1-羟基蒽醌在抑菌、干预致病菌生物被膜及治疗奶牛乳房炎中的用途的制作方法

本发明涉及1-羟基蒽醌在抗菌中的新药理用途，尤其涉及1-羟基蒽醌在抑制木糖葡萄球、干预木糖葡萄球生物被膜及治疗奶牛乳房炎的新的药理用途，属于1-羟基蒽醌药理活性新用途领域。

背景技术

奶牛乳房炎是造成牛乳生产制造行业经济损失的主要疾病。统计显示，奶牛乳房炎每年对全球牛乳生产制造行业带来的损失高达350亿美元。奶牛乳房炎会致使奶牛的产奶量下降，因此，患乳房炎的病牛中有一部分因为产奶量低，治疗成本高而被淘汰。迄今为止引起奶牛乳房炎的病原菌除了常见的金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌等以外，在乳房炎的临床防治中，随着抗生素的滥用，凝固酶阴性葡萄球菌(cns，coagulase-negativestaphylocci)如木糖葡萄球菌(staphylococcusxylosus,s.xylosus)引起的感染呈上升趋势，已成为引起奶牛乳房炎发病的新特点(tremblayydn,lamarched,cheverp,etal.characterizationoftheabilityofcoagulase-negativestaphylococciisolatedfromthemilkofcanadianfarmstoformbiofilms[j].journalofdairyscience,2013,96(1):234-46.)。

木糖葡萄球菌(staphylococcusxylose,s.xylose)广泛分布于自然界中，是亚临床型奶牛乳房炎的重要机会致病菌(blaiottag,pennacchiac,villanif,etal.diversityanddynamicsofcommunitiesofcoagulase-negativestaphylococciintraditionalfermentedsausages[j].journalofappliedmicrobiology,2004,97(2):271-84)。国内外科研工作者发现木糖葡萄球菌能够形成成熟的生物被膜(biofilm,bf)(planchons,desvauxm,chafseyi,etal.comparativesubproteomeanalysesofplanktonicandsessilestaphylococcusxylosusc2a:newinsightincellphysiologyofacoagulase-negativestaphylococcusinbiofilm[j].journalofproteomeresearch,2009,8(4):1797-809；planchons,gaillard-martinieb,dordet-frisonie,etal.formationofbiofilmbystaphylococcusxylosus[j].internationaljournaloffoodmicrobiology,2006,109(1-2):88-96；kotb,binekt,piechotam,etal.virulencefactorsandabilityofstaphylococcifrombovinemilkandthecowshedenvironmenttobiofilmformation[j].polishjournalofveterinarysciences,2013,16(4):639-45.)，其生物被膜结构被蛋白质、核酸、胞外多糖和其他材料所包裹，生物被膜结构内的细菌对热处理和抗生素有很强的耐受性，能够抵抗先天性免疫系统和适应性免疫系统的清除作用，并可以持续性的交换基因物质加快变异速度，因此，木糖葡萄球菌形成生物被膜后使其持续性感染(nakamuray,yamamoton,kinoy,etal.establishmentofamulti-speciesbiofilmmodelandmetatranscriptomicanalysisofbiofilmandplanktoniccellcommunities[j].appliedmicrobiologyandbiotechnology,2016,100(16):7263-79.bonifaitl,grignonl,grenierd.fibrinogeninducesbiofilmformationbystreptococcussuisandenhancesitsantibioticresistance[j].appliedandenvironmentalmicrobiology,2008,74(15):4969-72.)。因此对木糖葡萄球菌生物被膜调控机制的研究，提高奶牛乳房炎预防和治疗的效果，已经成为国内外研究热点之一。

生物被膜状态的细菌与浮游态的细菌在组成结构、生理特性、耐药性等方面差异较大。生物被膜状态的细菌对抗生素及宿主的免疫反应是不敏感的，生物被膜状态的细菌对抗菌剂的耐药性是一个多因素过程，主要是生物被膜中细菌与其浮游态在生理性上有所不同。生物被膜形成后细菌可表达出独特的、不同于浮游菌的生物被膜表型，表达独特的抗性基因。由于细菌生物被膜的耐药机制完全不同于浮游菌，能够抑制浮游态的细菌的抗菌药物不一定能够干预或抑制细菌生物被膜；临床上发现即使反复试验证明有效的药物，但也不能清除生物被膜，导致感染迁延不愈，浪费了大量的人力及物力，形成了公共卫生问题。

谷氨酰胺合成酶可催化谷氨酸与铵合成谷氨酰胺，谷氨酰胺对于大部分生物的生长和生物量的产生是必不可少的。谷氨酰胺的生化功能有很多，例如合成蛋白质和脂质、酸碱平衡的调节、碳源和氮的提供等。代谢过程关系到细菌生物被膜的形成，其中氮的限制(nitrogenlimitation)在生物被膜的形成中起着关键性作用(chandrah,basirsf,guptam,etal.glutaminesynthetaseencodedbyglna-1isnecessaryforcellwallresistanceandpathogenicityofmycobacteriumbovis[j].microbiology-sgm,2010,156.)。而谷氨酰胺和谷氨酸是氮代谢过程中关键的效应分子(gunkak,commichaufm.controlofglutamatehomeostasisinbacillussubtilis:acomplexinterplaybetweenammoniumassimilation,glutamatebiosynthesisanddegradation[j].molecularmicrobiology,2012,85(2):213-24.)。有报道称，谷氨酰胺的限制作用在生物被膜的振荡性扩张中起着至关重要的作用。谷氨酰胺合成酶由glna基因编码而来，glna基因的缺失不仅不利于生物被膜在聚苯乙烯表面的形成，而且会减弱病原菌的致病性(gunkak,commichaufm.controlofglutamatehomeostasisinbacillussubtilis:acomplexinterplaybetweenammoniumassimilation,glutamatebiosynthesisanddegradation[j].molecularmicrobiology,2012,85(2):213-24.)。因此，谷氨酰胺合成酶可以作为药物开发的新靶点。

1-羟基蒽醌主要来源于虎刺和巴戟天的根部，属于蒽醌类化合物。迄今为止，1-羟基蒽醌对木糖葡萄球菌生物被膜是否具有干预作用以及对于奶牛乳房炎是否具有确切的治疗功效等尚不清楚，亟待进行研究，以确定其能否有效防治由木糖葡萄球菌或其生物被膜所导致的各种疾病。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供1-羟基蒽醌在制备抑制木糖葡萄球菌、干预木糖葡萄球菌生物被膜以及治疗奶牛乳房炎等药物上的新用途。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

本发明首先通过亚抑菌浓度1-羟基蒽醌干预木糖葡萄球菌glna基因缺失株和野生株生物被膜形成，结晶紫染色结果显示1/2mic1-羟基蒽醌对木糖葡萄球菌glna基因缺失株和野生株的生物被膜形成的不同时期均有显著的抑制作用。鉴于结晶紫染色法只能反映生物被膜的总量，本发明进一步结合扫描电镜法从微观角度对生物被膜的形态进行观察，扫描电镜结果显示与对照组相比，1/2mic1-羟基蒽醌处理过的木糖葡萄球菌glna基因缺失株和野生株的微观结构无论在厚度、面积还是形态均遭到严重破坏，仅少数菌体粘连，个体间连接不紧密，可见其生物被膜形成能力大大降低，这说明1-羟基蒽醌能干预木糖葡萄球菌glna基因缺失株和野生株生物被膜的形成。另外1/2mic1-羟基蒽醌处理过的木糖葡萄球菌glna基因缺失株和野生株和对照组相比谷氨酰胺合成酶活性和谷氨酰胺含量均极显著性下降，而当glna基因缺失株添加谷氨酰胺后，生物被膜形成能力在12h、24h显著性增加，这说明1-羟基蒽醌可能通过作用于谷氨酰合成酶，使谷氨酰胺含量下降，因此影响生物被膜的形成。谷氨酰胺合成酶由glna基因编码，realtimepcr结果证明1/2mic的1-羟基蒽醌可以下调glna，进而降低谷氨酰胺合成酶的释放和表达，通过抑制氮代谢而干预生物被膜的形成，本发明从基因水平上验证了1-羟基蒽醌对谷氨酰合成酶的作用。此外，分子对接结果显示，1-羟基蒽醌与谷氨酰胺合成酶能直接结合，导致谷氨酰胺合成酶活性下降。根据这些试验结果证明，1-羟基蒽醌可通过作用于谷氨酰胺合成酶进而抑制木糖葡萄球菌体外生物被膜的形成。

另外，本发明还通过建立小鼠乳房炎模型探讨1-羟基蒽醌对木糖葡萄球菌引起的乳房炎模型的治疗效果。由于小鼠的乳腺结构和奶牛的乳腺结构类似，利用小鼠可以较全面的模拟奶牛乳房炎的发病机理和发病过程，通过炎性因子检测和组织切片等方法可以很好的反映乳房炎的发病程度,为奶牛乳房炎的诊断和治疗提供可靠的理论依据。本发明采用木糖葡萄球菌和木糖葡萄球菌glna缺失株成功诱导乳腺炎症，给药治疗后，tnf-α、il-6炎性因子含量显著降低，观察切片时发现组织中炎性细胞减少、有不同程度的修复和再生，试验结果表明1-羟基蒽醌对小鼠乳房炎有较好的治疗效果。

综上，1-羟基蒽醌对木糖葡萄球菌以及木糖葡萄球菌生物被膜有良好的抑制或干预作用，对于奶牛乳房炎也具有确切的治疗效果；因此，1-羟基蒽醌能够用于制备抑制木糖葡萄球菌或木糖葡萄球生物被膜药物或者用于制备治疗奶牛乳房炎的药物。

进一步的，本发明公开了一种抑制致病菌的药物组合物，包括：预防或治疗上有效量1-羟基蒽醌的和药学上可接受的辅料或载体。

还进一步的，本发明公开了一种干预致病菌生物被膜的药物组合物，包括:预防或治疗上有效量的1-羟基蒽醌和药学上可接受的辅料或载体。

更进一步的，本发明公开了一种治疗由致病菌引起的奶牛乳房炎的药物组合物，包括:预防或治疗上有效量的1-羟基蒽醌和药学上可接受的辅料或载体。

所述的干预致病菌生物被膜包括抑制致菌生物被膜的形成或杀灭成熟的制致生物被膜内的菌。

本发明中所述的“致病菌”优选为血浆凝固酶阴性葡萄球菌，更优先为木糖葡萄球菌。

所述的载体或辅料是指药学领域常规的载体或辅料，例如：稀释剂、崩裂剂、润滑剂、赋形剂、粘合剂、助流剂、填充剂、表面活性剂等；另外，还可以在组合物中加入其它辅助剂如香味剂和甜味剂。

所述稀释剂可以是一种或几种增加片剂重量和体积的成分；常用的稀释剂包括乳糖、淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、山梨醇、甘露醇以及无机钙盐等。其中最常用为乳糖、淀粉、微晶纤维素。

所述崩解剂可以为交联聚乙烯吡咯烷酮(与总重量比为2－6％)，交联羧甲基纤维素钠(与总重量比为2－6％)、海藻酸(与总重量比为2－5％)、微晶纤维素(与总重量比为5－15％)中之一种或几种混合物。其中以交联聚乙烯吡咯烷酮(与总重量比为2－7％)，交联羧甲基纤维素钠(与总重量比为2－6％)为佳。最佳为交联聚乙烯吡咯烷酮(与总重量比为2－6％)。

所述的润滑剂包括硬脂酸，硬脂酸钠，硬脂酸镁，硬脂酸钙，聚乙二醇，滑石粉，氢化植物油中之一种或几种混合物。其中以硬脂酸镁最为适宜。润滑剂的用量范围(与总重量比)为0.10－1％，一般用量为0.25－0.75％，最佳用量为0.5－0.7％。

所述的粘合剂可以是一种或几种有利于制粒的成分。可以是淀粉浆(10－30％，与粘合剂总重量比)，羟丙基甲基纤维素(2-5％，与粘合剂总重量比)，聚乙烯吡咯烷酮(2-20％，与粘合剂总重量比)，以聚乙烯吡咯烷酮的乙醇水溶液为佳，最佳为聚乙烯吡咯烷酮的50％乙醇水溶液。

所述助流剂可以为微粉硅胶、滑石粉、三硅酸镁中之一种或几种混合物。

所述表面活性剂可以为一种或几种能够提高润湿性和增加药物溶出的成分。常用为十二烷基硫酸钠(常用范围为0.2－6％，与总重量比)。

本发明通过试验发现1-羟基蒽醌通过减弱谷氨酰胺合成酶活性导致谷氨酰胺生物合成减少，从而干预木糖葡萄球菌生物被膜的形成，因此，1-羟基蒽醌能应用于制备抑制木糖葡萄球菌或干预木糖葡萄球菌生物被膜形成的药物；此外，1-羟基蒽醌对木糖葡萄球菌引起的奶牛乳房炎也有良好的治疗效果，能应用于制备治疗奶牛乳房炎的药物，本发明为奶牛乳腺炎的治疗开辟了新的方向。

附图说明

图11/2mic1-羟基蒽醌对木糖葡萄球菌atcc700404生物被膜形成能力影响。

图21/2mic1-羟基蒽醌对木糖葡萄球菌atcc700404glna基因缺失株生物被膜形成能力影响。

图3谷氨酰胺对木糖葡萄球菌atcc700404glna基因缺失株生物被膜形成能力的影响。

图4扫描电镜观察木糖葡萄球菌atcc700404生物被膜的超微结构；a：阳性对照组；b：1/2mic1-羟基蒽醌处理组。

图5扫描电镜观察木糖葡萄球菌atcc700404glna基因缺失株生物被膜的超微结构；a：阳性对照组；b：1/2mic1-羟基蒽醌处理组。

图61/2mic1-羟基蒽醌影响glna基因缺失株及野生株谷氨酰胺合成酶活性的测定。

图71/2mic1-羟基蒽醌影响glna基因缺失株及野生株谷氨酰胺含量的测定。

图8realtimepcr对基因的定量分析。

图9谷氨酰胺合成酶与1-羟基蒽醌结合区域预测。

图10谷氨酰胺合成酶与1-羟基蒽醌结合区域预测。

图11小鼠乳腺组织中tnf-α、il-6含量测定结果。

图12小鼠乳腺组织中tnf-α、il-6含量测定结果。

图13小鼠乳腺组织中tnf-α、il-6含量测定结果。

图14各组小鼠乳腺组织治疗前、后病理组织学变化(40×，he)a：空白对照组；b野生株模型组；c野生株加药组；d敲除株模型组；e敲除株加药组。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

试验例11-羟基蒽醌抑制木糖葡萄球菌以及干预木糖葡萄球菌生物被膜的试验

1试验材料与试验方法

1.1菌株、试剂及试验动物

1-羟基蒽醌购于梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；木糖葡萄球菌atcc700404购自美国模式培养物集存库；木糖葡萄球菌atcc700404glna基因缺失株为前期实验平台所构建；胰酪胨大豆肉汤培养基(tsb)购自青岛高科园海博生物技术有限公司；谷氨酰胺合成酶活性测定试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司；谷氨酰胺含量测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；pcr等试剂购自宝生物工程有限公司；rt-pcr染料购自上海罗氏公司；酶标仪购自美国epoch公司；超声波细胞破碎仪购自宁波新芝生物科技股份有限公司；spf级昆明系雌鼠购自哈尔滨医科大学动物饲养实验室。

1.2菌种的复苏、传代

无菌条件下，将木糖葡萄球菌atcc700404，木糖葡萄球菌atcc700404glna基因缺失株复苏后接种到tsb培养基中，放入37℃恒温培养箱中培养12h，即可备用。

1.31-羟基蒽醌对木糖葡萄球菌最小抑菌浓度的测定(mic)

无菌条件下，将木糖葡萄球菌atcc700404复苏后接种到tsb培养基中，放入37℃恒温培养箱中培养12h。试验操作及结果判定则按照美国临床实验室国家标准委员会(nccls)推荐的标准微量稀释法进行判定(shawt,nixonjs,bottomleykm.metalloproteinaseinhibitors:newopportunitiesforthetreatmentofrheumatoidarthritisandosteoarthritis[j].expertopiniononinvestigationaldrugs,2000,9(7):1469-78.)。

1.4结晶紫染色测定1/2mic1-羟基蒽醌对glna基因缺失株和野生株生物被膜不同形成周期的影响

在96孔板中加入配置好的野生株和缺失株菌液各180μl，在每孔依次加入终浓度为1/2mic(0.075mg/ml)的1-羟基蒽醌20μl，设阳性对照组。37℃恒温培养箱中培养。分别在3h、6h、12h、24h取出组织培养板测定生物被膜形成能力，每个时间点重复3次。结晶紫染色法在590nm处测定吸光度，以od值反映生物被膜形成能力，确定1-羟基蒽醌对野生株和敲除株生物被膜的干预作用。

1.5谷氨酰胺对glna基因缺失株生物被膜不同形成周期的影响

在96孔板中加入配置glna基因缺失株菌液各180μl，在每孔依次加入终浓度为1mmol/l的谷氨酰胺20μl，设阳性对照组。37℃恒温培养箱中培养。分别在3h、6h、12h、24h取出组织培养板测定生物被膜形成能力，每个时间点重复3次。结晶紫染色法在590nm处测定吸光度，以od值反映生物被膜形成能力，确定谷氨酰胺对glna基因缺失株生物被膜的作用。

1.6扫描电镜观察1/2mic1-羟基蒽醌对glna基因缺失株和野生株生物被膜的影响

从稀释的野生株和缺失株菌液中分别取2ml加到6孔组织培养板内。再加入终浓度为1/2mic的1-羟基蒽醌(0.075mg/ml)，设阳性对照组，37℃下静止培养24h。用灭菌生理盐水冲洗盖玻片。于4℃冰箱中用戊二醛固定1h。用磷酸缓冲液冲洗两次，每次10min。依次用50％、70％和90％乙醇脱水一次，每次15min，然后用100％乙醇脱水二次，每次15min。

100％乙醇与叔丁醇1:1；纯叔丁醇各冲洗一次，每次15min。用冷冻干燥仪对样品进行干燥4h。样品表面在真空条件下镀一层厚150a的金属膜，扫描电子显微镜下观察生物被膜形成情况。

1.71/2mic1-羟基蒽醌对glna基因缺失株和野生株谷氨酰胺合成酶活性的影响

将木糖葡萄球菌atcc700404glna基因缺失株及野生株(木糖葡萄球菌atcc700404)接种于无菌tsb培养基中，分别加入终浓度为1/2mic的1-羟基蒽醌(0.075mg/ml)。在恒温培养箱中37℃培养到12h后，测定菌株中谷氨酰胺合成酶活性。设立野生株和缺失株阳性对照组，实验重复3次。谷氨酰胺合成酶活性的测定使用谷氨酰胺合成酶(gs)测试盒(beijingsolaibioscience&technology)进行测定，实验详细步骤参见试剂盒使用说明书。

1.81/2mic1-羟基蒽醌对glna基因缺失株和野生株谷氨酰胺含量的影响

将木糖葡萄球菌atcc700404glna基因缺失株及野生株(木糖葡萄球菌atcc700404)接种于无菌tsb培养基中，分别加入终浓度为1/2mic的1-羟基蒽醌(0.075mg/ml)。在恒温培养箱中37℃培养到12h后，测定菌株中谷氨酰胺含量。设立野生株和缺失株阳性对照组，实验重复3次。谷氨酰胺含量的测定使用谷氨酰胺测试盒(a073,nanjingjianchengbioengineeringinstitute)进行测定，实验详细步骤参见试剂盒使用说明书。

1.91/2mic1-羟基蒽醌对木糖葡萄球菌glna基因表达的影响

无菌条件下取菌液50μl，加入含有1/2mic(0.75mg/ml)1-羟基蒽醌的5ml培养基中，记好菌种和接种日期后，37℃下培养12h。设阳性对照组。

总rna的提取参照rnapreppure培养细胞或细菌总rna提取试剂盒(tiangen)，实验详细步骤参见试剂盒使用说明书。

cdna的合成参照takara公司的primescripttmrtreagentkit说明书进行。反应条件：37℃作用15min,85℃作用5s。反应体系：5×rtbuffer10μl；randomprimer(50mm)1μl；primescriptrtenzymemixi4μl；random6mers(100mm)1μl；ddh2o3μl。

以16srrna为内参来检测glna基因的表达量。运用primerexpress和prilner5.0软件设计引物。反应条件：95℃10min；95℃15s，60℃31s，40个循环。反应体系：sybr(染料)10μl；cdna1.2μl；上游引物0.6μl；下游引物0.6μl；ddh2o7.6μl。

1.10谷氨酰胺合成酶与1-羟基蒽醌的分子对接

通过uniprot获得谷氨酰胺合成酶氨基酸序列，通过网站swissmodel得到该酶的模板蛋白(pdbid：5dm3),构建出谷氨酰胺合成酶的三级结构。

根据同源建模验证获得最好的谷氨酰胺合成酶同源蛋白结构，活性区域为原模板蛋白的配体区域。首先应用autodocktool-1.56(adt)对蛋白进行删水、加氢、加电荷、定义原子类型等处理，产生立体构象，保存为pdbqt文件；准备小分子化合物(1-羟基蒽醌)，使用软件openbabe软件，将mol2格式的小分子转换成pdbqt格式，保存；通过autodockvina将受体分子和小分子化合物(1-羟基蒽醌)进行分子对接，选取分子对接结果中打分最高的一个结合模式，分析谷氨酰胺合成酶与1-羟基蒽醌的结合区域，预测谷氨酰胺合成酶与1-羟基蒽醌相互作用的氨基酸。

1.111-羟基蒽醌对乳房炎模型小鼠治疗作用的研究

1.11.1乳房炎模型制备及给药方案

分娩10天的昆明系雌鼠，全价饲料饲养，自由饮水，自然光照，室温18℃～22℃，3天适应性饲养后随机分为6组，分别为空白对照组、野生株模型组、glna缺失株模型组、野生株加药组、glna缺失株加药组，具体试验分组及试验处理见表1。术前1～2小时将幼鼠与母鼠分开，将母鼠麻醉后对其第四对乳头剃毛、消毒。左手固定第四对乳头，右手持钝头注射器，经小鼠的乳导管进入乳腺，野生株模型组和glna缺失株模型组分别注入100μl浓度为1.0×10⁹cfu/ml的木糖葡萄球菌atcc700404和木糖葡萄球菌glna缺失株；野生株加药组和glna缺失株加药组分别注入100μl浓度为1.0×10⁹cfu/ml的木糖葡萄球菌atcc700404和木糖葡萄球菌glna缺失株，并在24h后乳腺基部给药1.5mg/ml的1-羟基蒽醌100μl。

表1试验分组及试验处理

1.11.2tnf-α、il-6炎性因子的测定和病理组织学检查

tnf-α由活化的单核巨噬细胞产生，是调节炎症的一种内源性介质。il-6是一种具有多种生物学功能的细胞因子，由单核巨噬细胞或成纤维细胞等分泌，对机体免疫和炎症反应具有重要的调节作用。病毒、细菌等病原微生物入侵动物机体会诱导tnf-α、il-6的产生。因此，血清中tnf-α、il-6的浓度与机体的感染程度呈正相关，二者常作为了解炎症严重程度的重要指标。

本试验中在给药24h后脱颈处死小鼠，75％的酒精对小鼠乳腺皮肤附近进行消毒，轻轻的剪破腹部的皮肤，暴露乳腺，观察乳腺的病理变化，快速收集乳腺，乳腺的一小部分用固定液(4％的甲醛/10％福尔马林)固定24h备用，制作病理组织切片；部分乳腺称重后按每克加入灭菌生理盐水1ml后冰上研磨成匀浆，匀浆液以12000r/min离心15min取上清液，elisa检测组织匀浆上清中的肿瘤坏死因子(tnf-α)、白细胞介素6(il-6)含量，具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.12数据分析

本试验采用spss20.0软件对数据进行统计学处理与分析，数据以(x±sd)表示，采用多重比较和单因素方差分析对各组数据进行分析和比较。(p<0.05为差异性显著，p<0.01为差异性极显著)。

2试验结果

2.11-羟基蒽醌对木糖葡萄球菌最小抑菌浓度的确定(mic)

通过试验结果可以看出，1-羟基蒽醌对木糖葡萄球菌atcc700404的mic为0.15mg/ml。

2.2结晶紫染色测定1/2mic1-羟基蒽醌对glna基因缺失株和野生株生物被膜不同形成周期的影响

木糖葡萄球菌atcc700404glna基因缺失株及野生株(木糖葡萄球菌atcc700404)添加1/2mic(0.075mg/ml)1-羟基蒽醌后，通过结晶紫染色法确定生物被膜形成能力。木糖葡萄球菌atcc700404(野生株)添加1/2mic(0.075mg/ml)1-羟基蒽醌后和对照组(木糖葡萄球菌atcc700404)相比生物被膜形成能力在3h、6h、12h、24h均呈极显著性降低(p<0.05)(图1)。木糖葡萄球菌atcc700404glna基因缺失株添加1/2mic(0.075mg/ml)1-羟基蒽醌后和对照组(木糖葡萄球菌atcc700404glna基因缺失株)相比生物被膜形成能力在3h、6h、12h、24h均呈极显著性降低(p<0.05)(图2)。

2.3谷氨酰胺对glna基因缺失株生物被膜不同形成周期的影响

glna基因缺失株添加1mmol/l谷氨酰胺后和对照组(缺失株)相比生物被膜形成能力在12h、24h处呈极显著性增加(p<0.05)(图3)。

2.4扫描电镜观察1/2mic1-羟基蒽醌对glna基因缺失株和野生株生物被膜的影响

1/2mic(0.075mg/ml)1-羟基蒽醌干预木糖葡萄球菌atcc700404和木糖葡萄球菌atcc700404glna基因缺失株生物被膜后，通过扫描电子显微镜观察，结果如图4、图5所示。a图均为阳性对照组的生物被膜，b图为1/2mic(0.075mg/ml)1-羟基蒽醌处理后的生物被膜。从图4、图5的a图中可以看出菌株不仅黏附于盖玻片表面，而且其形态不同于游离菌，形成蘑菇状结构的细菌聚集体。从图4、图5的b图中可以看出，经1/2mic(0.075mg/ml)1-羟基蒽醌处理后的木糖葡萄球菌atcc700404和木糖葡萄球菌atcc700404glna基因缺失株，只有少量细菌黏附于盖玻片表面，成熟的细菌生物被膜的立体结构减少或消失。

2.51/2mic1-羟基蒽醌对glna基因缺失株和野生株谷氨酰胺合成酶活性的影响

木糖葡萄球菌atcc700404glna基因缺失株及野生株(木糖葡萄球菌atcc700404)添加1/2mic(0.075mg/ml)1-羟基蒽醌后，通过od值测定，确定木糖葡萄球菌谷氨酰胺合成酶活性(图6)。

木糖葡萄球菌atcc700404(野生株)添加1/2mic(0.075mg/ml)1-羟基蒽醌后和对照组(木糖葡萄球菌atcc700404)相比，谷氨酰胺合成酶活性呈极显著性降低(p<0.05)。木糖葡萄球菌atcc700404(野生株)和atcc700404glna基因缺失株相比，谷氨酰胺合成酶活性也呈极显著性降低(p<0.05)。木糖葡萄球菌atcc700404glna基因缺失株谷氨酰胺合成酶活性和对照组(木糖葡萄球菌atcc700404glna基因缺失株相比无显著性差异(p>0.05)。

2.61/2mic1-羟基蒽醌对glna基因缺失株和野生株谷氨酰胺含量的影响

木糖葡萄球菌atcc700404glna基因缺失株及野生株(木糖葡萄球菌atcc700404)添加1/2mic(0.075mg/ml)1-羟基蒽醌后，通过od值测定，确定木糖葡萄球菌谷氨酰胺含量(图7)。

木糖葡萄球菌atcc700404(野生株)添加1/2mic(0.075mg/ml)1-羟基蒽醌后和对照组(木糖葡萄球菌atcc700404)相比，谷氨酰胺含量呈极显著性降低(p<0.05)。木糖葡萄球菌atcc700404(野生株)和atcc700404glna基因缺失株相比，谷氨酰胺含量也呈极显著性降低(p<0.05)。木糖葡萄球菌atcc700404glna基因缺失株谷氨酰胺的含量和对照组(木糖葡萄球菌atcc700404glna基因缺失株相比无显著性差异(p>0.05)。

2.71/2mic1-羟基蒽醌对木糖葡萄球菌glna基因表达的影响

在1/2mic(0.195μg/ml)1-羟基蒽醌的作用下，木糖葡萄球菌中谷氨酰胺合成酶(glna)表达量极显著性下降(p<0.05)，试验结果如图8所示。

2.8谷氨酰胺合成酶与1-羟基蒽醌的分子对接

通过autodockvina将受体分子和小分子化合物(1-羟基蒽醌)进行分子对接，谷氨酰胺合成酶和1-羟基蒽醌的亲和力affinity：-5.6kcal/mol。

如图9所示，红色球状区域是谷氨酰胺合成酶催化活性中心，1-羟基蒽醌与谷氨酰胺合成酶结合区域同红色球状区域重合，证明1-羟基蒽醌与谷氨酰胺合成酶能够直接结合。如图10所示，350位的缬氨酸(val)，357位的精氨酸(arg)，208位的组氨酸(glu)，148位的丙氨酸(ala)，271位的组氨酸(his)为主要结合位点，上述结合位点位于谷氨酰胺合成酶活性中心，这些结果显示1-羟基蒽醌能够与谷氨酰胺合成酶直接结合减弱其活性。

2.9tnf-α、il-6炎性因子的测定

测定结果如图11所示，野生株模型组和glna缺失株模型组的乳腺tnf-α和il-6含量均显著高于空白对照组，表明乳腺炎模型制备成功；根据图12所示可见，1-羟基蒽醌治疗后，野生株加药组、glna缺失株加药组的乳腺tnf-α和il-6含量均显著下降；根据图13所示可见，glna缺失株模型组同野生株模型组相比，乳腺tnf-α和il-6含量显著下降，而glna缺失株加药组同野生株加药组相比，乳腺tnf-α和il-6含量无显著变化。以上结果表明1-羟基蒽醌对小鼠乳房炎模型中炎性因子的产生有很好的治疗效果，敲除细菌中谷氨酰胺合成酶后可以显著降低炎性因子的产生，但谷氨酰胺合成酶可能不是药物作用于细菌的唯一靶点。

2.10病理组织学检查

乳腺病理组织学变化见图14。a为空白对照组小鼠乳腺组织切片观察结果：乳腺组织上皮细胞排列整齐，无炎性细胞浸润，乳腺腺泡内有乳汁充盈，未见病理变化。b、c分别为木糖葡萄球菌攻毒后小鼠治疗前、后乳腺组织病理学变化：治疗前乳腺上皮有部分崩解、脱落，但可以看到乳腺腺泡的轮廓，乳腺间质和腺泡腔中可看到炎性细胞浸润，治疗后有所好转，腺泡内少见分泌物、乳腺间质增生但腺泡形态和乳腺腺泡壁有不同程度的修复和再生。d、e分别为木糖葡萄球菌glna缺失株攻毒后小鼠治疗前、后乳腺组织病理学变化：治疗前腺泡中有脱落的细胞，腺泡腔内和间质中有炎细胞和中性粒细胞浸润，治疗后有所好转，腺泡形态和乳腺腺泡壁清晰可见。

综合上述试验结果可见，1-羟基蒽醌通过减弱谷氨酰胺合成酶活性，导致谷氨酰胺生物合成减少，从而干预生物被膜的形成。此外，1-羟基蒽醌对木糖葡萄球菌引起的小鼠乳房炎有良好的治疗效果。