本发明涉及一种包括r-氟西汀、r-氟西汀盐型和/或外消旋氟西汀盐型的药物组合物、用途及使用其的治疗方法。
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：人的皮肤主要分为表皮、真皮和皮下组织三层。表皮由外胚层分化而来，它的细胞成分主要有角朊细胞(约占表皮细胞的80％-90％)、非角朊细胞(又称树枝状细胞，主要为黑素细胞。约占表皮细胞的2％-3％)、朗格汉斯细胞及merkel细胞。这些细胞在表皮的发育阶段、生理活动过程中相互作用，以使表皮形成最佳的平衡状态。在正常的情况下，真皮并无黑素细胞，也不见游离的黑素体，在胚胎2-4周时真皮内虽然可查见黑素细胞，但随着皮肤的分化、发育，真皮内的黑素细胞逐渐减少，最终完全消失。人体几乎所有的组织内均可找到黑素细胞，但以表皮基底层、各种粘膜上皮、毛囊、血管周、内耳、软脑膜、周围神经和交感神经链、眼的视网膜色素上皮和脉络膜为最多。在表皮基底层的黑素细胞总数为20亿，表皮中的黑素细胞是决定皮肤颜色及抵御紫外照射的关键元件。黑素细胞中通过存在于其特异的细胞器黑素小体生物合成的黑色素决定皮肤颜色及调控紫外照射损伤。因此，当表皮黑素细胞损伤或者其合成黑色素的功能失调时皮肤会出现色素脱失或其他疾病，如遗传疾病白化症、黑色素细胞瘤(melanoma)。色素脱失性皮肤病是一种以皮肤局部色素脱失为主要临床病症的常见皮肤病，如白癜风、白色糠疹、贫血痣等，其中以白癜风最为常见。白癜风是一种以皮肤出现局部或泛发性色素脱失斑为临床特征的色素脱失性皮肤病，任何时期都可发病，常发于儿童和青少年时期且发病有越来越增高的趋势。白癜风的全球发病率约为0.5-2％左右，美国和欧洲的发病率约0.1％-1％，中国白癜风的发病率为0.1％-2％左右，由于中国人口基数大，实际患病人数约1200万左右。目前对于白癜风的发病机制仍然不明确，一直存在自身免疫学说、神经内分泌免疫，黑素细胞自身破坏学说和神经化学因子等假说。许多学者比较认同白癜风是一种多因素引起的系统性疾病，病因涉及神经-内分泌-免疫系统等多个方面，提示精神心理因素与白癜风的发生发展存在相互作用。临床上治疗白癜风的药物常用糖皮质激素及免疫抑制剂类药物，但副作用大易复发。氟西汀(fluoxetine)，化学名为n-甲基-γ-[4-(三氟甲基)苯氧基]苯基丙胺，临床用的是氟西汀的盐酸盐，商品名为百忧解由美国礼来公司开发，1987年在美首次上市，先后在英、法、德、日等国家应用，1996年在我国注册(x960445)。其分子式为c17h18f3no·hcl，分子量为345.79，盐酸盐为白色结晶，熔点为179-182℃(分解)。中国专利zl201110403173.4中公开了外消旋的氟西汀治疗色素脱色疾病的用途，主要描述的是氟西汀可以促进b16f10细胞及正常人皮肤色素细胞的黑素合成，促进黑素合成相关蛋白表达的上调。同时，氟西汀口服给药可以促进c5bl/6小鼠黑素合成的皮肤色素合成相关蛋白的表达。氟西汀的结构式如下，其具有一个手性碳原子，因此具有r-,s+两种构型，含手性原子的化学药物的对映体在人体内的药理活性、代谢过程及毒性可能存在显著的差异。公开于该
背景技术：
：部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种包括r-氟西汀、r-氟西汀盐型和/或外消旋氟西汀盐型的药物组合物、用途及使用其的治疗方法。r-氟西汀可以剂量依赖性的促进黑素合成，并且能剂量依赖性的促进黑素合成关键酶酪氨酸酶和关键转录因子mitf的表达，因此可以用于治疗或缓解黑素合成减少引起的疾病。同时，申请人发现了r-氟西汀是氟西汀发挥促进黑素合成作用的关键成分，s-氟西汀并不具有该作用，因此使用r-氟西汀替代外消旋的氟西汀作为药物，使得患者服药量更少，减少发生不良副作用的几率。本发明的技术方案如下：一种治疗或缓解黑素合成减少引起的疾病的药物组合物，包括选自r-氟西汀、r-氟西汀的药学上可接受的盐型和外消旋氟西汀的药学上可接受的盐型中的至少一种，还包括药学上可接受的辅料。上述药物组合物在另一种实施方式中，黑素合成减少引起的疾病包括色素脱失性皮肤病。上述药物组合物在另一种实施方式中，所述色素脱失性皮肤病包括白癜风、白色糠疹、贫血痣或白化病。上述药物组合物在另一种实施方式中，所述r-氟西汀的药学上可接受的盐型或所述外消旋氟西汀的药学上可接受的盐型包括盐酸盐，硫酸盐，磷酸盐，氢溴酸盐，氢碘酸盐，甲磺酸盐，苯磺酸盐，马来酸盐，柠檬酸盐，酒石酸盐，醋酸盐，硝酸盐，乳酸盐，富马酸盐和双羟萘酸盐中的至少一种。上述药物组合物在另一种实施方式中，所述药学上可接受的辅料包括以下材料的至少一种：防腐剂，如：苯甲酸、山梨酸、乙醇、尼泊金类、苯甲醇和苯乙醇等；乳化剂或表面活性剂，如：聚山梨酯、泊洛沙姆、失水山梨醇单月桂酸酯、聚氧乙烯月桂醇醚、乳化剂op(壬烷基酚聚氧乙烯醚缩合物)、乳百灵a(聚氧乙烯脂肪醇醚)、西士马哥-1000(聚氧乙烯与鲸蜡醇加成物)、普流罗尼(聚氧乙烯聚丙二醇缩合物)、单油酸甘油酯及单硬脂酸甘油酯，软皂(钾肥皂)、硬皂(钠肥皂)、单硬脂酸铝、硬脂酸钙、油酸三乙醇胺、月桂醇硫酸钠、鲸硬醇硫酸钠、硫酸化蓖麻油和丁二酸二辛酯磺酸钠等；高分子化合物，如：阿拉伯胶、西黄蓍胶、明胶、虫胶、海藻酸钠、羊毛脂、琼脂、胆固醇、卵磷脂、蜂蜡、凡士林、鲸蜡醇、硬脂醇、鲸蜡、石蜡、单/双硬脂酸甘油酯、硬脂酸、十六/十八醇等；ph调节剂，如：盐酸、氢氧化钠、三乙醇胺、醋酸、醋酸钠、枸橼酸、枸橼酸钠、乳酸、酒石酸、酒石酸钠、硫酸、磷酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、碳酸钠和氢氧化钾等；金属离子络合剂，如：依地酸二钠和依地酸钙钠等；渗透促进剂，如：二甲亚砜及其类似物、氮酮类化合物、吡咯酮衍生物、醇类化合物及脂肪酸类化合物等；抛射剂，如：氯氟烷烃、氢氟烷烃、碳氢化合物和压缩气体；溶剂，如水或非水溶剂，所述非水溶剂为丙二醇、聚乙二醇、二甲基乙酰胺、苯甲醇、乙醇和甘油等；液体油脂类，如：植物油、麻油、茶油、花生油、玉米油、橄榄油、棉籽油、豆油、蓖麻油、油酸乙酯和苯甲酸苄酯等。上述药物组合物在另一种实施方式中，每100g所述药物组合物中有效成分的含量为0.01-5g，优选含量为0.01-2g，进一步优选含量为0.01-1g。所述有效成分为r-氟西汀、r-氟西汀的药学上可接受的盐型和外消旋氟西汀的药学上可接受的盐型中的至少一种。上述药物组合物在另一种实施方式中，所述药物组合物以口服、静脉注射、皮下注射或者经皮给药的方式施用。上述药物组合物在另一种实施方式中，所述药物组合物为内服制剂、注射制剂或者外用制剂。上述药物组合物在另一种实施方式中，所述药物组合物为乳膏剂，软膏剂，凝胶剂，气雾剂，喷雾剂，粉雾剂，溶液剂，芳香水剂，酊剂，醑剂，甘油剂，溶胶剂，混悬剂，乳剂，搽剂，涂膜剂，糊剂，洗剂或其他外用制剂。一种治疗或缓解黑素合成减少引起的疾病的方法，包括以下步骤：向患有黑素合成减少引起的疾病的主体施用有效剂量的r-氟西汀、r-氟西汀的药学上可接受的盐型和外消旋氟西汀的药学上可接受的盐型中的至少一种。上述方法在另一种实施方式中，黑素合成减少引起的疾病包括色素脱失性皮肤病。上述方法在另一种实施方式中，所述色素脱失性皮肤病包括白癜风、白色糠疹、贫血痣或白化病。上述方法在另一种实施方式中，所述r-氟西汀的药学上可接受的盐型或所述外消旋氟西汀的药学上可接受的盐型包括盐酸盐，硫酸盐，磷酸盐，氢溴酸盐，氢碘酸盐，甲磺酸盐，苯磺酸盐，马来酸盐，柠檬酸盐，酒石酸盐，醋酸盐，硝酸盐，乳酸盐，富马酸盐和双羟萘酸盐中的至少一种。上述方法在另一种实施方式中，r-氟西汀、r-氟西汀的药学上可接受的盐型和外消旋氟西汀的药学上可接受的盐型中的至少一种作为有效成分以经皮给药的方式进行施用。上述方法在另一种实施方式中，所述r-氟西汀、r-氟西汀的药学上可接受的盐型和外消旋氟西汀的药学上可接受的盐型被制备为乳膏剂，软膏剂，凝胶剂，气雾剂，喷雾剂，粉雾剂，溶液剂，芳香水剂，酊剂，醑剂，甘油剂，溶胶剂，混悬剂，乳剂，搽剂，涂膜剂，糊剂，洗剂或其他外用制剂进行使用。上述方法在另一种实施方式中，所述主体为哺乳动物，优选为人、灵长类动物或鼠。上述方法在另一种实施方式中，所述有效剂量为0.26mg/(kg·d)-26mg/(kg·d)。一种r-氟西汀、r-氟西汀的药学上可接受的盐型和/或外消旋氟西汀的药学上可接受的盐型在制备用于治疗或缓解黑素合成减少引起的疾病的药物中的应用。上述应用在另一种实施方式中，黑素合成减少引起的疾病包括色素脱失性皮肤病。上述应用在另一种实施方式中，所述色素脱失性皮肤病包括白癜风、白色糠疹、贫血痣或白化病。上述应用在另一种实施方式中，所述r-氟西汀的药学上可接受的盐型或所述外消旋氟西汀的药学上可接受的盐型包括盐酸盐，硫酸盐，磷酸盐，氢溴酸盐，氢碘酸盐，甲磺酸盐，苯磺酸盐，马来酸盐，柠檬酸盐，酒石酸盐，醋酸盐，硝酸盐，乳酸盐，富马酸盐和双羟萘酸盐中的至少一种。上述应用在另一种实施方式中，所述药物以口服、静脉注射、皮下注射或者经皮给药的方式施用。上述应用在另一种实施方式中，所述药物为内服制剂、注射制剂或者外用制剂。上述应用在另一种实施方式中，所述药物包括有效成分和药学上可接受的辅料，所述有效成分为r-氟西汀、r-氟西汀的药学上可接受的盐型和外消旋氟西汀的药学上可接受的盐型中的至少一种，且所述有效成分在所述药物中的质量百分比为0.01％-5％，优选质量百分比为0.01-2％，进一步优选质量百分比为0.01％-1％。上述应用在另一种实施方式中，所述药学上可接受的辅料包括以下材料中的至少一种：防腐剂，表面活性剂，高分子化合物，ph调节剂，金属离子络合剂，抛射剂，溶剂，液体油脂类。上述应用在另一种实施方式中，所述r-氟西汀、r-氟西汀的药学上可接受的盐型和外消旋氟西汀的药学上可接受的盐型作为有效成分以经皮给药的方式进行施用。上述应用在另一种实施方式中，所述经皮给药的方式包括tdds经皮吸收制剂、贴片、离子导入技术、离子导入贴片、电致孔导入技术、超声导入技术、超声波促渗技术、激光技术、微针技术和无针注射系统等。上述应用在另一种实施方式中，所述r-氟西汀、r-氟西汀的药学上可接受的盐型和外消旋氟西汀的药学上可接受的盐型被制备为乳膏剂，软膏剂，凝胶剂，气雾剂，喷雾剂，粉雾剂，溶液剂，芳香水剂，酊剂，醑剂，甘油剂，溶胶剂，混悬剂，乳剂，搽剂，涂膜剂，糊剂，洗剂或其他外用制剂进行使用。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：r-氟西汀可以剂量依赖性的促进黑素合成，并且能剂量依赖性的促进黑素合成关键酶酪氨酸酶和关键转录因子mitf的表达，因此可以用于治疗或缓解黑素合成减少引起的疾病。同时，申请人发现了r-氟西汀是氟西汀发挥促进黑素合成作用的关键成分，而s-氟西汀则不具有该作用，因此使用r-氟西汀替代外消旋的氟西汀作为药物，使得患者服药量更少，减少发生不良副作用的几率。附图说明图1是实施例1中1.1部分r-氟西汀组或s-氟西汀组的斑马鱼给药过程的示意图。图2是实施例1中1.1部分外消旋氟西汀、不同浓度r-氟西汀和s-氟西汀对斑马鱼黑素细胞形态的影响对比图。图3是实施例1中1.2部分外消旋氟西汀、不同浓度r-氟西汀和s-氟西汀对斑马鱼黑素细胞黑素含量的影响对比图。图4是实施例1中1.3部分外消旋氟西汀、不同浓度r-氟西汀和s-氟西汀对斑马鱼酪氨酸酶活性的影响对比图。图5是实施例1中1.4部分r-氟西汀和s-氟西汀对tyrp1a:egfp斑马鱼绿色荧光蛋白表达情况的影响对比图。图6是实施例2中2.1部分不同浓度r-氟西汀和s-氟西汀对b16f10黑素瘤细胞活力的影响对照图。图7是实施例2中2.2部分不同浓度r-氟西汀和s-氟西汀对b16f10黑素瘤细胞黑素含量的影响对比图。图8是实施例2中2.3部分不同浓度r-氟西汀和s-氟西汀对b16f10黑素瘤细胞酪氨酸酶活性的影响对比图。图9是实施例2中2.4部分不同浓度r-氟西汀和s-氟西汀对b16f10细胞黑素合成关键蛋白tyr和mitf的表达影响对比图。图10是实施例4中4.3部分氟西汀乳膏对cums模型c57bl/6小鼠背部皮肤颜色的影响效果图。图11是实施例4中4.4部分氟西汀乳膏对cums模型c57bl/6小鼠背部皮肤毛囊h&e染色的影响效果图。图12是实施例4中4.5部分氟西汀乳膏对cums模型c57bl/6小鼠背部皮肤tyr，trp-1和trp-2表达的影响对比图。图13是实施例4中4.6部分氟西汀乳膏对cums模型c57bl/6小鼠背部皮肤mitf表达的影响对比图。图14是实施例4中4.7部分氟西汀乳膏对氢醌模型c57bl/6小鼠背部皮肤黑素合成的影响对比图。图15是实施例4中4.8部分r-氟西汀乳膏对氢醌模型c57bl/6小鼠背部皮肤黑素合成的影响对比图。图16是实施例4中4.9部分r-氟西汀乳膏对cums模型c57bl/6小鼠背部皮肤颜色的影响效果图。图3、图4、图6、图7、图8和图9中的数值，都是以空白对照组的数值为基准值进行比值计算的，即空白对照组的数值计为100，那么其他组别中的数值120则表示该数值是空白对照组绝对数值的120％，以此类推。具体实施方式下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。以下实施例中如无特殊说明，r-氟西汀均使用的是r-氟西汀盐酸盐，s-氟西汀均使用的是s-氟西汀盐酸盐，外消旋氟西汀均使用的是外消旋氟西汀盐酸盐。如无特殊说明，以下实施例或其附图中出现的flu是外消旋氟西汀的简写，r-flu是r-氟西汀的简写，s-flu是s-氟西汀的简写。如无特殊强调，出现的氟西汀及其盐型即为外消旋的氟西汀及其盐型。实施例11.1r-氟西汀和s-氟西汀对斑马鱼黑素细胞形态的影响试验目的：分别选择1μm，10μm，100μm的r-氟西汀、s-氟西汀以及外消旋氟西汀研究其对斑马鱼黑素细胞形态的影响(如无特殊说明，实施例1-3中的氟西汀浓度均指的是反应体系中的终浓度)。试验方法：分为wt组、ptu60h组、ptu35h组、α-msh组、s-氟西汀组、r-氟西汀组及外消旋氟西汀对照组。wt组在野生型斑马鱼胚胎受精后自然发育60h时，拍摄不同角度的照片；ptu60h组是在斑马鱼胚胎受精后发育6h时加入0.2mmptu(1-phenyl-2-thiourea，即1-苯基-2-硫脲，ptu是一种可逆的酪氨酸酶抑制剂，能有效抑制酪氨酸酶活性从而抑制黑色素的合成)并保持至胚胎发育共60h时，拍摄不同角度的照片；ptu35h组是阴性对照组，其是在斑马鱼胚胎受精后发育6h时加入0.2mmptu并保持至胚胎发育共35小时洗去ptu、之后不加入s-氟西汀或r-氟西汀保持至胚胎发育共60h时，拍摄不同角度的照片；α-msh是阳性对照组，其是在斑马鱼胚胎受精后发育6h时加入0.2mmptu并保持至胚胎发育共35小时洗去ptu、之后加入100μg/ml的α-msh保持至胚胎发育共60h。s-氟西汀组是在斑马鱼胚胎受精后发育6h时加入0.2mmptu后保持至胚胎发育共35小时洗去ptu、之后加入不同浓度s-氟西汀保持至胚胎发育共60h时，拍摄不同角度的照片；r-氟西汀组是在斑马鱼胚胎受精后发育6h时加入0.2mmptu后保持至胚胎发育共35小时洗去ptu、之后加入不同浓度r-氟西汀保持至胚胎发育共60h时，拍摄不同角度的照片；外消旋氟西汀对照组是在斑马鱼胚胎受精后发育6h时加入0.2mmptu后保持至胚胎发育共35小时洗去ptu、之后加入200μm外消旋氟西汀保持至胚胎发育共60h时，拍摄不同角度的照片。实验流程如图1所示。试验结果：如图2所示，ptu60h组的斑马鱼黑素细胞黑素合成完全被抑制；ptu35h组是在胚胎发育35小时洗去ptu后不加r-氟西汀或s-氟西汀；与ptu35h组相比r-氟西汀可以促进斑马鱼的黑素合成作用，并且具有剂量依耐性，特别是眼部的黑素合成作用，从图2中可以看出随着加入r-氟西汀的剂量由1μm增加到100μm，斑马鱼眼部的黑素增多；而s-氟西汀对斑马鱼黑素合成没有显著作用，100μm浓度下r-氟西汀对斑马鱼眼部的黑素增加比200μm外消旋氟西汀的效果更明显。1.2r-氟西汀和s-氟西汀对斑马鱼黑素含量的影响试验目的：1.1的结果表明r-氟西汀可以促进斑马鱼黑素合成，特别是眼部的黑素合成，并显示出比外消旋氟西汀更好的效果。进一步研究r-氟西汀、s-氟西汀和外消旋氟西汀对斑马鱼黑素合成的影响。试验方法：继续使用1.1部分的wt组、ptu60h组、ptu35h组、α-msh组、s-氟西汀组、r-氟西汀组和外消旋氟西汀组的给药方式。使用naoh裂解法对斑马鱼黑素进行定量分析，将实施例1中1.1部分所得wt组、ptu60h组、ptu35h组、α-msh组、s-氟西汀组、r-氟西汀组和外消旋氟西汀组的细胞用pbs洗2遍，收集细胞，加入300μl非变性细胞裂解液(含1nmpmsf，1nm的苯甲基磺酰氟)，4℃裂解20min；再于4℃，12000r/min离心10min，取上清用于蛋白定量(bca法)，计算总蛋白含量；下层黑色素沉淀加入200μlnaoh(含10％dmso)，置于80℃水浴中裂解2小时；用黑素标准品绘制标准黑素含量曲线；将溶解完全的黑素以180μl/孔加入96孔板中，405nm处用分光仪测定吸光度值，计算每毫克蛋白的黑素含量。所有实验重复3次，所有数据进行了单向方差分析(anova)，之后还进行了hocturkey测试，与ptu35h组相比，*表示p<0.05，**表示p<0.01。试验结果：如图3所示，与ptu35h组(阴性对照组)相比，r-氟西汀能剂量依赖性的促进斑马鱼黑素合成作用并比外消旋氟西汀的作用更强，s-氟西汀对斑马鱼黑素合成没有显著影响。1.3r-氟西汀和s-氟西汀对斑马鱼黑素细胞酪氨酸酶活性的影响试验目的：进一步研究r-氟西汀和s-氟西汀对斑马鱼黑素合成的分子机制。试验方法：继续使用1.1部分的wt组、ptu60h组、ptu35h组、α-msh组、s-氟西汀组、r-氟西汀组和外消旋氟西汀组的给药方式。使用l-dopa法来测量斑马鱼酪氨酸酶活性，l-dopa氧化法测定酪氨酸酶活性的方法如下：将胚胎发育60h的各组细胞用pbs洗2遍，收集细胞于doff管中，每管加入100μl非变性裂解液(含1nmpmsf)，4℃裂解20min，再于4℃，12000r/min离心10min，取上清用于蛋白定量(bca法)，计算蛋白浓度；取含10μg蛋白体积加入96孔板，用pbs(0.1m，ph6.8)定量至100μl，再加入0.01％l-dopa100μl，每一浓度设定3个复孔，37℃避光孵育60min，波长475nm处测定od值。所有实验重复3次，所有数据进行了单向方差分析(anova)，之后还进行了hocturkey测试，与ptu35h组相比，*p<0.05，**p<0.01。试验结果：图4结果表明，与ptu35h组(阴性对照组)相比，r-氟西汀能剂量依赖的促进斑马酪氨酸酶活性作用并显示比外消旋氟西汀更好的促酪氨酸酶活性能力，s-氟西汀对斑马鱼酪氨酸酶活性没有显著影响。1.4r-氟西汀和s-氟西汀对tyrp1a:egfp斑马鱼绿色荧光蛋白的影响试验目的：1.1-1.3的结果表明r-氟西汀能剂量依赖性的促进斑马鱼黑素合成作用，s-氟西汀对斑马鱼黑素合成没有显著影响。进一步使用tyrp1a:egfp斑马鱼模型来研究r-氟西汀和s-氟西汀的作用。试验方法：继续使用1.1部分的ptu35h组、s-氟西汀组和r-氟西汀组的给药方式，其中将ptu35h组作为阴性对照组(即图5中的control组)。tyrp1a:egfp模型斑马鱼为特异性荧光标记tyrp1a基因的斑马鱼，在药物干预过程中促进黑色素合成的过程中tyrp1a基因表达上调，在体视镜下观察到绿色荧光强度增强。试验结果：如图5所示，与对照组相比r-氟西汀能够增强转基因斑马鱼绿色荧光蛋白表达，而s-氟西汀没有作用。这也与我们在野生型斑马鱼中结果相一致。实施例2：2.1r-氟西汀和s-氟西汀对b16f10黑素瘤细胞活力的影响试验目的：为了研究r-氟西汀、s-氟西汀对黑素合成的作用，我们首先使用mtt方法检测不同浓度r-氟西汀和s-氟西汀对b16f10黑素瘤细胞活力的影响。试验方法：取处于指数生长期状态良好的b16f10细胞，消化、计数，用含10％胎牛血清的高糖dmem培养液重悬细胞，将细胞接种于96孔培养板中，接种密度为2.2×104个/ml，接种量为180μl/孔，置37℃，5％co2培养箱中培养24小时；加入不同浓度的r-氟西汀(r-氟西汀给药组)或s-氟西汀(s-氟西汀给药组)或等体积水(空白对照组)，20μl/孔，培养48小时；每孔加入20μlmtt，37℃培养箱中反应4小时；吸除上清液，每孔加入150μldmso，平板摇床上振摇10分钟；用微孔板测读仪在波长为570nm处测定每孔的吸光值，按所测吸光值占空白对照组吸光值的百分比作为细胞活力。试验结果：mtt结果如图6所示，与空白对照组相比，r-氟西汀和s-氟西汀给药组对b16f10细胞活力没有显著性影响(p>0.05)。2.2r-氟西汀和s-氟西汀对b16f10黑素瘤细胞黑素含量的影响试验方法：取处于指数生长期状态良好的b16f10小鼠黑素瘤细胞，消化，计数，将细胞接种于直径10cm培养皿中，接种量为3×105个/皿，置37℃，5％co2培养箱中培养24小时；将培养基换为含2.5％胎牛血清的高糖dmem培养基后设置r-氟西汀组、s-氟西汀组、α-msh阳性对照组和空白对照组，分别加入不同浓度的r-氟西汀、不同浓度的s-氟西汀、50μm的α-msh和同体积的高糖dmem培养基并培养48小时；各组用pbs洗2遍，收集细胞，加入300ul非变性裂解液(含1nmpmsf)，4℃裂解20min；4℃，12000r/min离心10min，取上清用于蛋白定量(bca法)，计算总蛋白含量；下层黑色素沉淀加入200μlnaoh(含10％dmso)，置于80℃水浴箱中裂解2小时；用黑素标准品绘制标准黑素含量曲线；将溶解完全的黑素以200μl/孔加入96孔板中，405nm处测定吸光度值，计算每毫克蛋白的黑素含量。所有数据进行了单向方差分析(anova)，之后还进行了hocturkey测试，与空白对照组相比，*p<0.05，**p<0.01。试验结果：如图7所示，与空白对照组相比，0.1-10μm的r-氟西汀可显著增加b16f10细胞中每mg蛋白质含有的黑素含量，并且这种促进作用具有剂量依耐性。s-氟西汀对b16f10细胞的黑素合成没有显著作用。2.3r-氟西汀和s-氟西汀对b16f10黑素瘤细胞酪氨酸酶活性的影响试验方法：取处于指数生长期状态良好的b16f10小鼠黑素瘤细胞，消化，计数，将细胞接种于直径10cm培养皿中，接种量为3×105个/皿，置37℃，5％co2培养箱中培养24小时；将培养基换为含2.5％胎牛血清的高糖dmem培养基后设置r-氟西汀组、s-氟西汀组、α-msh阳性对照组和空白对照组，分别加入不同浓度的r-氟西汀、不同浓度的s-氟西汀、50μm的α-msh和同体积的高糖dmem培养基并培养48小时。使用l-dopa法检测不同浓度的r-氟西汀和s-氟西汀对b16f10黑素瘤细胞酪氨酸酶活性的影响，l-dopa氧化法测定酪氨酸酶活性的方法如下：将培养48h的r-氟西汀组、s-氟西汀组、α-msh阳性对照组和空白对照组的细胞用pbs洗2遍，收集细胞于doff管中，每管加入100μl非变性裂解液(含1nmpmsf)，4℃裂解20min，再于4℃，12000r/min离心10min，取上清用于蛋白定量(bca法)，计算蛋白浓度；取含30μg蛋白体积加入96孔板，用pbs(0.1m，ph6.8)定量至100μl，再加入0.01％l-dopa100μl，每一浓度设定3个复孔，37℃避光孵育60min，波长475nm处测定od值。所有数据进行了单向方差分析(anova)，之后还进行了hocturkey测试，与空白对照组相比，*p<0.05，**p<0.01。试验结果：图8结果表明，与空白对照组相比，0.1-10μm的r-氟西汀可显著促进b16f10细胞酪氨酸酶活性，并且这种促进作用具有剂量依耐性，同时r-氟西汀浓度为10μm时与阳性药组的促进效果接近。s-氟西汀对b16f10细胞酪氨酸酶活性没有显著促进作用。2.4r-氟西汀和s-氟西汀对b16f10黑素瘤细胞黑素合成关键酶表达的影响上面结果表明，r-氟西汀能增加b16f10细胞黑素含量和酪氨酸酶活力。那么进一步使用westernblot方法检测mitf和tyr蛋白的表达水平考察r-氟西汀对黑素细胞黑素合成关键酶和关键转录因子的表达作用。酪氨酸酶(tyr)是黑素细胞黑素合成过程中的限速酶，小眼畸形转录因子(microphthalmia-associatedtranscriptionfactor,mitf)，它可以调控酪氨酸酶转录，并影响黑素细胞的发育，分化和色素生成作用。具体为：取处于指数生长期状态良好的b16f10小鼠黑素瘤细胞，消化，计数，将细胞接种于直径10cm培养皿中，接种量为3×105个/皿，置37℃，5％co2培养箱中培养24小时；将培养基换为含2.5％胎牛血清的高糖dmem培养基后加入不同浓度的r-氟西汀、不同浓度的s-氟西汀、50μm的α-msh和同体积的高糖dmem培养基(空白对照组)并培养48小时，之后收集细胞采用裂解法进行总蛋白的提取，30mg蛋白上样sds-page胶后，蛋白转膜至pvdf膜上，采用0.25％bsa封闭1h后采用含0.05％吐温20的tbst溶液洗3次后分别与tyr、mitf抗体进行孵育，在和二抗孵育后采用发光显色法检测蛋白表达。所有实验独立重复3次，所有数据进行了单向方差分析(anova)，之后还进行了hocturkey测试，与空白对照组相比，*p<0.05，**p<0.01。试验结果：结果如图9所示，与空白对照组相比，r-氟西汀在可以促进b1610黑素瘤细胞tyr和mitf蛋白的表达，并且具有剂量依耐性。α-msh阳性药对照组也可显著促进tyr和mitf蛋白表达。而与对照组相比s-氟西汀对b16f10黑素细tyr和mitf蛋白的表达没有显著作用。盐型实施例实施例33.1表1中的外消旋氟西汀盐对b16f10细胞黑素合成的影响b16f10细胞正常培养于含10％fbs的dmem培养基中，待其处于对数生长期时进行细胞传代点板于6孔板中，密度为105个/孔。点板24h后进行细胞给药(0.01μm-10μm)，给药48h后收集细胞分别采用naoh裂解法测定黑色素含量，即裂解和检测方法参考实施例2中的2.2部分。3.2表2中的外消旋氟西汀盐对b16f10细胞酪氨酸酶活性的影响b16f10细胞正常培养于含10％fbs的dmem培养基中，待其处于对数生长期时进行细胞传代点板于6孔板中，密度为105个/孔。点板24h后进行细胞给药(0.01μm-10μm)，给药48h后收集细胞采用bca法对细胞进行蛋白定量后，取10μg蛋白采用l-dopa法进行酪氨酸酶活性检测，检测方法参考实施例2中的2.3部分。以下表1和表2中的数值，都是以不加对应外消旋氟西汀盐时的数值为基准值进行比值计算的，即对应外消旋氟西汀盐浓度为0μm时的黑色素含量或酪氨酸酶活性计为100，数值120则表示加入某浓度的某种外消旋氟西汀盐后黑色素含量或酪氨酸酶活性是不加该外消旋氟西汀盐时的120％，以此类推。表1外消旋氟西汀盐对b16f10细胞黑素含量的影响表2外消旋氟西汀盐对b16f10细胞酪氨酸酶活性的影响3.3表3中的r-氟西汀盐对b16f10细胞黑素合成的影响b16f10细胞正常培养于含10％fbs的dmem培养基中，待其处于对数生长期时进行细胞传代点板于6孔板中，密度为105个/孔。点板24h后进行细胞给药(0.005μm-5μm)，给药48h后收集细胞分别采用naoh裂解法测定黑色素含量，即裂解和检测方法参考实施例2中的2.2部分。3.4表4中的r-氟西汀盐对b16f10细胞酪氨酸酶活性的影响b16f10细胞正常培养于含10％fbs的dmem培养基中，待其处于对数生长期时进行细胞传代点板于6孔板中，密度为105个/孔。点板24h后进行细胞给药(0.005μm-5μm)，给药48h后收集细胞采用bca法对细胞进行蛋白定量后，取10μg蛋白采用l-dopa法进行酪氨酸酶活性检测，检测方法参考实施例2中的2.3部分。以下表3和表4中的数值，都是以不加对应r-氟西汀盐时的数值为基准值进行比值计算的，即对应r-氟西汀盐浓度为0μm时的黑色素含量或酪氨酸酶活性计为100，数值120则表示加入某浓度的某种r-氟西汀盐后黑色素含量或酪氨酸酶活性是不加该r-氟西汀盐时的120％，以此类推。表3r-氟西汀盐对b16f10细胞黑素含量的影响表4r-氟西汀盐对b16f10细胞酪氨酸酶活性的影响制剂实施例实施例4：4.1外消旋氟西汀乳膏的制备外消旋氟西汀盐酸盐1％(g/g)吐温805％(g/g)单硬脂酸甘油酯2.8％(g/g)十八醇11％(g/g)硬脂酸1.4％(g/g)甘油10％(g/g)丙二醇3％(g/g)液状石腊8％(g/g)氧化铁红0.1％(g/g)氧化铁黄1％(g/g)二氧化钛5％(g/g)三乙醇胺0.15％(g/g)羟苯乙酯0.05％(g/g)纯化水51.5％(g/g)以上计量均为重量百分比，首先将单硬脂酸甘油酯、十八醇、硬脂酸、液状石蜡加热至80℃或以上并保温使之熔化呈液态作为溶液ⅰ；再将吐温80、甘油、丙二醇、三乙醇胺、羟苯乙酯和纯化水加热至80℃或以上作为溶液ⅱ；依次将过200目筛后的氧化铁黄、氧化铁红、二氧化钛、溶液ⅱ和氟西汀盐酸盐，加入到溶液ⅰ中，抽真空，边搅拌边乳化约30min，然后边搅拌乳化边降温，降温至约35℃时，停止搅拌乳化，灌装至包材中。4.2r-氟西汀乳膏的制备r-氟西汀盐酸盐1％(g/g)吐温805％(g/g)单硬脂酸甘油酯2.8％(g/g)十八醇11％(g/g)硬脂酸1.4％(g/g)甘油10％(g/g)丙二醇3％(g/g)液状石腊8％(g/g)氧化铁红0.1％(g/g)氧化铁黄1％(g/g)二氧化钛5％(g/g)三乙醇胺0.15％(g/g)羟苯乙酯0.05％(g/g)纯化水51.5％(g/g)以上计量均为重量百分比，首先将单硬脂酸甘油酯、十八醇、硬脂酸、液状石蜡加热至80℃或以上并保温使之熔化呈液态作为溶液ⅰ；再将吐温80、甘油、丙二醇、三乙醇胺、羟苯乙酯和纯化水加热至80℃或以上作为溶液ⅱ；依次将过200目筛后的氧化铁黄、氧化铁红、二氧化钛、溶液ⅱ和r-氟西汀盐酸盐，加入到溶液ⅰ中，抽真空，边搅拌边乳化约30min，然后边搅拌乳化边降温，降温至约35℃时，停止搅拌乳化，灌装至包材中。以下实施例4.3-4.9中所使用的氟西汀乳膏均为实施例4.1中制备的氟西汀乳膏。4.3氟西汀乳膏(0.1％g/g)对cums模型c57bl/6小鼠背部皮肤颜色的影响试验目的：考察氟西汀乳膏对cums模型c57bl/6小鼠背部皮肤黑色合成的影响；试验方法：采用cums方法造成c57bl/6小鼠背部皮肤黑素脱失模型，设置对照组为空白对照组：即正常喂养小鼠；cums(chronicunpredictablemildstress)模型组：即为慢性不可预见应激模型，小鼠经cums造模会导致背部脱毛皮肤黑素脱失；基质组为空白基质组：即为不含药物的空白制剂；氟西汀乳膏组：即为含有氟西汀的乳膏制剂组。设置每天给予0.1％g/g氟西汀乳膏涂抹一次，每次0.065g，连续涂抹10天治疗后观察c57bl/6小鼠背部皮肤颜色；试验结果：如图10所示，空白对照组正常喂养的小鼠的黑素会自然增多，cums模型组的小鼠背部皮肤颜色明显浅于对照组小鼠，氟西汀乳膏给药组小鼠背部皮肤颜色明显深于模型组和基质组。因此，结果证明氟西汀乳膏可以提高cums模型c57bl/6小鼠背部皮肤的着色。4.4氟西汀乳膏(0.1％g/g)对cums模型c57bl/6小鼠背部皮肤毛囊h&e染色的影响为了进一步证明氟西汀对cums模型c57bl/6小鼠背部皮肤颜色具有恢复作用，我们使用4％的多聚甲醛固定皮肤组织进行he染色，结果见图11所示，模型组和基质组的皮肤组织的he染色结果显示毛囊部位黑细胞颗粒减少，给予氟西汀乳膏10天后，毛囊中的黑素颗粒明显增多。结果说明氟西汀乳膏可以增加皮肤毛囊中黑色素颗粒的数量。4.5氟西汀乳膏(0.1％g/g)对cums模型c57bl/6小鼠背部皮肤tyr，trp-1和trp-2表达的影响皮肤颜色决定于皮肤表面的黑素细胞及其合成的黑色素。黑色素的合成主要受酪氨酸酶(tyr)，酪氨酸酶相关蛋白-1(trp-1)和酪氨酸酶相关蛋白-2的调节。tyr是黑色素合成的关键酶，是调节黑色素合成的关键蛋白。我们检测r-氟西汀乳膏是否对cums模型诱导的黑色素脱失模型的c57bl/6小鼠背部皮肤的tyr，trp-1和trp-2的蛋白表达下调具有调节作用。结果显示，cums模型导致c57bl/6小鼠背部皮肤的tyr，trp-1和trp-2的蛋白表达下调，基质组与模型组没有显著性差异，证明空白基质对于黑素相关蛋白的表达没有显著性的影响。给予氟西汀乳膏治疗后，cums模型c57bl/6小鼠背部皮肤的tyr，trp-1和trp-2的表达明显升高(图12)。证明氟西汀可能是通过提高黑色素合成相关蛋白的表达来促进黑色素的合成。.4.6氟西汀乳膏(0.1％g/g)对cums模型c57bl/6小鼠背部皮肤mitf表达的影响mitf是黑色素合成中重要的调节因子，调节酪氨酸酶的转录翻译过程，研究表明mitf激活可以显著调节酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白-1的表达但是对于酪氨酸酶相关蛋白-2的调节没有显著性的影响。mitf激活可以上调酪氨酸酶的表达，因此我们探讨氟西汀乳膏是否对cums模型的c57bl/6小鼠背部皮肤的mitf蛋白表达具有促进作用。实验结果如图13所示，cums导致c57bl/6小鼠背部皮肤mitf表达下调，氟西汀乳膏可以显著性地提高cums诱导的mitf下调水平。因此，我们的结果证明氟西汀乳膏可能是通过上调mitf的表达从而上调酪氨酸酶的表达以增加黑色素的合成。4.7氟西汀乳膏(0.01％g/g-5％g/g)对氢醌模型c57bl/6小鼠背部皮肤黑素合成的影响。试验目的：考察氟西汀乳膏对氢醌模型c57bl/6小鼠背部皮肤黑色合成的影响；试验方法：采用涂抹氢醌的方法造成c57bl/6小鼠背部皮肤黑素脱失，设置对照组为空白对照组：即正常喂养小鼠；2.5％氢醌模型组：即在小鼠背部脱毛后涂抹氢醌造成黑素脱失，基质组为空白基质组：即为不含药物的空白制剂；氟西汀乳膏组：即为含有氟西汀的乳膏制剂组。设置每天涂抹r-氟西汀乳膏(0.01％、0.1％、1％、5％g/g)0.065g，每天一次，30天治疗后观察c57bl/6小鼠背部皮肤颜色；试验结果：如图14所示，空白对照组正常喂养的小鼠的黑素会自然增多，氢醌模型组的小鼠背部皮肤颜色明显浅于对照组小鼠且在脱毛边缘毛发变白，氟西汀乳膏给药组小鼠背部皮肤颜色明显深于模型组和基质组。因此，结果证明氟西汀乳膏可以提高氢醌模型c57bl/6小鼠背部皮肤的着色。4.8r-氟西汀乳膏(0.01％g/g-5％g/g)对氢醌模型c57bl/6小鼠背部皮肤黑素合成的影响。试验目的：考察r-氟西汀乳膏对氢醌模型c57bl/6小鼠背部皮肤黑色合成的影响；试验方法：采用涂抹氢醌的方法造成c57bl/6小鼠背部皮肤黑素脱失，设置对照组为空白对照组：即正常喂养小鼠；2.5％氢醌模型组：即在小鼠背部脱毛后涂抹氢醌造成黑素脱失，基质组为空白基质组：即为不含药物的空白制剂；r-氟西汀乳膏组：即为含有r-氟西汀的乳膏制剂组。设置每天涂抹r-氟西汀乳膏(0.01％、0.1％、1％、5％g/g)0.065g，每天一次，30天治疗后观察c57bl/6小鼠背部皮肤颜色；试验结果：如图15所示，空白对照组正常喂养的小鼠的黑素会自然增多，氢醌模型组的小鼠背部皮肤颜色明显浅于对照组小鼠且在脱毛边缘毛发变白，r-氟西汀乳膏给药组小鼠背部皮肤颜色明显深于模型组和基质组。因此，结果证明r-氟西汀乳膏可以提高氢醌模型c57bl/6小鼠背部皮肤的着色。4.9r-氟西汀乳膏(0.1％g/g)对cums模型c57bl/6小鼠背部皮肤颜色的影响试验目的：考察r-氟西汀乳膏对cums模型c57bl/6小鼠背部皮肤黑色合成的影响；试验方法：采用cums方法造成c57bl/6小鼠背部皮肤黑素脱失模型，设置对照组为空白对照组：即正常喂养小鼠；cums(chronicunpredictablemildstress)模型组：即为慢性不可预见应激模型，小鼠经cums造模会导致背部脱毛皮肤黑素脱失；基质组为空白基质组：即为不含药物的空白制剂；r-氟西汀乳膏组：即为含有r-氟西汀的乳膏制剂组。设置给予r-氟西汀乳膏10天治疗后观察c57bl/6小鼠背部皮肤颜色；试验结果：如图16所示，空白对照组正常喂养的小鼠的黑素会自然增多，cums模型组的小鼠背部皮肤颜色明显浅于对照组小鼠，r-氟西汀乳膏给药组小鼠背部皮肤颜色明显深于模型组和基质组。因此，结果证明r-氟西汀乳膏可以提高cums模型c57bl/6小鼠背部皮肤的着色。实施例5：凝胶剂外消旋氟西汀盐酸盐1％(g/g)卡波姆1％(g/g)甘油5％(g/g)乙醇25％(g/g)丙二醇10％(g/g)吐温805％(g/g)三乙醇胺2.5％(g/g)羟苯乙酯0.05％(g/g)纯化水50.45％(g/g)以上计量均为重量百分比，将卡波姆加入纯化水中溶胀作为溶液ⅰ，依次将丙二醇、甘油、羟苯乙酯、乙醇、吐温80和氟西汀盐酸盐加入至溶液ⅰ中，搅拌至溶解，加入三乙醇胺，搅拌均匀，灌装至包材中。实施例6：凝胶剂r-氟西汀盐酸盐1％(g/g)卡波姆1％(g/g)甘油5％(g/g)乙醇25％(g/g)丙二醇10％(g/g)吐温805％(g/g)三乙醇胺2.5％(g/g)羟苯乙酯0.05％(g/g)纯化水50.45％(g/g)以上计量均为重量百分比，将卡波姆加入纯化水中溶胀作为溶液ⅰ，依次将丙二醇、甘油、羟苯乙酯、乙醇、吐温80和r-氟西汀盐酸盐加入至溶液ⅰ中，搅拌至溶解，加入三乙醇胺，搅拌均匀，灌装至包材中。实施例7：喷雾剂或溶液剂氟西汀盐酸盐1％(g/g)乙醇25％(g/g)丙二醇5％(g/g)吐温805％(g/g)羟苯乙酯0.05％(g/g)盐酸/氢氧化钠q.s.纯化水63.95％(g/g)依次将吐温、乙醇、丙二醇、羟苯乙酯和氟西汀盐酸盐加入至纯化水中，搅拌至溶解，用盐酸/氢氧化钠调节ph至目标值，即得。实施例8：气雾剂氟西汀盐酸盐1％(g/g)乙醇15％(g/g)hfa-134a82％(g/g)氢氧化钠q.s.纯化水2％(g/g)以上计量均为重量百分比，将氟西汀盐酸盐、纯化水和氢氧化钠溶于乙醇中，过滤，灌装至容器中，装上阀门系统，加铝盖扎口封固，用压灌法灌注hfa-134a，经检验合格后包装。实施例9：tdds透皮吸收制剂/贴剂氟西汀盐酸盐乙醇丙烯酸异辛酯丙烯酸2-羟乙基酯聚甲基丙烯酸甲酯2,2’-偶氮双(2-甲基丁腈)乙酸乙酯异丙醇隔离衬垫背衬混合丙烯酸异辛酯(626.4g)、丙烯酸2-羟乙基酯(421.2g)、聚甲基丙烯酸甲酯(32.4g)、2,2’-偶氮双(2-甲基丁腈)(2.16g)、乙酸乙酯(1555.2g)和异丙醇(64.8g)，混合均匀后置于容器中，通1l/分的氮气2分钟，密封置于57℃旋转水浴24小时，即制得共聚物(丙烯酸异辛酯/丙烯酸2-羟乙基酯)。将氟西汀盐酸盐(0.1g)加入乙醇(6g)，混合直至所有氟西汀盐酸盐溶解，向该溶液中加入共聚物(8.679g的干燥丙烯酸异辛酯/丙烯酸2-羟乙基酯)和乙酸乙酯(24.05g)，混合直至得到均匀的涂料制剂。将所述涂料制剂涂布到隔离衬垫上，将所述经涂布的衬垫在43℃烘干4min，在85℃烘干2min，在107℃烘干2min，将已涂布的衬垫层压到背衬上，即得。前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。当前第1页12当前第1页12