一种肝郁脾虚证溃疡性结肠炎动物模型的建立及应用的制作方法

本发明属于中医药领域，具体涉及一种肝郁脾虚证溃疡性结肠炎动物模型的建立及应用。
背景技术：
溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis,uc)，是一种病因尚未完全明确的肠道慢性非特异性结肠炎症，主要病变以肠道的连续性分布的黏膜充血肿胀、糜烂和浅小溃疡为主，主要累及结肠黏膜和黏膜下层，范围多自远段结肠开始，可逆行向近段发展，甚至累及全结肠，偶尔波及末段回肠。随着社会、经济的全球变化，人们的生活方式、饮食习惯及环境发生巨大变化，从而带动疾病谱的变化，uc溃的发病率逐年上升正是这种变化的缩影，基于国内多家医院的病例统计推测，其在我国的患病率为11.6/10万，而在西方国家，发病率达10/105-20/105、患病率达100/10万-200/10万，uc可发生于任何年龄阶段，以20-40岁多见，男女发病率无明显差异，且有家庭聚集性。临床可表现为腹泻、腹痛、黏液脓血便和里急后重，并可能伴有严重并发症，uc病程较长，难治愈，易复发，有癌症倾向，因此被世界卫生组织列为现代难治疾病之一。uc是西医学的概念，属中医“大瘕泄”、“肠澼”或“休息痢”的范畴。中医学认为先天禀赋不足，后天脾胃功能不健是发病的主要原因，发病多是在脾胃虚弱的基础上，并与肝、脾、肾情况密切相关，当人体感受外邪、饮食不慎或忧思恼怒等引起大肠传导失司、气机不畅、通降不利，损伤肠膜脉络而病。在《溃疡性结肠中医诊疗共识意见》中，将uc分为大肠湿热证、脾胃气虚证、脾肾阳虚证、肝郁脾虚证、阴血亏虚证和血瘀肠络证6型，以大肠湿热型及肝郁脾虚型最为常见。肝郁脾虚证的病机为情志不畅导致肝气郁克犯脾土，脾运失健，混杂而下，而成泄泻。现有的制备肝郁脾虚证方法如四氯化碳注射法会出现肝坏死、肝纤维化等肝组织器质性病变，与肝郁脾虚证的中医病机完全不符，而慢性多种应刺激组合的不可预知法，制备模型时间长、工作量大且更偏向于抑郁症模型的制备，此方法在研究中慢慢被淘汰。目前研究溃疡性结肠炎多以化学刺激制备uc动物模型，但其病程维持时间较短，还有许多模型并不能阐明其发病机制等缺点。随着中医在uc的治疗上越来越重要，建立科学、可靠、重复性好的中医模型显得不可或缺。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种建立肝郁脾虚证溃疡性结肠炎动物模型的方法，包括以下步骤，建模前对大鼠进行预游泳，剔除不合格的大鼠，将合格大鼠进行慢性束缚、过度劳累与饮食失节处理造模7天，第8天进行灌肠建立溃疡性结肠炎模型，大鼠禁食不进水24h，用10％水合氯醛0.3ml/100g腹腔注射麻醉后，将tnbs/乙醇溶液由大鼠肛门缓慢注入，倒立后将大鼠保持平躺状态，放置干净的鼠框内，自然清醒，第9天起大鼠继续进行慢性束缚、过度劳累与饮食失节处理，至第28天即得肝郁脾虚证溃疡性结肠炎动物模型。优选地，本发明所述的建立肝郁脾虚证溃疡性结肠炎动物模型的方法中，所述大鼠为spf级健康雄性大鼠，体重在180～250g；所述合格大鼠为所述预游泳的完成时间为大于等于10min且小于等于20min的大鼠。优选地，本发明所述的建立肝郁脾虚证溃疡性结肠炎动物模型的方法中，所述慢性束缚处理为将大鼠置于束缚装置进行束缚；所述束缚处理的时间为7天，每日连续束缚6～10小时。优选地，本发明所述的建立肝郁脾虚证溃疡性结肠炎动物模型的方法中，所述过度劳累处理为将所述大鼠置于(22±1)℃水温中游泳，期间禁止大鼠休息；所述禁止大鼠休息的时间为8～12分钟。优选地，本发明所述的建立肝郁脾虚证溃疡性结肠炎动物模型的方法中，所述饮食失节为隔日禁食处理，且禁食当日将饲料装入玻璃瓶中，使大鼠能看见且能接近但又无法吃到。优选地，本发明所述的建立肝郁脾虚证溃疡性结肠炎动物模型的方法中，所述tnbs/乙醇溶液为浓度在25～125mg/ml的tnbs/乙醇溶液。优选地，本发明所述的建立肝郁脾虚证溃疡性结肠炎动物模型的方法中，所述由大鼠肛门缓慢注入指的是使用一次性输液软管由大鼠肛门缓慢注入6～9cm深度。优选地，本发明所述的建立肝郁脾虚证溃疡性结肠炎动物模型的方法中，所述倒立指的是将大鼠保持倒立姿势6～14秒。本发明还提供了一种评价肝郁脾虚证溃疡性结肠炎动物模型的方法，包括使用逍遥颗粒联合柳氮磺胺吡啶用药对照组对动物模型作为对照组进行验证。优选地，本发明评价所述的评价肝郁脾虚证溃疡性结肠炎动物模型的方法中，所述逍遥颗粒联合柳氮磺胺吡啶用药对照组为对肝郁脾虚证溃疡性结肠炎动物模型造模动物进行逍遥颗粒与柳氮磺氨吡啶灌胃给药处理，给药剂量为300mg/kg，用药3周后大鼠肝郁脾虚证及uc症状基本消失。本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明针对目前肝郁脾虚证uc动物模型存在的缺陷，建立了科学、合理、客观及稳定的肝郁脾虚证uc造模新方法，且该方法具有重复性好、操作简便易行以及更符合中医理论与现代医学相结合的病证模型制备方法。本发明通过建立符合由中医理论指导的中医证候与现代医学相结合的uc模型，可以用于研究uc疾病的发生发展，有利于uc有关的病因学的理解，同时为推进中药治疗uc提供基础，本发明将为筛选治疗uc疾病药物提供可靠的药效评价模型，对治疗uc疾病具有重要的意义。附图说明图1为本发明的一个实施方式中的旷场试验设置方法示意图；图2为本发明的一个实施方式中的cmdi评分标准示意图；图3为本发明的一个实施方式中的三种方法诱导肝郁脾虚证uc结肠图片；图4为本发明的一个实施方式中的结肠病理组织评分标准(he，×100)；图5为本发明的一个实施方式中的三种方法诱导肝郁脾虚证uc结肠病理组织图片(he，×100)。具体实施方式下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1慢性束缚诱导肝郁脾虚证溃疡性结肠炎动物模型建立方法1.1实验试剂与仪器1.1.1动物：健康sd大鼠16只，雄性，spf级别，体重(210±10)g，购自昆明楚商科技有限公司，动物合格证号syxk(滇)k2012-0002，大理大学实验动物中心ivc动物房。饲养，自由饮水，给食12g/只/天，于温度(20±2)℃和湿度(50±2)％恒定的房间，光线12h白天/12h黑夜，适应性喂养1周后进行实验。1.1.2试剂：2,4,6-三硝基苯磺酸(trinitro-benzene-sulfonicacid,tnbs)，批号：slbp08899v，美国sigma公司；无水乙醇(ar)，批号：20140523，天津市风船化学试剂科技有限公司；甲醛溶液(ar)，批号：20140523，磷酸氢二钠(ar)，批号：20141008，磷酸二氢钠(ar)，批号：20140318，均购自天津市风船化学试剂科技有限公司；隐血试剂盒，批号：20150723，南京建成生物工程研究所；大鼠cort、acth、crhelisa检测试剂盒，批号：20161101，南京建成生物科技有限公司；水合氯醛(ar)，批号：20150203，国药集团化学试剂有限公司；氯化钠(ar)，批号：20140308，天津市风船化学试剂科技有限公司1.1.3仪器：独立送回风净化笼具ivc，型号：i5-mu-56，苏州市苏杭科技器材有限公司；电子天平，型号：ml204/02，梅特勒-托利多仪器有限公司；milli-q超纯水机，型号：rst-ro-20，美国millipore公司；塑料瓶8.5cm×18cm，云南昆明富日工茂公司；微距相机：尼康digitaicamerad7100型，微距镜头：af-smicro60/2.8ged；电热鼓风干燥箱，型号：101-3e，北京市永光明医疗仪器有限公司；台式高速冷冻离心机，型号：tl-16r，上海离心机机械研究所；酶标仪，型号：201，奥地利安图斯公司；-20℃冰箱，型号：bcd-219wak，青岛海尔特种电器有限公司；医用低温保存箱，型号：dw-86l626，青岛海尔特种电器有限公司医学图像分析系统bi-2000，成都泰盟科技有限公司；大水桶。1.2动物模型建立及分组：实验前将16只大鼠进行预游泳，剔除游泳时间少于10min，大于20min的8只大鼠，将合格大鼠进行慢性束缚法诱导肝郁脾虚证uc造模，3只/框。将大鼠置于特制的束缚装置中，(本实验采用塑料瓶：8.5cm×18cm)每日连续束缚8h(8:00-16:00)，连续肝郁脾虚证造模7d，于第8d进行uc造模：大鼠禁食不进水24h，用10％水合氯醛0.3ml/100g腹腔注射麻醉后，将25mg/mltnbs/乙醇溶液0.6ml由大鼠肛门缓慢注入8cm，保持倒立10s后将大鼠保持平躺状态，放置干净的鼠框内，自然清醒，第9d即uc造模成功。慢性束缚诱导肝郁脾虚证uc造模后第1d，将大鼠参考dai评分分组，按极轻度炎症、轻度炎症、中度炎症、重度炎症(以0-3分极轻度炎症，4-6分轻度炎症，7-9分中度炎症，10-12分重度炎症分组)可分为2，1，4，1只。以dai评分为依据，将轻度、中度、重度炎症者纳入实验，可纳入实验的模型大鼠占建模大鼠的比例75％，uc造模成功后每日仍然持续肝郁脾虚证造模，共造模28d，即制备完成慢性束缚法诱导肝郁脾虚证溃疡性结肠炎模型(m1组)。实施例2慢性束缚、过度劳累与饮食失节法诱导肝郁脾虚证溃疡性结肠炎动物模型建立方法2.1实验试剂与仪器2.1.1动物：健康sd大鼠25只，雄性，spf级别，体重(210±10)g，购自昆明楚商科技有限公司，动物合格证号syxk(滇)k2012-0002，大理大学实验动物中心ivc动物房。饲养，自由饮水，给食12g/只/天，于温度(20±2)℃和湿度(50±2)％恒定的房间，光线12h白天/12h黑夜，适应性喂养1周后进行实验。2.1.2试剂：2,4,6-三硝基苯磺酸(trinitro-benzene-sulfonicacid,tnbs)，批号：slbp08899v，美国sigma公司；无水乙醇(ar)，批号：20140523，天津市风船化学试剂科技有限公司；甲醛溶液(ar)，批号：20140523，磷酸氢二钠(ar)，批号：20141008，磷酸二氢钠(ar)，批号：20140318，均购自天津市风船化学试剂科技有限公司；隐血试剂盒，批号：20150723，南京建成生物工程研究所；逍遥颗粒(规格：每袋装15克)，批号：1510007，太极集团制药有限公司；柳氮磺胺吡啶肠溶片(sasp)，批号：20160505，上海信谊天平药业有限公司。大鼠cort、acth、crhelisa检测试剂盒，批号：20161101，南京建成生物科技有限公司；水合氯醛(ar)，批号：20150203，国药集团化学试剂有限公司；氯化钠(ar)，批号：20140308，天津市风船化学试剂科技有限公司2.1.3仪器：独立送回风净化笼具ivc，型号：i5-mu-56，苏州市苏杭科技器材有限公司；电子天平，型号：ml204/02，梅特勒-托利多仪器有限公司；milli-q超纯水机，型号：rst-ro-20，美国millipore公司；塑料瓶8.5cm×18cm，云南昆明富日工茂公司；微距相机：尼康digitaicamerad7100型，微距镜头：af-smicro60/2.8ged；电热鼓风干燥箱，型号：101-3e，北京市永光明医疗仪器有限公司；台式高速冷冻离心机，型号：tl-16r，上海离心机机械研究所；酶标仪，型号：201，奥地利安图斯公司；-20℃冰箱，型号：bcd-219wak，青岛海尔特种电器有限公司；医用低温保存箱，型号：dw-86l626，青岛海尔特种电器有限公司医学图像分析系统bi-2000，成都泰盟科技有限公司；大水桶。2.2动物模型建立及分组：实验将25只大鼠进行预游泳，剔除游泳时间少于10min，大于20min的6只大鼠，在剩余的19只大鼠中随机选取6只做为正常对照组，其余13只大鼠作为造模组，3只/框。正常对照组不进行任何刺激常规饲养，造模组大鼠均置于特制的束缚装置中，(本实验采用塑料瓶：8.5cm×18cm)每日连续束缚8h(8:00-16:00)；过度劳累：每天16:00pm将大鼠置于(22±1)℃水温中游泳10min，期间禁止大鼠爬出水槽、或攀爬其它大鼠背部、或站立等可以休息的行为。游泳结束后，将大鼠迅速从水中拿出，并擦干其皮毛，更换垫料；饮食失节：隔日禁食(1日禁食，次日足量给食，循环重复)，禁食时将饲料用透明塑料袋悬挂在笼子上方，让大鼠可以看到并接近饲料，但又无法吃到饲料，连续肝郁脾虚证造模7d。于第8d进行uc造模：大鼠禁食不进水24h，用10％水合氯醛0.3ml/100g腹腔注射麻醉后，将30mg/mltnbs/乙醇溶液0.6ml由大鼠肛门缓慢注入8cm，保持倒立10s后将大鼠保持平躺状态，放置干净的鼠框内，自然清醒，第9d即uc造模成功。uc造模后第1d，将大鼠参考dai评分分组，按极轻度炎症、轻度炎症、中度炎症、重度炎症(以0-3分极轻度炎症，4-6分轻度炎症，7-9分中度炎症，10-12分重度炎症分组)可分为1，1，14，3只。以dai评分为依据，将轻度、中度、重度炎症者纳入实验，可纳入实验的模型大鼠占建模大鼠的比例94.73％，将造模后的大鼠随机分为m2及x+s组。uc造模成功后每日仍然持续肝郁脾虚证造模，共造模28d，即制备完成慢性束缚+过度劳累+饮食失节法诱导肝郁脾虚证溃疡性结肠炎模型。于uc造模第7d开始灌胃给药，连续给药14d，慢性束缚法造模前30min给x+s组大鼠按照0.3ml/100g剂量灌胃逍遥颗粒(300mg/kg)，过度劳累法造模前30min给x+s组大鼠按照0.3ml/100g剂量灌胃柳氮磺氨吡啶(300mg/kg)。正常对照组、慢性束缚+过度劳累+饮食失节uc(m2组)组则分别灌服同等换算体积的生理盐水。实施例3夹尾、过度劳累与饮食失节法诱导肝郁脾虚证溃疡性结肠炎动物模型建立方法3.1实验试剂与仪器3.1.1动物：健康sd大鼠16只，雄性，spf级别，体重(210±10)g，购自昆明楚商科技有限公司，动物合格证号syxk(滇)k2012-0002，大理大学实验动物中心ivc动物房。饲养，自由饮水，给食12g/只/天，于温度(20±2)℃和湿度(50±2)％恒定的房间，光线12h白天/12h黑夜，适应性喂养1周后进行实验。3.1.2试剂：2,4,6-三硝基苯磺酸(trinitro-benzene-sulfonicacid,tnbs)，批号：slbp08899v，美国sigma公司；无水乙醇(ar)，批号：20140523，天津市风船化学试剂科技有限公司；甲醛溶液(ar)，批号：20140523，磷酸氢二钠(ar)，批号：20141008，磷酸二氢钠(ar)，批号：20140318，均购自天津市风船化学试剂科技有限公司；隐血试剂盒，批号：20150723，南京建成生物工程研究所；大鼠cort、acth、crhelisa检测试剂盒，批号：20161101，南京建成生物科技有限公司；水合氯醛(ar)，批号：20150203，国药集团化学试剂有限公司；氯化钠(ar)，批号：20140308，天津市风船化学试剂科技有限公司3.1.3仪器：独立送回风净化笼具ivc，型号：i5-mu-56，苏州市苏杭科技器材有限公司；电子天平，型号：ml204/02，梅特勒-托利多仪器有限公司；milli-q超纯水机，型号：rst-ro-20，美国millipore公司；微距相机：尼康digitaicamerad7100型，微距镜头：af-smicro60/2.8ged；电热鼓风干燥箱，型号：101-3e，北京市永光明医疗仪器有限公司；台式高速冷冻离心机，型号：tl-16r，上海离心机机械研究所；酶标仪，型号：201，奥地利安图斯公司；-20℃冰箱，型号：bcd-219wak，青岛海尔特种电器有限公司；医用低温保存箱，型号：dw-86l626，青岛海尔特种电器有限公司医学图像分析系统bi-2000，成都泰盟科技有限公司；大水桶、塑料夹子。3.2动物模型建立及分组：实验前将16只大鼠进行预游泳，剔除游泳时间少于10min，大于20min的8只大鼠，将合格大鼠将合格大鼠进行夹尾+慢性束缚+过度劳累法诱导肝郁脾虚证uc造模，3只/框。将造模的每只大鼠的尾巴用塑料夹夹住，让其相互撕咬、打斗或尝试转头咬掉塑料夹，若塑料夹被咬掉，立即重新夹上，若停止相互厮咬、打斗，则用小铁丝对其肢体予以刺激，让其重新打斗或奔跑，每日处理1次，10min/次；过度劳累：每天16:00pm将大鼠置于(22±1)℃水温中游泳10min，期间禁止大鼠爬出水槽、或攀爬其它大鼠背部、或站立等可以休息的行为。游泳结束后，将大鼠迅速从水中拿出，并擦干其皮毛，更换垫料；饮食失节：隔日禁食(1日禁食，次日足量给食，循环重复)，禁食时将饲料用透明塑料袋悬挂在笼子上方，让大鼠可以看到并接近饲料，但又无法吃到饲料，连续肝郁脾虚证造模7d。于第8d进行uc造模：大鼠禁食不进水24h，用10％水合氯醛0.3ml/100g腹腔注射麻醉后，将75mg/mltnbs/乙醇溶液0.6ml由大鼠肛门缓慢注入8cm，保持倒立10s后将大鼠保持平躺状态，放置干净的鼠框内，自然清醒，第9d即uc造模成功。uc造模后第1d，将大鼠参考dai评分分组，按极轻度炎症、轻度炎症、中度炎症、重度炎症(以0-3分极轻度炎症，4-6分轻度炎症，7-9分中度炎症，10-12分重度炎症分组)可分为2，3，2，1只。以dai评分为依据，将轻度、中度、重度炎症者纳入实验，可纳入实验的模型大鼠占建模大鼠的比例75％。uc造模成功后每日仍然持续肝郁脾虚证造模，共造模28d，即制备完成夹尾+过度劳累+饮食失节法诱导肝郁脾虚证溃疡性结肠炎模型(m3组)。实施例1～3通过以下指标检测进行优选：1.一般状态观察：观察并记录造模中各组大鼠的情绪行为、毛发色泽、饮食、大小便等外观行为方面的变化。2.大鼠体重变化：每日8:00am用电子秤称量大鼠体重。计算uc造模后1、4、7、10、14、21d各组大鼠体变化。3.旷场试验：如图1所示，实验用自制木质旷场箱为立方形，长×宽×高为100cm×100cm×40cm，内侧壁及底面为灰色。底面用黑线划分为25块面积相等的正方形(大小20cm×20cm)。沿侧壁的格称为外周格(16个周边正方形)，其余为中心格(9个中心正方形)。分别于第0、7、14、21、28d进行测定，为避免生物节律影响，实验均在当日8:00am开始，环境要求安静，室内灯光采用动物房夜间光照强度，四周由全封闭的遮光帘隔离人及其他仪器干扰并杜绝参照物。实验前先将大鼠放于测试实验室内适应10min后，将大鼠放入自制旷场实验箱的中心位置，观察3min内大鼠的活动情况。由2位评定者评定1只大鼠在3min内的运动情况。包括4个指标(中心格停留时间、水平穿越格数、站立次数、修饰次数)。观察指标包括：a中心格(9个中心正方形)停留时间：操作者握住大鼠尾根部1/3处，轻轻将大鼠放入旷场箱的中央区内(以旷场箱中心点为中心的60cm×60cm为中央格区，即红色或加粗线条所示区域)，开始计时，记录大鼠在中心格区域的停留时间。b水平穿越格数：三爪以上跨入相临格的次数，以穿越底面方格数为其水平穿格数得分。c站立次数：两前肢向上抬起离开箱底面或攀伏在侧壁上，以后腿支撑使身体直立(双足离开底面至放下为1次活动)为站立次数得分。d理毛次数：两前肢理毛、抓痒、洗脸、舔足的次数。一只大鼠完成观察后，用喷壶在箱底喷洒少量的低浓度酒精，并用毛巾蘸清水彻底擦拭箱底，避免因留有气味而干扰下只大鼠的得分测定。4.糖水偏好程度实验：在适应性饲养一周时，实验前，训练实验大鼠适应含糖饮水，即：每笼同时并排放置2个饮水瓶，第1个24h内，每瓶均装有1％蔗糖水；随后的24h，1瓶装1％蔗糖水，另1瓶装纯净水。经过24h禁水禁食后，开始进行蔗糖水实验：即同时给予每只大鼠事先定量好的2瓶水，1瓶为1％蔗糖水，1瓶为纯净水，水瓶(左/右)随机放置，1h后取走两瓶并称重。分别于第0、7、14、21、28d进行测定，每次测试当天的同一时间进行，每次测1h(16:00-17:00)，测试前每组大鼠均禁食禁水24h。即各组造模后马上进行糖水消耗实验，正式测试前称量灌入糖水的水瓶重量，结束后再次称量水平重量，计算糖水消耗量。糖水偏好程度＝糖水消耗量(g)/总液体消耗量(g)×100％5.肝郁脾虚证大鼠下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(hpa)变化：严格按照酶联免疫试剂盒说明书测定血浆acth、cort及下丘脑crh变化操作。6.疾病活动指数(diseaseactivityindex,dai)评分：参考hamamoto等标准(详见表1)，于uc造模后1d、4d、7d、10d、14d、21d、28d称量大鼠体重、观察粪便性状及粪便隐血情况，按表1评分，将体重减轻、粪便性状、粪便隐血情况的评分加和，计算每只大鼠的疾病活动情况。通过对大鼠疾病活动指数的评分大体评估造模情况。表1dai评分标准分数体重下降(％)粪便性状隐血情况0正常正常阴性(-)11～5正常～稀便弱阳性(+)26～10稀便阳性(++)311～15稀便-腹泻强阳性(+++)4>15腹泻肉眼可见出血注：粪便性状：正常粪便＝可成形的粪便；腹泻＝黏于肛门的液化粪；体重下降(％)＝(某时间点的体重一造模前体重)/造模前体重×100％大便隐血：采用隐血试剂盒检测，用棉签挑起少许大鼠大便于白瓷板上，滴加邻联甲苯胺液，再滴加过氧化氢液，根据显色时间和显色程度进行隐血等级评分。隐血情况评分标准：0分＝阴性(-)(3min后不显蓝绿色)；1分＝隐血(+)(30-60s内显蓝色)；2分＝隐血(++)(立即显蓝绿色)；3分＝隐血(+++)(立即显深蓝色)；4分＝肉眼血便。dai＝体重下降的评分+粪便性状的评分+隐血情况的评分7.结肠指数及黏膜损伤指数(colonmucosaldamageindex,cmdi)评分于uc造模后1d、4d、7d、10d、14d、21d、28d按照大鼠分组编号各处死一批大鼠。提前对处死组大鼠进行24h禁食不禁水处理，10％水合氯醛麻醉大鼠，解剖将取出的结肠沿肠系膜剪开，生理盐水洗净，平铺于白瓷板上，置于冰上用肉眼观察结肠黏膜损伤情况(详见表2)，评分后称量大鼠结肠湿重并计算结肠指数(脏器指数(mg/g)＝脏器湿重(mg)/解剖前体重(g))。表2cmdi评分标准(参见图2，其中下部为近肛端)8.结肠病理组织学(histologicalscore,hs)评分病理组织学评分由大理州人民医院病理科严长宝主治医师诊断，戴莉萍主任医师复核。结肠用10％福尔马林固定，剪取病变明显部位约1-2cm2大小，漂洗后，酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，3-5μm切片，he染色，中性树胶封片，光学显微镜下观察病理切片，参照gm等标准(详见表3，图4)。表3结肠hs评分标准每只大鼠总评分＝上皮细胞评分+炎细胞浸润评分9.对大鼠血清il-6及大鼠结肠匀浆mpo、il-17进行检测：采用酶联免疫法检测对il-6、mpo、il-17进行检测。实施例1～3指标检测结果：1.一般状态观察结果k组(正常对照组)大鼠被毛光滑，色白，动作敏捷，反应灵活，饮食、水量正常，大小便均正常。m1组(实施例1处理组)：大鼠毛发无光泽、枯乱，少动、扎堆、不活跃，情绪低落、表情淡漠和争斗减少，饮食逐渐减少，倦卧，大便由正常变为稍干至便溏，m3组(实施例3处理组)大鼠一般状况与m1组相似。m2组(实施例2处理组)在慢性束缚+过度劳累+饮食失节uc造模后1d即出现稀便，随后相继出现黏液便、脓血便，同时伴有竖毛、毛色失去光泽、消瘦、拱背、喜聚集、懒动、饮食减少等现象，x+s组(阳性药逍遥颗粒联合柳氮磺胺吡啶组)上述症状随时间而均有不同程度的改善，用药1周后大便开始好转，脓血便减少，第3周时上述症状基本消失。2.大鼠体重变化结果与k组比较，各肝郁脾虚uc造模组大鼠体重在各时间点均显著降低(p＜0.01)；与m1组比较，各肝郁脾虚uc造模组大鼠在uc造模后不同时间点体重均低于m1组，使用x+s治疗后，能显著升高慢性束缚+过度劳累+饮食失节法诱导的肝郁脾虚证uc(m2组)大鼠体重(p＜0.01)。表4肝郁脾虚证uc大鼠体重的变化(n＝6)注：与k组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与m1组比较，δp＜0.05，δδp＜0.01；与m2组比较，▲p＜0.05，▲▲p＜0.01；与m3组比较，▽p＜0.05，▽▽p＜0.01；3.旷场实验结果实验大鼠中心格停留时间情况详见表5。0d时5组大鼠中心格停留时间无统计学差异；造模7d、14d、21d及28d三组模型组大鼠中心格停留时间仍高于k组(p＜0.01)。第28d，与m1组相比较，m2组及m3组大鼠中心格停留时间存在显著性差异(p＜0.01)，其中，m2组大鼠中心格停留时间最长。x+s能缩短m1、m2及m3组大鼠中心格停留时间(p＜0.01)。表5肝郁脾虚证造模不同时间大鼠中心格停留时间的变化(n＝6)注：与k组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与m1组比较，δp＜0.05，δδp＜0.01；与m2组比较，▲p＜0.05，▲▲p＜0.01；与m3组比较，▽p＜0.05，▽▽p＜0.01实验大鼠水平穿格数详见表6。0d5组大鼠水平穿格数比较，无统计学差异；造模7d、14d、21d及28d时三组模型组大鼠水平穿格数明显低于k组(p＜0.01或p＜0.05)。第28d，与m2组相比较，m1、m3组大鼠在水平穿格数上存在显著性差异(p＜0.01)，m2组大鼠水平穿格数降低最为明显。x+s能显著增加m1、m2及m3组大鼠水平穿格次数(p＜0.01)。表6肝郁脾虚证造模不同时间大鼠水平穿格数(n＝6)注：与k组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与m1组比较，δp＜0.05，δδp＜0.01；与m2组比较，▲p＜0.05，▲▲p＜0.01；与m3组比较，▽p＜0.05，▽▽p＜0.01实验大鼠理毛次数详见表7。0d时5组大鼠理毛次数无统计学差异；造模7d、14d、21d及28d时三组肝郁脾虚证组大鼠理毛次数明显低于k组(p＜0.01)，第28d，m1、m2及m3组间在大鼠理毛次数上均无统计学差异，但m2组大鼠理毛次数降低最明显。x+s能增加m1、m2及m3组大鼠水平穿格次数。表7肝郁脾虚证造模不同时间大鼠理毛次数(n＝6)注：与k组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与m1组比较，δp＜0.05，δδp＜0.01；与m2组比较，▲p＜0.05，▲▲p＜0.01；与m3组比较，▽p＜0.05，▽▽p＜0.01。实验大鼠站立次数详见表8。0d时5组大鼠站立次数无统计学差异；造模7d时3组模型组大鼠站立次数均降低，与k组比较，降低均具有统计学差异(p＜0.01)；造模14d、21d及28d时3组模型组大鼠站立次数显著降低(p＜0.01)；第28d，与m2组相比较，m1、m3组大鼠在站立次数上存在显著升高(p＜0.01)。x+s能增加m1、m2及m3组大鼠站立次数。表8肝郁脾虚证造模不同时间大鼠站立次数(n＝6)注：与k组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与m1组比较，δp＜0.05，δδp＜0.01；与m2组比较，▲p＜0.05，▲▲p＜0.01；与m3组比较，▽p＜0.05，▽▽p＜0.01；4.糖水偏好程度实验结果实验大鼠糖水偏好程度的影响详见表9。。0d时，5组大鼠糖水偏好程度无统计学差异，随着造模时间的延长，k组大鼠糖水偏好程度0d至21d呈现降低，于造模28d时呈现升高的趋势；3组模型组大鼠糖水偏好程度均呈现降低趋势，其中m2组大鼠在造模后14d至28d期间糖水偏好程度量最低。造模7d、14d、21d及28d时大鼠糖水偏好程度显著低于k组(p＜0.01)。x+s能改善m1、m2及m3组大鼠糖水偏好程度，在数值上与k组相近。表9肝郁脾虚证造模不同时间大鼠糖水偏好程度影响(n＝6)注：与k组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与m1组比较，δp＜0.05，δδp＜0.01；与m2组比较，▲p＜0.05，▲▲p＜0.01；与m3组比较，▽p＜0.05，▽▽p＜0.015.肝郁脾虚证大鼠下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(hpa)实验结果对大鼠下丘脑crh的影响：与k组比较，各造模组大鼠下丘脑crh均升高，除x+s组，其余各组均显著升高(p<0.01)；与m1组比较，m2组crh升高，而其余各组均降低，x+s组大鼠下丘脑crh显著降低(p<0.01或p<0.05)；与m2组比较，m3有所降低，而x+s组crh含量均显著降低(p<0.01或p<0.05)；m2组crh含量最高。对大鼠血浆acth的影响：与k组比较，各造模组大鼠血浆acth均升高，x+s组大鼠血浆acth含量与k组相当，其余各组大鼠acth含量均显著升高(p<0.01)；与m1组比较，m2、m3组大鼠血浆acth均降低，除m2组外，其余各组均显著降低(p<0.01或p<0.05)；与m2组比较，x+s组大鼠血浆acth含量显著降低(p<0.01或p<0.05)；m2组含量与m3组acth含量相当。对大鼠血浆cort的影响：除x+s组，其余各组大鼠血浆cort均升高，其中m1组、m2组显著升高(p<0.01或p<0.05)；与m1组比较，m2、m3组大鼠血浆cort含量均降低；与m2组比较，x+s组显著降低(p<0.01)。表10肝郁脾虚证uc大鼠下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(hpa)变化(n＝6)注：与k组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与m1组比较，δp＜0.05，δδp＜0.01；与m2组比较，▲p＜0.05，▲▲p＜0.01；与m3组比较，▽p＜0.05，▽▽p＜0.01。6.疾病活动指数(diseaseactivityindex,dai)评分实验结果与k组比较，各造模组大鼠dai评分随时间延长，与当天k组dai评分比较均升高，各肝郁脾虚uc造模组大鼠dai评分在药物治疗后均高于k组，其中造模后10d及14d均显著升高(p<0.01)，造模28d时，x+s组大鼠daui评分与k组相当；与m1组比较，uc造模21dm2组dai评分显著升高，dai评分有下降的趋势，m3组在数值上与m1组相当x+s组。与m2组相比，m3及x+s组dai评分显著降低(p<0.05或p<0.01)。与m3组相比，x+s组dai评分显著降低(p<0.05)。表11肝郁脾虚证uc大鼠dai评分的变化(n＝6)注：与k组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与m1组比较，δp＜0.05，δδp＜0.01；与m2组比较，▲p＜0.05，▲▲p＜0.01；与m3组比较，▽p＜0.05，▽▽p＜0.01。7.结肠指数及黏膜损伤指数(colonmucosaldamageindex,cmdi)评分实验结果如图3(三种方法诱导肝郁脾虚证uc结肠图片)所示，肝郁脾虚证uc大鼠结肠长度的变化：与k组比较，各组大鼠结肠长均显著缩短(p<0.01或p<0.05)；与m1组比较，m2组显著缩短(p<0.01)；与m2组比较，m3及x+s组大鼠结肠显著变长(p<0.01或p<0.05)。对肝郁脾虚证uc大鼠结肠长宽比的变化：与k组比较，除m1组以外，各组结肠长宽比均显著降低(p<0.01或p<0.05)；与m1组比较，m2组及x+s组大鼠结肠长宽比显著降低(p<0.01或p<0.05)；与m2组比较，m3组及x+s组大鼠结肠长宽比均显著升高(p<0.01)。肝郁脾虚证uc大鼠结肠cmdi评分的变化：与k组比较，除m1组外，各模型组大鼠结肠cmdi评分均显著升高(p<0.01或p<0.05)；与m1组比较，m2组显著升高(p<0.01)；与m2组比较，x+s组显著降低(p<0.01或p<0.05)。表12肝郁脾虚证uc大鼠cmdi评分的变化(n＝6)注：与k组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与m1组比较，δp＜0.05，δδp＜0.01；与m2组比较，▲p＜0.05，▲▲p＜0.01；与m3组比较，▽p＜0.05，▽▽p＜0.01。8.结肠病理组织学(histologicalscore,hs)评分实验结果如图5所示，与k组及m1组比较，各肝郁脾虚证uc造模组大鼠hs评分均显著性升高(p<0.01或p<0.05)；与m2组相比，各药物治疗组大鼠结肠hs评分均呈现降低趋势，其中除mz1(50mg/kg)组，其余各组均显著降低(p<0.01或p<0.05)。医学图像分析系统下观察结肠he切片可看出：k组及m1组大鼠出现少量杯状细胞丢失，炎性细胞少量浸润至隐窝基底层；m2组出现大量杯状细胞丢失及少量隐窝细胞丢失，大量中性粒细胞浸润到黏膜肌层，并伴随黏膜增厚和明显水肿；mz各剂量组、s组及x+s组大鼠同m组相比，出现隐窝细胞、杯状细胞修复，炎性细胞浸润减少现象；其中s组对肝郁脾虚uc大鼠结肠上皮细胞损伤恢复较好，x+s组对肝郁脾虚uc大鼠结肠炎性细胞浸润减少的效果较好；mz400mg/kg量组在mz各剂量组中对肝郁脾虚uc结肠黏膜损伤恢复最佳。表13肝郁脾虚证uc大鼠hs评分的变化(n＝6)注：与k组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与m1组比较，δp＜0.05，δδp＜0.01；与m2组比较，▲p＜0.05，▲▲p＜0.01；与m3组比较，▽p＜0.05，▽▽p＜0.01。9.对大鼠血清il-6及大鼠结肠匀浆mpo、il-17检测实验结果肝郁脾虚证uc大鼠血清il-6的变化：与k组比较，除x+s组，其余各组大鼠血清il-6含量均升高，其中m2组显著升高(p<0.01)；与m1组比较，m2组大鼠血清il-6显著升高(p<0.05)，m3及x+s组大鼠血清il-6变化不大；与m2组比较，m3组大鼠血清il-6含量降低，x+s组大鼠il-6显著降低(p<0.01)。肝郁脾虚证uc大鼠血清cox-2的变化：与k组比较，各造模组血清cox-2含量均升高，其中m2组显著升高(p<0.01)；与m1组比较，除x+s组，m2及m3组大鼠血清cox-2含量均显著升高(p<0.01或p<0.05)；与m2组比较，m3及x+s组大鼠血清cox-2含量显著降低(p<0.01)。表14肝郁脾虚证uc大鼠血清il-6，cox-2的影响(x±s，n＝6)注：与k组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与m1组比较，δp＜0.05，δδp＜0.01；与m2组比较，▲p＜0.05，▲▲p＜0.01；与m3组比较，▽p＜0.05，▽▽p＜0.01。由上述实验结果可知，m1、m2、m3、x+s各组在uc造模后第1d的dai评分差异没有统计学差异(表11)，即各组的uc严重程度具有可比性而肝郁脾虚证造模后大鼠旷场实验、糖水偏好实验以及下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(hpa)变化实验数据来看，慢性束缚法、慢性束缚+过度劳累+饮食失节法和夹尾+过度劳累+饮食失节法造成肝郁脾虚证的程度不同，尤以慢性束缚+过度劳累+饮食失节法效果最好。肝郁脾虚证uc造模后，大鼠血浆acth、cort及下丘脑crh均显著升高(p<0.01)，提示肝郁脾虚证uc大鼠存在hpa轴亢进状态，经x+s治疗后，肝郁脾虚证uc大鼠血浆acth、cort(p<0.01或p<0.05)及下丘脑crh含量(p<0.01或p<0.05)均降低，且m2组的chr及acth显著升高(p<0.01)。血清生化指标结果显示：m2组大鼠血清中il-6及cox-2显著升高(p<0.01)，x+s可通过下调炎性因子il-6的表达和显著降低cox-2水平(p<0.01)而保护肠道的稳定，减少肠道损伤。m2、m3组大鼠肠黏膜水肿、腺体破坏、杯状细胞大量缺失、隐窝被破坏、大量中性粒细胞浸润到肠黏膜肌层，炎症严重；给药治疗后，黏膜修复，可见杯状细胞和腺体有不同程度的恢复、炎症细胞减少。提示x+s能有效的改善肝郁脾虚证uc大鼠结肠形态，缓解肝郁脾虚uc病症。根据上述结果可得出，慢性束缚+过度劳累+饮食失节uc组(m2)是符合中医理论与现代医学结合的肝郁脾虚证uc模型，逍遥颗粒与柳氮磺胺吡啶联用具有治疗大鼠肝郁脾虚证uc的作用，其治疗作用可能与下调下丘脑crh，血浆acth、cort来缓解hpa轴持续亢进，下调炎症因子il-6，cox-2的含量有关。由于uc治疗周期较长，在筛选药物、评价药效时，实验周期较长，这就要求一个稳定的动物模型。而，根据上述结果可知，m1组和m3组大鼠的体重变化、中心格停留时间和水平穿格数、dai评分等方面，在造模后的第14d～28d期间开始反弹，亦即，造模大鼠在给药期间即开始自愈。大鼠自愈会干扰受试药物的药效评价，而m2组在整个实验过程的检测结果都非常稳定，因此慢性束缚+过度劳累+饮食失节uc组是理想的肝郁脾虚证溃疡性结肠炎药效评价动物模型。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12