的4t1细胞被注射到正常雌性小鼠的脂肪垫中，然后腹腔注射化合物1(2.5mg/kg)24小时。通过每周2次crimaestro对小鼠成像以评估肿瘤进展。4周后处死小鼠，计数肺中的肿瘤集落。如图7b所示，化合物1显著抑制正常小鼠中4t1细胞的转移。

实施例5

测定化合物1的毒性

发明人发现通过经由腹腔途径以250mg/kg施用化合物1没有急性毒性。因此，通过口服施用化合物1至小鼠来进行确定化合物1是否具有经由口服途径的急性毒性的测试。

具体地，通过口服途径将化合物1以250mg/kg的单次剂量施用至年轻的成年雄性和雌性小鼠，并且将含有二甲基亚砜的磷酸盐缓冲生理盐水通过口服途径施用至另一组雄性和雌性小鼠作为对照组。给药后观察所有动物2周以观察死亡率和毒性迹象。在2周内，还测量体重。2周后，切除器官进行组织病理学评估。

对所有测试动物进行尸检且观察肺、脾脏、肝脏和肾脏的药物毒性的证据。如图8a所示，化合物1(250mg/kg)对小鼠体重增加没有影响，并且处理过的小鼠显示没有行为异常的迹象(数据未显示)。参考图8b，与对照组相比，化合物1处理的小鼠中的所有组织或器官从组织学观点上是正常的。基于这些结果，认为化合物1在小鼠中没有急性毒性。

还在小鼠中测试了化合物1的亚急性毒性。具体地，通过腹腔途径将10mg/kg化合物1每天施用至年轻的成年雄性和雌性小鼠持续2周，并将含有二甲基亚砜的磷酸盐缓冲生理盐水施用至另一组雄性和雌性小鼠作为对照组。观察所有动物的一般行为和异常迹象持续2周。在2周内，每两天测量一次体重。2周后，切除器官用于组织病理学评估。

如图9a所示，化合物1(10mg/kg)对小鼠体重增加没有影响，并且处理的小鼠没有表现出行为异常的迹象(数据未显示)。同样，与对照组相比，经化合物1处理的小鼠中的所有组织或器官都是正常的，如图9b所示。这些结果表明，化合物1在小鼠中没有亚急性毒性。

至于化合物1的亚慢性毒性，每天通过腹腔途径将5mg/kg化合物1施用至年轻的成年雄性和雌性小鼠持续3个月，并将含二甲基亚砜的磷酸盐缓冲生理盐水施用至另一组雄性和雌性小鼠作为对照组。每周测定小鼠的体重。在试验期内观察所有动物的一般行为和异常征兆。3个月后，切除器官用于组织病理学评价。

如图10a所示，化合物1(5mg/kg)对小鼠体重增加没有影响，并且处理过的小鼠没有表现出行为异常的迹象(数据未显示)。同样地，与对照组相比，化合物1处理过的小鼠中的所有组织或器官都是正常的，如图10b所示。因此，基于上述结果，认为化合物1在小鼠中没有亚慢性毒性。