线粒体靶向纳米辐射防护药物的制备方法与流程

本发明属于医药技术领域，具体涉及一类具有线粒体靶向性的纳米辐射防护药物的制备方法。

背景技术

电离辐射作用于机体，辐射能量被生物组织吸收，能显著引起机体分子激发和电离、产生大量自由基、生物大分子发生变性等一系列病理和生理改变，导致严重的机体损伤，甚至死亡。对于电离辐射的防护，主要措施有物理防护和药物防护。因此，寻找有效的辐射防护药物以应对核辐射突发事件及医疗事故中的放射损伤十分重要。氨磷汀是目前唯一经美国fda批准上市的抗辐射药物，但是其发挥疗效所需剂量接近于毒性剂量，严重限制了其推广使用。

近年来，随着辐射生物效应研究的不断深入，人们逐渐发现电离辐射会直接造成线粒体受到严重损伤。当细胞受到电离辐射时，线粒体是自由基产生的主要部位，产生大量不同种类的有害自由基，如超氧阴离子自由基、羟基自由基、onoo^-等。研究表明，大量不同种类的自由基使线粒体处于持续的氧化应激状态，造成线粒体功能失调，细胞凋亡，组织损伤。

目前，针对线粒体氧化损伤的靶向抗氧化剂的研究已取得了一定进展。线粒体靶向基团包括亲脂性三苯基膦阳离子（tpp）、穿膜肽等。tpp是目前应用最为广泛的小分子线粒体靶向基团，人们在三苯基膦阳离子上键合各种具有抗氧化能力的基团如维生素e、依布硒、硫辛酸、辅酶q10等连接实现线粒体传递。但是线粒体靶向抗氧化剂不同程度存在着较高的用药浓度、较短的半衰期、较低的溶解度、较大的毒副作用等问题。

本发明针对辐射后细胞线粒体产生大量有害自由基，提供了一类制备线粒体靶向咪唑类氮氧自由基纳米体系的制备方法，以提高其在体内的循环时间，降低药物分子的毒性，从而获得理想的辐射防护纳米药物，具有重要的实用价值和应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一类含有可高效清除有害自由基的“氮氧自由基”结构单元和具有线粒体靶向功能的三苯基膦阳离子tpp键合的新型纳米辐射防护剂结构。

本发明的优点与积极效果：

虽然tpp-咪唑氮氧自由基具有一定的辐射防护作用，但是作为防辐射药物还存在以下几个问题：在小鼠体内代谢时间较短；口服给药，在胃酸环境下，氮氧自由基结构不稳定，易开环；水溶性较差。近几年来的生物材料及纳米粒子载体得到广泛发展，包载的药物种类也越来越广泛，如抗肿瘤药物、抗氧化剂、mirna等均可通过纳米粒子载体系统靶向运输到靶组织。理想的纳米粒子载体系统应该有以下几点特征：良好的血液循环性，粒径较小，最好小于100nm，良好的生物相容性及生物代谢性，较低的毒副作用。本发明根据辐射损伤的生物学特征，即辐射后胞内及线粒体中ros急剧升高，将tpp-咪唑氮氧自由基制备成纳米给药体系，以克服该类化合物在辐射防护中存在的问题。

本发明的纳米药物中包载的药物分子化学结构如下：

代表结构如下：

附图说明：

图1为氮氧自由基1的标准曲线。

图2为氮氧自由基1不同投药量的分析色谱图，a：1号样品；b：2号样品；c：3号样品；d：4号样品。

图3为tpp-氮氧自由基1的标准曲线。

图4为tpp-氮氧自由基1不同投药量的分析色谱图，a：1号样品；b：2号样品；c：3号样品；d：4号样。

具体实施方式

实施例1：氮氧自由基1纳米药物的制备

（1）油相的制备

取四支离心管并标号，按表1的配比，向管内添加各种相应试剂，并向每支离心管添加3ml甲醇与丙酮的混合溶液（甲醇：丙酮=1：9），完全溶解后即得油相。

（2）水相的制备

分别称取myrj520.5g，hs150.5mg溶于50ml超纯水，完全溶解后即得水相。

（3）载药纳米粒的制备

以1号管为例（其他各管方法相同）：量取12ml水相于圆底烧瓶，在搅拌条件下逐滴加入3ml油相，而后加入3ml水相，停止搅拌，超声2min后，在旋转蒸发仪中除去甲醇和丙酮即得包载氮氧自由基1纳米粒。

实施例2：高效液相色谱法测定氮氧自由基1纳米药物的包封率及载药量

（1）氮氧自由基1标准溶液的配制

精密称取氮氧自由基1纯品0.0250g，置于小烧杯中，加入乙腈和水混合溶液（乙腈：水=1：1）完全溶解，转移至25.00ml容量瓶中定容至刻度，摇匀，即得1mg/ml氮氧自由基1母液。将母液用乙腈：水=1：1稀释至0.01、0.05、0.1、0.167、0.2、和0.25mg/ml的氮氧自由基1工作溶液。

（2）色谱条件

色谱柱：agilentc18不锈钢分析色谱（250mm×4.6mm，5μm）；

流动相：乙腈：水（45：55）；

流量：1ml/min；

检测波长：254nm；

进样量：10μl。

（3）线性和范围

取氮氧自由基1的系列工作溶液进样分析，记录色谱图峰面积（表2），以待测物峰面积(y)对样品浓度(x)作回归计算（图1），得回归方程：y=18239x-19.566（r²=0.9996）

（4）氮氧自由基1纳米粒包封率及载药量的计算

图2是不同投药量样品的分析色谱图，记录游离氮氧自由基1的色谱峰面积，将待测物峰面积（y）代入氮氧自由基1的标准曲线求得游离氮氧自由基1浓度cf，并计算包封率及载药量（表4）。

cf为游离样品的量；ct为纳米粒悬液中样品的总量；ee为包封率；dl为载药量

实施例3：包载氮氧自由基1纳米药物的结构表征

由表5可知，投药量对载药纳米粒的粒径大小和聚合物分散性指数（pdi）变化影响较小，当投药量在2mg和3mg时zeta电位最高，可有效避免纳米粒发生聚集，维持纳米粒的稳定性。投药量在2mg时，纳米粒包封率达到最高，当投药量在4mg时载药量达到最高，综合考虑后，我们认为投药量在2mg时的纳米粒较为理想。

实施例4：tpp-氮氧自由基1纳米药物的制备

（1）油相的制备

取四支离心管并标号，按表6的配比，向管内添加各种相应试剂，并向每支离心管添加3ml甲醇与丙酮的混合溶液（甲醇：丙酮=1：9），完全溶解后即得油相。

（2）水相的制备

分别称取myrj520.5g，hs150.5mg溶于50ml超纯水，完全溶解后即得水相。

（3）载药纳米粒的制备

以1号管为例（其他各管方法相同）：量取12ml水相于圆底烧瓶，在搅拌条件下逐滴加入3ml油相，而后加入3ml水相，停止搅拌，超声2min后，旋转蒸发仪除去甲醇丙酮即得tpp-氮氧自由基1纳米粒。

实施例5：高效液相色谱法测定tpp-氮氧自由基1纳米药物的包封率及载药量

（1）tpp-氮氧自由基1标准溶液配制

tpp-氮氧自由基1标准溶液的配制：精密称取tpp-氮氧自由基1标准品0.0250g，置于25.00ml容量瓶中，加入乙腈水溶液（乙腈：水=1:1）溶解并定容至刻度，摇匀，即得1mg/mltpp-氮氧自由基1母液。稀释母液配制成浓度为稀释至0.01、0.05、0.1、0.167、0.2、和0.25mg/ml的tpp-氮氧自由基1工作溶液。

（2）色谱条件

色谱柱：agilentc18不锈钢分析色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；

流动相：90%乙腈水溶液：水（75:25）；

流量：1ml/min；

检测器：220nm；

进样量：10μl

（3）线性和范围

取系列工作溶液进样分析，记录色谱图峰面积（表7），以待测物峰面积(y)对样品浓度(x)作回归计算（图3）得回归方程：y=6886.4x+14.3（r²=0.9992）

（6）tpp-氮氧自由基1纳米粒包封率及载药量的计算

图4是不同投药量样品的分析色谱图，记录游离tpp-氮氧自由基1的色谱峰面积，将待测物峰面积（y）代入tpp-氮氧自由基1的标准曲线求得游离tpp-氮氧自由基1浓度cf，并计算包封率及载药量（表8）。

cf为游离样品的量；ct为纳米粒悬液中样品的总量；en为包封率；dl为载药量

实施例6：包载tpp-氮氧自由基1纳米药物的结构表征

由表9可知，当投药量在1mg时，纳米粒粒径为248.5nm，pdi变化较小，zeta电位-6.80mv，可有效避免纳米粒发生聚集，维持纳米粒的稳定性，