一种苦瓜水提物的应用的制作方法

本发明属于生物化学领域，更具体地，涉及一种苦瓜水提物的应用。

背景技术：

抑郁的特征是情绪的改变，例如内疚感或自我价值感低、能量低、兴趣丧失或快乐。由于治疗阻力和自杀的高风险，抑郁症已被公认为最普遍的公共心理健康问题之一，根据世界卫生组织的调查显示抑郁症是社会负担的主要原因。

抗抑郁药(antidepressants)是指一组主要用来治疗以情绪抑郁为突出症状的精神疾病的精神药物。抗抑郁药主要用于治疗抑郁症和各种抑郁状态，常见的第一代抗抑郁药物有两种，即单胺氧化酶抑制剂(maoi)和三环类抗抑郁药(tca)。由于新药发展很快，新药层出不穷，如万拉法星、萘法唑酮等，但目前仍以选择性五羟色胺(5-ht)再摄取抑制剂为主，临床上这类药物的应用最为广泛。但是，在过去的几十年中，该药的应用存在一定的缺陷，包括治愈率低、活性谱有限、起效慢、副作用大。因此，寻求有效的、副作用小的抗抑郁药物临床意义重大，将为临床医生提供多样化的抑郁症治疗方案。

技术实现要素：

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种苦瓜水提物应用于抗抑郁症药物的制备，其目的在于采用天然苦瓜水提物，用于制备抗抑郁症药物，由此解决现有的抗抑郁症药物副作用大的技术问题。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种苦瓜水提物的应用，应用于抗抑郁症药物的制备。

优选地，所述应用，其所述苦瓜水提物，按照如下方法制备：采用水提醇沉法制的苦瓜多糖。

优选地，所述应用，其所述苦瓜多糖制备步骤如下：

(1)原料粉碎：将鲜苦瓜脱水粉碎，过300至500目筛，制得苦瓜超微粉；

(2)温水浸提：将步骤(1)中获得的苦瓜超微粉以蒸馏水为溶剂，按照料水比1:18至1:22，进行低温浸提，浸提温度在85至95℃，浸提时间5至10小时，固液分离后获得浸提液；

(3)粗制：将步骤(2)中获得的浸提液，浓缩至1:1至1:2(ml:g)，冷却至室温，获得浓缩液；

(4)精制：将步骤(3)中的浓缩液，加入80％至85％的乙醇溶液，直至含醇量达到60％至80％，4℃密闭冷藏24至48小时，滤过，滤液回收乙醇得到粗提液；

(5)将步骤(4)中获得的粗提液，加入85％至90％的乙醇溶液，直至含醇量达到75％至80％，4℃密闭冷藏24至48小时，过滤，滤液回收乙醇得到精制液，即所述苦瓜水提物。

优选地，所述应用，其所述苦瓜多糖的制备步骤(1)过500目筛。

优选地，所述应用，其所述抑郁症药物为抗jnk3/pi3k/akt神经炎症代谢途径失调的慢性社交失败应激引起的行为缺陷药物。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，由于采用常用蔬菜苦瓜的水提物作为抗抑郁症药物原料来源，其具有独特的抗抑郁效果，能够取得来源广泛、成本低、效果好、副作用小的有益效果。

优选技术方案，对于苦瓜水提物的制备方法进行了摸索，提出了关键的水体温度参数，并配合该条件进行了粉碎、水体条件的改进，获得了抗抑郁效果更好的苦瓜水提物。

附图说明

图1是实施例4苦瓜水提物抗抑郁作用效果检测结果，其中图1a是糖水消耗结果，图1b是悬尾不动时间；##p<0.01vs正常组，*p<0.05,p<0.01vs模型组；

图2是实施例4苦瓜水提物对抑郁症小鼠模型的海马组织中炎性因子的抑制作用检测结果，其中图2a是对tnf-α含量检测，图2b是对il-6含量检测，图2c是对il-1β含量检测，##p<0.01vs正常组，*p<0.05,p<0.01vs模型组；

图3是实施例4苦瓜水提物对炎性通路关键因子及pi3k活性的影响，其中图3a为对jnk3蛋白表达量的影响，图3b为对c-jun蛋白表达量的影响，图3c为对p-110β蛋白表达量的影响，图3d为对pi3k活性的影响。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明提供了一种苦瓜水提物的应用，其应用于抗抑郁症药物的制备。

所述苦瓜水提物，按照如下方法制备：采用水提醇沉法制的苦瓜多糖。具体制备步骤如下：

(1)原料粉碎：将鲜苦瓜脱水粉碎，过300至500目筛，优选500目筛，制得苦瓜超微粉；

(2)温水浸提：将步骤(1)中获得的苦瓜超微粉以蒸馏水为溶剂，按照料水比1:18至1:22，进行低温浸提，浸提温度在85至95℃，浸提时间5至10小时，固液分离后获得浸提液；目前的苦瓜多糖的提取，多采用沸水浸提的方式，然而从实验结果看来，沸水浸提的苦瓜多糖在抗抑郁症方面效果不及温水浸提，可能是由于苦瓜多糖主要是由于其抗炎作用起到了抗抑郁症效果，而非其功效显著的抗氧化作用，因此在制备方法上，水提物的制备温度非常关键，实验显示浸提温度在85至95℃，在多糖提取效率和抗抑郁效果方面明显优于高温浸提。同时为了配合温水浸提，采用超微粉和延长浸提时间，来保证提取率。

(3)粗制：将步骤(2)中获得的浸提液，浓缩至1:1至1:2(ml:g)，冷却至室温，获得浓缩液；

(4)精制：将步骤(3)中的浓缩液，加入80％至85％的乙醇溶液，直至含醇量达到60％至80％，4℃密闭冷藏24至48小时，滤过，滤液回收乙醇得到粗提液；

(5)将步骤(4)中获得的粗提液，加入85％至90％的乙醇溶液，直至含醇量达到75％至80％，4℃密闭冷藏24至48小时，过滤，滤液回收乙醇得到精制液，即所述苦瓜水提物。

所述抑郁症药物为，抗jnk3/pi3k/akt神经炎症代谢途径失调的慢性社交失败应激引起的行为缺陷药物。

抑郁症患者血液中促炎细胞因子的平均水平升高，许多炎性介质，如肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、白细胞介素6和白细胞介素-1β(il-1β)参与了抑郁症的病理生理过程。这些促炎细胞因子可能阻断神经传递和可塑性，抑制神经发生。抗抑郁药物，如氟西汀和帕罗西汀，降低了脑和血液中的炎性细胞因子。因此，炎症可能是抑郁症的重要生物学和细胞发病机制。在神经退行性病变和与炎症相关的心境疾病，如jnk参与的多种信号通路。c-junn-末端蛋白激酶(jnk)，丝裂原活化蛋白(map)激酶的成员，由至少10个jnk亚型组成，由三个基因编码：jnk1、jnk2、jnk3。由于jnk3是一种在脑内丰富的异构体，是神经病理疾病中神经元应激反应的重要参与者，jnk3的差异调节机制在抑郁症中仍不清楚。作为jnk3的靶点，pik3cb的表达受到抑制，pik3cb编码的蛋白p110β直接与磷酸肌醇-3激酶(pi3k)/akt促存活途径有关。jnk3小鼠表现为海马中pi3k活性增加和akt磷酸化(17)。有证据表明pi3k/akt通路参与了抑郁症的病理生理学和不同化合物的抗抑郁样作用，其机制涉及突触神经传递、神经细胞增殖、迁移和可塑性。特别是，akt2对葡萄糖代谢是重要的，参与了神经元分化、存活和多巴胺转运体细胞表面表达的调控。此外，研究表明akt2缺乏与小鼠的抑郁行为有关。

苦瓜是一种深受人们欢迎的蔬菜和中药。苦瓜多糖是苦瓜有益作用的主要活性成分之一。研究表明苦瓜多糖(mcp)具有多种有益的作用，包括抗氧化和抗炎作用。目前一般利用苦瓜多糖的抗氧化作用，应用于制备抗氧化剂。然而未见在先技术显示mcp对慢性社交应激引起的抑郁行为具有神经保护，我们推测mcp通过jkn3/pi3k/akt信号通路来保护抑郁行为并降低促炎细胞因子。

以下为实施例：

实施例1

(1)原料粉碎：将鲜苦瓜脱水粉碎，过300目筛，制得苦瓜超微粉；

(2)温水浸提：将步骤(1)中获得的苦瓜超微粉以蒸馏水为溶剂，按照料水比1:22，进行低温浸提，浸提温度在95℃，浸提时间10小时，固液分离后获得浸提液；

(3)粗制：将步骤(2)中获得的浸提液，浓缩至1:1(ml:g)，冷却至室温，获得浓缩液；

(4)精制：将步骤(3)中的浓缩液，加入80％的乙醇溶液，直至含醇量达到60％，4℃密闭冷藏24小时，滤过，滤液回收乙醇得到粗提液；

(5)将步骤(4)中获得的粗提液，加入85％的乙醇溶液，直至含醇量达到75％，4℃密闭冷藏24小时，过滤，滤液回收乙醇得到精制液，即所述苦瓜水提物。

实施例2

(1)原料粉碎：将鲜苦瓜脱水粉碎，过500目筛，制得苦瓜超微粉；

(2)温水浸提：将步骤(1)中获得的苦瓜超微粉以蒸馏水为溶剂，按照料水比1:20，进行低温浸提，浸提温度在90℃，浸提时间8小时，固液分离后获得浸提液；

(3)粗制：将步骤(2)中获得的浸提液，浓缩至1:1.5(ml:g)，冷却至室温，获得浓缩液；

(4)精制：将步骤(3)中的浓缩液，加入85％的乙醇溶液，直至含醇量达到80％，4℃密闭冷藏48小时，滤过，滤液回收乙醇得到粗提液；

(5)将步骤(4)中获得的粗提液，加入90％的乙醇溶液，直至含醇量达到80％，4℃密闭冷藏48小时，过滤，滤液回收乙醇得到精制液，即所述苦瓜水提物。

实施例3

(1)原料粉碎：将鲜苦瓜脱水粉碎，过400目筛，制得苦瓜超微粉；

(2)温水浸提：将步骤(1)中获得的苦瓜超微粉以蒸馏水为溶剂，按照料水比1:18，进行低温浸提，浸提温度在85℃，浸提时间5小时，固液分离后获得浸提液；

(3)粗制：将步骤(2)中获得的浸提液，浓缩至1:2(ml:g)，冷却至室温，获得浓缩液；

(4)精制：将步骤(3)中的浓缩液，加入85％的乙醇溶液，直至含醇量达到70％，4℃密闭冷藏36小时，滤过，滤液回收乙醇得到粗提液；

(5)将步骤(4)中获得的粗提液，加入90％的乙醇溶液，直至含醇量达到80％，4℃密闭冷藏36小时，过滤，滤液回收乙醇得到精制液，即所述苦瓜水提物。

对比例

(1)原料粉碎：将鲜苦瓜脱水粉碎，过200目筛，制得苦瓜超微粉；

(2)温水浸提：将步骤(1)中获得的苦瓜超微粉以蒸馏水为溶剂，按照料水比1:20，进行低温浸提，浸提温度在100℃，浸提时间3小时，固液分离后获得浸提液；

(3)粗制：将步骤(2)中获得的浸提液，浓缩至1:1(ml:g)，冷却至室温，获得浓缩液；

(4)精制：将步骤(3)中的浓缩液，加入85％的乙醇溶液，直至含醇量达到75％，4℃密闭冷藏24小时，滤过，滤液回收乙醇得到粗提液；

(5)将步骤(4)中获得的粗提液，加入90％的乙醇溶液，直至含醇量达到80％，4℃密闭冷藏24小时，过滤，滤液回收乙醇得到精制液，即所述苦瓜水提物。

实施例4抗抑郁效果测试

造模流程

首先选取一定数量的cd1小鼠作为攻击性小鼠，在正式实验前2-3周开始对其攻击性进行筛选。具体方法就是：每个饲养笼中饲养雄性和雌性两只周龄相近的cd1小鼠，一定时间内让cd1雄性小鼠产生领地意识；1周以后，将配对饲养的雌鼠分离出饲养笼，随机放入一只陌生的c57小鼠作为领地入侵者，如果cd1雄性小鼠在1min之内就开始对c57小鼠发动攻击，那么该cd1小鼠则被视为攻击性cd1小鼠。运用同样的方法筛选出所有需要的攻击性雄性cd1小鼠。正式实验前，选取雄性c57小鼠(7周)，随机分配成正常组和应激组，每组10只，对照组每2只一笼，其余均单笼饲养，给予正常饮食饮水一周充分适应环境。当实验开始时，提前分离cd1雌鼠，取模型组c57小鼠一只，直接放入陌生雄性cd1小鼠(8-9周)饲养笼中，使c57小鼠遭受雄性cd1小鼠持续性攻击约5-10min；然后将两只小鼠用带有密集小孔的透明塑料隔板隔开，使两只小鼠彼此仍能互视和闻嗅但是无法接触，运用这种方法持续到下次进行攻击前为止，完成该过程后即为第一天应激。第二天再将该c57鼠放入另一不同的cd1雄性鼠的笼中，使c57小鼠受到相同程度的应激；第三天再放入第三只cd1雄性鼠的笼中，同样使c57小鼠受到同样程度的应激。如此连续应激10天，并保证每天同一只c57小鼠受到不同cd1雄性鼠的攻击。在此期间，对照组和应激组c57小鼠均维持正常饮食饮水，而对照组则保持2只一笼，每天相互更换接触不同的小鼠。10天连续应激结束后即开始行为学测试。

实验动物

c57bl/6j小鼠(雄性，武汉大学附属中南医院实验动物中心提供)，8周龄，体重18～22g，饲养于标准环境(环境温度18-22℃，正常提供食物和水)，光照周期为12h。cd1小鼠(雄性，北京维通利华动物公司提供)，8-12周龄，体重22～28g，饲养于标准环境(环境温度18-22℃，正常提供食物和水)，光照周期为12h。

糖水偏好测试

进行持续4天的糖水偏好试验。在前2天，实验小鼠分别暴露于两瓶纯水和1％蔗糖溶液中。在第三天，食物和两个瓶子都被剥夺18个小时。在第4天，测试持续了6个小时，两个瓶子在测试前后称重。在测试期间没有进行药物治疗。

悬尾测试

c57bl/6j小鼠分别悬吊在离地面60厘米的地方，在6分钟的测试期间记录其静止时间。用胶带固定小鼠(离尾尖1厘米)。

pi3k活性检测

处死实验小鼠，立即解剖双侧海马。采用np-40裂解缓冲液收集海马蛋白。pi3k活性由pi3激酶测定试剂盒根据制造商的说明书检测。

促炎性因子含量检测

促炎细胞因子tnf-α,il-6和il-1β的浓度采用商用试剂盒检测。

蛋白表达含量检测

处死实验小鼠，立即解剖双侧海马。采用np-40裂解缓冲液收集海马蛋白。定量后,样品加入到10％sds中并分离,然后转移到pvdf膜。一抗孵育过夜，二抗孵育2小时，ecl显影。

统计分析

数据用±sem显示。使用spss13.0软件进行分析。两组间的比较采用单因素方差分析(anova)，p<0.05为显著差异。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。