本发明涉及纳米泡及其应用，具体涉及一种多肽纳米泡及其制备方法和应用。
背景技术
随着人们生活水平的提高，肥胖人群逐年增加。世界卫生组织报道，作为一种慢性代谢性疾病，肥胖已成为全世界引起死亡的五大风险之一，其原因是由于肥胖可引发多种代谢性疾病，如：2型糖尿病、心脑血管疾病及肿瘤等。因此，针对肥胖的干预治疗是预防和治疗肥胖相关疾病的重要措施。
至今，对于肥胖的治疗主要有饮食行为疗法、外科手术和药物治疗。对于饮食行为疗法来讲，当停止减肥后，体重会严重反弹，甚至超过了减肥前的体重。而外科手术(如：缩胃术、胃旁路手术、胃束带手术)的风险又太大。所以许多肥胖患者把药物治疗作为首选。目前，美国fda批准的两种减肥药，分别为西布曲明(sibutramine)和奥利司他(orlistat)。但长期使用后存在较大副作用，比如前者可引发高血压、失眠等，后者会造成腹泻、排泄失禁等。因此，在参与代谢综合征相关的器官中，如何使得药物能够仅仅作用于脂肪组织，却对其他脏器和组织不造成影响，从而达到不改变人体免疫系统的基础上能更高效治疗代谢综合征的目的，成为现在肥胖治疗面临的重要问题和研究重点。
2004年，发表在“naturemedcine”上的一篇报道发现一种多肽能特异性的与白色脂肪组织血管的内皮细胞受体结合，其氨基酸序列为ckggrakdc。中国专利2010101599163公开了一种棕色脂肪组织靶向性多肽及其应用，公开了经修饰的多肽可以与具有生物药理活性的物质相连接，能够靶向运送药物到达棕色脂肪组织，发挥药理学效应，从而达到靶向治疗疾病的目的，侧重于报道一种棕色脂肪组织靶向性治疗的多肽载体，但该靶向性多肽载体的载药量及所载药物的种类及治疗肥胖的疗效还有待进一步讨论。
为开发具有靶向性治疗代谢疾病(比如恶性肿瘤)的纳米泡药物，有研究者采用人工合成的外源性多肽修饰细胞微泡，但该方法获得的外源性多肽修饰的微泡，其生物兼容性问题有待解决。
技术实现要素：
发明目的：为了解决现有的治疗肥胖的药物靶向性不强且稳定性、生物兼容性差的问题，本发明第一方面提供了一种多肽纳米泡的制备方法，本发明第二方面提供了所述制备方法制备得到的多肽纳米泡，本发明第三方面提供了多肽纳米泡的应用，通过包裹药物(如：核酸类、蛋白类、脂类、糖类、酮类等药物)和不同给药方式(如：静脉注射、皮下或腹腔注射等)靶向治疗肥胖。
技术方案：本发明第一方面提供一种多肽纳米泡的制备方法，包括以下步骤：
(1)构建重组质粒，所述重组质粒包括flag标签、脂肪组织靶向性多肽和微泡标志性膜蛋白cd63的编码基因，flag标签和脂肪组织靶向性多肽的编码基因按顺序依次连接在微泡标志性膜蛋白cd63编码基因的起始密码子后；其中所述脂肪组织靶向性多肽的氨基酸序列为ckggrakdc；
(2)将步骤(1)得到的重组质粒通过脂质体转染到分泌纳米泡的细胞中培养收集细胞培养液，经超速离心提取多肽纳米泡。
步骤(1)中，所述重组质粒的构建步骤如下：以cd63的cdna为模板，以cd63-f/cd63-r为引物，经pcr扩增得到flag-peptide-cd63片段，将flag-peptide-cd63片段插入出发质粒pires2-egfp的xhoi、ecori酶切位点之间得到重组质粒；其中引物cd63-f的核苷酸序列如seqidno:1所示，引物cd63-r的核苷酸序列如seqidno:2所示；其中flag-peptide-cd63片段的核苷酸序列如seqidno:3所示。
其中cd63的cdna的核苷酸序列如seqidno:4所示，包括上游5’非编码序列+cds+下游3’非编码序列，cds的核苷酸序列seqidno:5所示。更优选地，以potb7-cd63为模板。
其中，cd63-f中含有xhoi酶切位点(ctcgag)、flag标签序列(gattacaaggatgacgacgataag)以及脂肪组织靶向性多肽ckggrakdc序列(tgtaagggaggaagagcgaaggattgt)；cd63-r中含有ecori酶切位点(gaattc)。
其中，脂肪组织靶向性多肽的氨基酸序列中各个字母符号所代表的氨基酸残基的定义如下：c为半胱氨酸，k为赖氨酸，g为甘氨酸，r为精氨酸，a为丙氨酸，d为天冬氨酸。
步骤(2)中，所述分泌纳米泡的细胞可为未成熟的树状细胞、间充质干细胞及其他细胞(如293t细胞)，在此以293t细胞为例说明。重组质粒按照
本发明第二方面提供所述制备方法制备得到的多肽纳米泡，所述纳米泡为经脂肪组织靶向性多肽修饰的多肽纳米泡。
本发明第三方面提供所述的多肽纳米泡作为药物载体在制备治疗肥胖药物中的应用。
优选地，所述多肽纳米泡包裹携带治疗肥胖药物，所述治疗肥胖药物为核酸类药物、蛋白类药物、脂类药物、糖类药物或酮类药物。根据携载药物的不同，运用不同方法制备获得多肽纳米泡-药物制剂。
更优选地，所述酮类药物为姜黄素。将姜黄素和多肽纳米泡混合，室温培养，随后将混合物经蔗糖密度梯度(蔗糖浓度分别为10wt.％、20wt.％、30wt.％、40wt.％、50wt.％、60wt.％、70wt.％)，200,000g离心1.5-3h，收集在40-60％蔗糖浓度中间的黄色条带，pbs重悬，即为多肽纳米泡-姜黄素制剂，姜黄素是包裹在多肽纳米泡内部的，从而提高姜黄素的稳定性及降低其毒性。
有益效果：(1)本发明提出了一种新的多肽纳米泡，该多肽纳米泡为抗肥胖的药物靶向治疗提供了极大的便利，其具有高效、低毒的优势，所载药物经多肽纳米泡的包裹，使得药物高效的进入靶细胞，大大提高了药物的利用率，从而显著增强了药物的靶向抗肥胖活性，适用于不同给药方法如静脉注射的靶向作用、腹腔、肌肉和皮下注射的缓控释作用。(2)本专利的制备方法过程简单，且未破坏药物本身的性质；制备的多肽纳米泡性质稳定，因制备方法是使用分子克隆、细胞转染的方法将靶向多肽连接到纳米泡膜蛋白上的，这种修饰方法获得的多肽纳米泡结构及性质都非常稳定，不会因外界环境的改变而出现脱靶或降解，和人工合成的多肽化学修饰纳米泡相比，该制备方法优势显著，便于长期保存。
附图说明
图1为pires2-egfp质粒图谱；
图2为pires2-egfp-flag-peptide-cd63重组质粒结构示意图；
图3为多肽纳米泡构建及其载药示意图；
图4为分别采用tem和nta对多肽纳米泡及多肽纳米泡-姜黄素制剂进行表征分析，上图为tem拍摄的照片，下图为nta的检测分析结果；
图5为给药前后，高脂喂养小鼠的体重变化；$$p<0.01，$$$p<0.001表示与正常对照组比较；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001表示与模型对照组比较；#p<0.05，##p<0.01表示与姜黄素组比较，&p<0.05，&&p<0.01表示与纳米泡-姜黄素组比较；
图6为激光共聚焦显微镜观察红色荧光标记的纳米泡-姜黄素及多肽纳米泡-姜黄素进入脂肪细胞的量；
图7为h-e染色检测各组小鼠肝脏和肾脏的病理变化。
具体实施方式
实施例1多肽纳米泡及多肽纳米泡-姜黄素制剂的制备
实验质粒：公司购买含有egfp报告基因的载体质粒为pires2-egfp，其图谱见图1所示。
实验步骤：
1)以pires2-egfp为载体，构建含有flag标签、靶向多肽ckggrakdc及cd63基因的重组质粒；详细步骤如下：
1.1引物设计
根据cd63的cds序列和pires2-egfp表达载体的mcs位点，设计特异性pcr引物：引物cd63-f的核苷酸序列如seqidno:1所示，引物cd63-r的核苷酸序列如seqidno:2所示。其中cd63-f中含有xhoi酶切位点(ctcgag)、flag标签序列(gattacaaggatgacgacgataag)以及脂肪组织靶向性多肽ckggrakdc序列(tgtaagggaggaagagcgaaggattgt)；cd63-r中含有ecori酶切位点(gaattc)。
1.2pcr反应
在50μlpcr反应管中建立如下反应体系，见表1：
表1flag-peptide-cd63的pcr体系
其中potb7-cd63中cd63的cdna序列如seqidno:4所示，包括上游5’非编码序列+cds+下游3’非编码序列，cds的核苷酸序列seqidno:5所示。
反应条件如下：
冷却至4℃，反应结束后，取10μl进行1.0％琼脂糖电泳鉴定。
1.3dna的酶切与连接
按常规分子克隆方法进行，具体步骤如下：
1.3.1步骤1.2得到的pcr产物经电泳分离后，切胶回收目的片段，建立如表2的酶切反应体系：
表2flag-peptide-cd63片段的酶切反应体系
pires2-egfp载体建立如表3的酶切反应体系：
表3pires2-egfp载体的酶切反应体系
酶切反应体系均在37℃反应过夜后，切胶回收目的片段。
1.3.2酶切后dna片段经切胶纯化后，建立如表4的连接反应体系：
表4构建重组质粒的连接反应体系
22℃反应16h。
1.4连接产物转化
1.4.1将步骤1.3.2得到的20μl连接液全部加入100μltop10感受态细菌(南京赛泓瑞生物科技有限公司)中，置冰上30min；
1.4.242℃热激90s，迅速置冰中5min，然后加入600μl37℃预热的lb培养液；
1.4.337℃，220rpm振摇30min，离心后全部涂布于含50μg/mlkan的lb平板，37℃倒置培养过夜；
其中，lb培养液的配方如下：配制每升培养基，应该在950ml去离子水中加入：胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、nacl10g；摇动容器直至完全溶解，用5mol/lnaoh水溶液调ph至7.0，然后用去离子水定容至1l。在15psi高压下蒸汽灭菌20min，4℃保存备用。
lb平板的配方如下：1)配制：1llb培养基(胰蛋白胨(tryptone)10g/l、酵母提取物(yeastextract)5g/l、氯化钠(nacl)10g/l)，加入15g琼脂粉；2)抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的lb固体培养基置于55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时(手可触摸)加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀；3)倒板：一般10ml倒1个板子。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15min；4)保存：用封口胶封边，并倒置放于4℃保存，一个月内使用。
1.5阳性克隆鉴定
随机挑取4个单克隆至含50μg/mlkan的4mllb培养液的试管中，37℃220rpm振摇4h，取100μl离心，取菌体沉淀，用50μlddh2o重悬，沸水浴5min，离心取1μl上清液做模板，进行pcr鉴定；50μlpcr反应体系见表5。
表5菌落pcr反应体系
反应条件如下：
冷却至4℃，反应结束后，取10μl进行1.0％琼脂糖电泳鉴定。
1.6dna测序
将经菌落pcr鉴定为阳性克隆的进行测序，flag-peptide-cd63的核苷酸序列如seqidno:3所示。构建的重组质粒结构示意图如图2所示。
2)运用脂质体将构建的重组质粒dna转染分泌微泡的源细胞293t中
根据invitrogen公司的
其中，293t细胞的培养液为高糖dmem(gibco，货号：11995-065)，并添加fbs(gibco，货号：10270-106)及青/链霉素双抗(gibco，货号：15140-122)，使得fbs的终浓度为10％(v/v)，青/链霉素双抗的终浓度为1％(v/v)。
3)根据超速离心的方法提取转染了重组质粒的293t细胞的微泡，获得多肽修饰的纳米泡，即：多肽纳米泡。具体步骤如下：转染细胞48h后收集细胞培养液，500g，4℃，离心15min；取上清，去除细胞沉淀，1500g，4℃，离心20min；取上清，此时沉淀为一些细胞碎片或者残存的细胞器；将上清加入超速离心机的离心管中，配平(配平的两管之间相差不能超过0.2g)，4℃，110,000g，离心70min；弃上清。沉淀即为细胞分泌的经多肽修饰的纳米泡，用100-200μlpbs或者所需的空培养液等反复吹打溶解，4℃保存。
4)制备多肽纳米泡-姜黄素制剂
将200μg姜黄素与1mg步骤(3)制备的多肽纳米泡混合，室温培养10min，随后将混合物经蔗糖密度梯度(蔗糖浓度分别为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％)，200,000g离心90min，收集在40-60％蔗糖浓度中间的黄色条带，pbs重悬，即为多肽纳米泡-姜黄素制剂。
其中，步骤2)、3)和4)的简要过程示意图如图3所示。
5)tem鉴定靶向多肽修饰的纳米泡及多肽纳米泡-姜黄素制剂
a.分别向多肽纳米泡沉淀和多肽纳米泡-姜黄素沉淀中加入2.5％的戊二醛固定液中4℃固定过夜；
b.用pbs漂洗三次，每次10min；
c.室温下用1％四氧化锇固定样品1h，然后用10％的明胶包埋固定好的样品；
d.在4℃环境下用戊二醛固定样品1h；
e.样品用浓度递增的乙醇溶液(30％、50％、70％、90％、95％、100％，100％，100％)脱水；
f.用环氧树脂浸透包埋后，用leicauc6超薄切片机切片；
g.最后在110kv的条件下，用透射电子显微镜观察样品并拍摄照片，见图4。
6)nta检测
将收集的多肽纳米泡及多肽纳米泡-姜黄素重悬后，将蛋白浓度(以纳米泡浓度为准)调整至1μg/ml，再稀释100-500倍后加入马尔文ns300纳米颗粒计数仪中检测。
结果如图4所示，tem和nta检测发现不论是纳米泡，还是多肽纳米泡及多肽纳米泡-姜黄素制剂都具有清晰的脂膜结构，说明成功获取修饰前后的纳米泡。但随着多肽以及姜黄素的加入，纳米泡的大小有明显改变，说明多肽纳米泡及多肽纳米泡-姜黄素制剂构建成功。
实施例2多肽纳米泡-姜黄素制剂可有效抑制高脂喂养小鼠体重的增加
实验动物：6周龄雄性小鼠及饲料，由南京医科大学实验动物中心提供，许可证号：scxk(苏)2011-0003。动物随机分笼饲养，食水自由。
实验药品：正常饮食对照组(空白对照组)；高脂饮食分为生理盐水组(模型对照组)、纳米泡组、纳米泡-姜黄素组、多肽纳米泡组(由实施例1步骤3)制备得到)、姜黄素组及多肽纳米泡-姜黄素组(由实施例1步骤4)制备得到)。
其中，纳米泡的制备步骤如下：接种293t细胞(atcc，产品编号：cm-h010)至细胞培养液中，置于37℃、5％co2培养箱中培养，至70-90％的密度(约0.25-1×106个细胞)时，收集未转染的293t细胞培养液，500g，4℃，离心15min；取上清，去除细胞沉淀，1500g，4℃，离心20min；取上清，此时沉淀为一些细胞碎片或者残存的细胞器；将上清加入超速离心机的离心管中，配平(配平的两管之间相差不能超过0.2g)，4℃，110,000g，离心70min；弃上清。沉淀即为纳米泡，用100-200μlpbs或者所需的空培养液等反复吹打溶解，4℃保存。
纳米泡-姜黄素的制备步骤如下：将200μg姜黄素与1mg上述制备的纳米泡混合，室温培养10min，随后将混合物经蔗糖密度梯度(蔗糖浓度分别为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％)，200,000g离心90min，收集在40-60％蔗糖浓度中间的黄色条带，pbs重悬，即为纳米泡-姜黄素制剂。
实验步骤：
1)6周龄70只雄性小鼠在南京医科大学实验动物中心清洁环境中饲养，温度(21±2)℃，湿度(35±2)％，12h:12h昼夜间断照明，自由进食饮水，饮用水为实验动物中心制备的蒸馏水。
2)经适应性饲养2-3天后，随机取10只作为正常对照组给予常规饲料，其余60只随机分组，每组10只，给予高脂饲料(胆固醇1wt.％，猪油20wt.％，胆盐0.2wt.％，常规饲料78.8wt.％)喂养的同时，分别于每天上午10点注射(以尾静脉注射为例说明)生理盐水(0.03ml/30g体重)、纳米泡(40μg/鼠/次，溶于pbs中)、多肽纳米泡(以纳米泡的剂量为准，40μg/鼠/次，溶于pbs中)、姜黄素(75mg/kg体重，溶于pbs中，根据已有文献报道，该剂量为低剂量给药)、纳米泡-姜黄素组(以姜黄素的剂量为准计算，75mg/kg体重，溶于pbs中)和多肽纳米泡-姜黄素(以姜黄素的剂量为准计算，75mg/kg体重，溶于pbs中)。除正常对照组外，其余各组均继续给予高脂饲料。每4周称一次体重，共给药20周，所得数据进行统计学处理。结果见图5所示。
从图5中可以看出，从喂养的第8周起，高脂饲料喂养小鼠(模型对照组)体重增加快于正常喂养小鼠的体重(正常对照组)，差异有统计学意义($$p<0.01)，说明高脂喂养可促使小鼠发生肥胖。此外，在高脂饲料喂养的同时，分别给小鼠注射纳米泡、多肽纳米泡、姜黄素、纳米泡-姜黄素及多肽纳米泡-姜黄素，结果发现同模型对照组相比，注射纳米泡及多肽纳米泡的小鼠体重增加未受到明显抑制；而从给药12周后，同模型对照组相比，注射姜黄素、纳米泡-姜黄素及多肽纳米泡-姜黄素的小鼠体重增加明显受到抑制，差异显著(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001)。重要的是，随着给药时间的延长，同姜黄素组相比，纳米泡-姜黄素及多肽纳米泡-姜黄素制剂抑制体重增加的作用更加明显，差异显著(#p<0.05，##p<0.01)。并且，多肽纳米泡-姜黄素制剂的减肥效果优于纳米泡-姜黄素组(&p<0.05，&&p<0.01)，说明多肽纳米泡-姜黄素制剂抑制体重增加作用更为显著。
实施例3多肽纳米泡-姜黄素制剂可显著抑制高脂喂养小鼠的内脏脂肪和皮下脂肪的储存
1)根据实施例2的实验步骤给高脂喂养的肥胖小鼠静脉注射给药20周；
2)各组小鼠禁食12小时，以3％戊巴比妥钠，45mg/kg腹腔注射麻醉后，准确称重；
3)常规消毒开腹，迅速摘取肾脏周围脂肪组织、肠系膜周围脂肪组织、附睾周围脂肪组织以及腹部皮下脂肪组织称取湿重(其中，腹部皮下脂肪组织范围：肋弓以下、腹股沟以上的腹部，两侧以腋中线为界)；
4)按如下公式计算，即：腹腔脂肪湿重；脂肪垫总重(g)＝肾脏周围脂肪组织+附睾周围脂肪组织；体脂含量＝脂肪垫总重(g)/尸重(g)。
5)所得数据进行统计学处理。结果见表6、表7和表8所示。
表6多肽纳米泡-姜黄素制剂对小鼠内脏脂肪的储存的抑制作用n＝10
注：$$$p<0.001，表示与正常对照组比较；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001表示与模型对照组比较；#p<0.05，##p<0.01，表示与姜黄素组比较；&&p<0.01表示与纳米泡-姜黄素组比较。
表7多肽纳米泡-姜黄素制剂对小鼠体脂指数的抑制作用n＝10
注：$$$p<0.001，表示与正常对照组比较；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001表示与模型对照组比较；#p<0.05，##p<0.01，表示与姜黄素组比较；&&p<0.01表示与纳米泡-姜黄素组比较。脂肪垫总重＝肾脏周围脂肪组织+附睾周围脂肪组织；体脂指数＝脂肪垫总重(g)/体重(g)。
表8多肽纳米泡-姜黄素制剂对小鼠皮下脂肪储存的抑制作用n＝10
注：$$$p<0.001，表示与正常对照组比较；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001表示与模型对照组比较；#p<0.05，##p<0.01，表示与姜黄素组比较；&&p<0.01表示与纳米泡-姜黄素组比较。sf-fat：皮下脂肪组织总量；vf-fat：内脏脂肪组织总量。
从表6中可以看出，高脂饲料喂养的模型对照组小鼠的内脏脂肪，如附睾脂肪，肾脏周围、网膜及肠系膜周围的脂肪较正常对照组明显增加，差异存在统计学意义($$$p<0.001)，说明肥胖引起了大量内脏脂肪的储存。同模型对照组相比，注射纳米泡及多肽纳米泡后，小鼠内脏脂肪组织的湿重未得到明显减轻。而经姜黄素、纳米泡-姜黄素及多肽纳米泡-姜黄素制剂治疗后，小鼠内脏脂肪组织湿重明显降低，与模型对照组比较，差异显著(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)，说明姜黄素、纳米泡-姜黄素及多肽纳米泡-姜黄素制剂明显抑制了高脂喂养小鼠内脏脂肪的储存。同姜黄素组相比，纳米泡-姜黄素及多肽纳米泡-姜黄素制剂抑制小鼠内脏脂肪储存的作用更加明显，差异显著(#p<0.05、##p<0.01)。并且，多肽纳米泡-姜黄素制剂对小鼠内脏脂肪储存的抑制作用较纳米泡-姜黄素组更强(&&p<0.01)，说明多肽纳米泡-姜黄素制剂抑制高脂喂养小鼠内脏脂肪增加作用更加显著。
进一步检测纳米泡、多肽纳米泡、姜黄素、纳米泡-姜黄素及多肽纳米泡-姜黄素制剂给药前后，高脂喂养小鼠体脂指数(f-idx)的变化，结果见表7所示，模型对照组小鼠的脂肪垫总重及体脂指数较正常对照组明显升高($$$p<0.001)。同模型对照组相比，注射纳米泡及多肽纳米泡后，小鼠的体脂指数未得到改善。而尾静脉注射姜黄素、纳米泡-姜黄素及多肽纳米泡-姜黄素制剂治疗后，小鼠的体脂指数明显降低，差异明显(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)，更进一步说明姜黄素、纳米泡-姜黄素及多肽纳米泡-姜黄素制剂能显著抑制高脂喂养小鼠内脏脂肪的增加。并且同姜黄素组相比，纳米泡-姜黄素及多肽纳米泡-姜黄素制剂处理的小鼠体脂指数降低的程度更加明显，差异显著(#p<0.05、##p<0.01)。并且，多肽纳米泡-姜黄素制剂降低小鼠体脂指数的作用较纳米泡-姜黄素组更强(&&p<0.01)，说明多肽纳米泡-姜黄素制剂抑制高脂喂养小鼠体脂指数上升的作用更加显著。
如表8所示，同姜黄素组相比，纳米泡-姜黄素及多肽纳米泡-姜黄素制剂的处理不仅明显降低了高脂喂养小鼠内脏脂肪的储存，还显著减轻了高脂喂养小鼠皮下脂肪的重量，更明显的降低了皮下脂肪占体重的比例，差异显著(#p<0.05、##p<0.01)。重要的是，同纳米泡-姜黄素组相比，多肽纳米泡-姜黄素处理组更能有效抑制小鼠皮下脂肪的储存(&&p<0.01)。而注射纳米泡及多肽-纳米泡的小鼠皮下脂肪的重量并未显著降低。以上的结果都提示同正常对照组相比，高脂喂养小鼠的腹腔内脏脂肪和腹部皮下脂肪明显增加，经姜黄素、纳米泡-姜黄素及多肽纳米泡-姜黄素制剂治疗后，同模型组相比，高脂喂养小鼠的腹腔内脏脂肪和腹部皮下脂肪湿重都有显著的降低，并且同纳米泡-姜黄素组相比，多肽纳米泡-姜黄素制剂的抑制效果更佳。结合实施例2的结果，更进一步的说明多肽纳米泡-姜黄素制剂更加具有显著抑制肥胖的作用。
实施例4多肽纳米泡-姜黄素制剂有效增强姜黄素进入脂肪细胞
1)将红色荧光染料pkh26标记(标记纳米泡)的纳米泡-姜黄素及多肽纳米泡-姜黄素加入脂肪细胞3t3-l1中，运用激光共聚焦显微镜观察两者进入细胞的状态。具体步骤如下：1)各取2×107个用pbs溶解的纳米泡-姜黄素及多肽纳米泡-姜黄素悬液25μl，各加入1mlpkh26染液(上海北诺生物科技有限公司，货号：mini26-1kt)的稀释液c重悬；2)用稀释液c稀释pkh26乙醇染液至终浓度为2μm，终体积各为1ml；3)尽快将1ml上述稀释后的纳米泡-姜黄素及多肽纳米泡-姜黄素悬液加入到1mlpkh26染液中，立即用吸管快速混匀样品，室温(20-25℃)孵育2-5min，定时轻轻颠倒离心管保证充分混匀；4)加入等量血清或1％bsa孵育1min终止染色反应，用等量含血清的pbs稀释终止的反应液，100,000-160,000g、20-25℃离心1-2h，去上清；5)沉淀团转入新的离心管，进一步洗三次，后用50-100μlpbs重悬沉淀，加入到2ml培养有3t3-l1细胞的培养液中，置于37℃、5％co2培养箱中培养4-24h。
2)运用激光共聚焦显微镜观察红色标记的纳米泡-姜黄素及多肽纳米泡-姜黄素进入脂肪细胞的状态。
结果如图6所示(400×)，同纳米泡-姜黄素处理的脂肪细胞相比，红色荧光标记的多肽纳米泡-姜黄素制剂处理后的脂肪细胞红色荧光强度更强，说明多肽纳米泡-姜黄素制剂可高效的进入脂肪细胞，即：多肽纳米泡可更高效的将姜黄素转运至靶细胞——脂肪细胞中。结合实施例2和实施例3中的动物实验数据，进一步提示同纳米泡-姜黄素组相比，在多肽纳米泡的靶向作用下，姜黄素可更高效的进入靶细胞——脂肪细胞发挥功能，进而更有效地抑制肥胖发生。
实施例5多肽纳米泡-姜黄素制剂无明显的生物学毒性
1)根据实施例2的实验步骤给正常喂养的小鼠静脉注射给药20周，空白对照组注射生理盐水(0.03ml/30g体重)，实验组分别注射纳米泡(80μg/鼠/次)、多肽纳米泡(以纳米泡的剂量为准计算，80μg/鼠/次)、纳米泡-姜黄素及多肽纳米泡-姜黄素制剂(以姜黄素的剂量为准计算，150mg/kg体重)。
2)各组小鼠禁食12小时，以3％戊巴比妥钠，45mg/kg腹腔注射麻醉后，常规消毒开腹，迅速摘取肝脏、肾脏组织，进行h-e染色观察，所得结果见图7所示。
从图7(200×)可以看出，同空白对照组相比，尾静脉注射纳米泡、多肽纳米泡、纳米泡-姜黄素及多肽纳米泡-姜黄素制剂的小鼠肝脏和肾脏组织都没有明显的病理改变，说明纳米泡、多肽纳米泡、纳米泡-姜黄素及多肽纳米泡-姜黄素制剂对小鼠都无明显的毒副作用。
序列表
<110>南京医科大学
<120>一种多肽纳米泡及其制备方法和应用
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