负载明胶微纳米球的引导组织再生膜及其制备方法与流程

本发明涉及生物医学引导组织再生膜领域，具体地说，涉及一种负载明胶微纳米球的引导组织再生膜及其制备方法。

背景技术：

再生医学是国际科学界和医学界的热点，其特点是借助材料学、工程学、生物学和医学手段，修复或者重建人体功能性缺损的器官及组织，其产生与发展对人类健康水平和生活质量的提高具有极其重要的意义。使用生物膜引导组织再生的技术是近些年来日趋成熟的组织修复重建技术，由于其在骨组织再生和重建过程中的关键作用，已被广泛用于颌面外科整形和牙周病治疗。该技术的原理是将生物膜置于骨缺损的表面，通过生物膜的屏障作用，阻止成纤维细胞和上皮细胞向骨组织区域迁移和生长，维持缺损区的空间，以利于骨组织的再生。此外，修复或重建过程中，常需借助生物活性药物分子以促进局部组织细胞的生长、分化以及防止细菌感染的发生，同时需要从时间上和空间上精准控制这些药物分子的缓慢释放以保证药物的活性，从而优化药物作用效果并减少副作用。因此，设计和制备具有药物缓释功能的生物膜是实现组织修复重建的关键。

此外，生物膜还需具备生物相容性和生物可降解性，以避免组织修复或重建后取出生物膜的二次手术。丝素蛋白是从天然蚕丝中提取的一种具有良好生物相容性和生物可降解性的材料，其化学和物理特性完全符合临床要求，并被广泛用于生物医学材料领域。

静电纺丝制备的纳米纤维膜及其优异的纳米孔径结构，可高效阻隔成纤维细胞和上皮细胞的迁移，因此常用来制备组织再生引导膜。通过静电纺丝制备的丝素蛋白纳米纤维已被广泛用于组织再生引导膜领域。然而，药物从丝素蛋白静电纺丝纳米纤维上的释放难以精准控制。因此，需要将具有较强载药能力的生物活性明胶微纳米球添加到丝素蛋白纳米纤维中，以制备负载明胶微纳米球的丝素蛋白纳米纤维组织再生引导膜。

中国专利(申请号cn201310745878.3)公布了一种载药型引导组织再生膜及其制备方法，但该方法静电纺丝过程中使用有机溶剂，无法避免溶剂残留，限制了其作为生物医用材料的应用。

技术实现要素：

针对现有技术中的问题，本发明的目的在于提供一种负载明胶微纳米球的引导组织再生膜及其制备方法，以具有良好生物相容性和生物可降解性的丝素蛋白为原料，以具有较强生物活性和药物缓释功能的明胶微纳米球作为药物载体，制备工艺简单，成本低廉，适合工业化生产，具有良好的应用前景。

一方面，本发明提供了一种负载明胶微纳米球的引导组织再生膜，包括通过静电纺丝制成的纳米纤维膜，所述纳米纤维膜中含有明胶微纳米球，所述明胶微纳米球上负载有药物。

优选的，所述药物为万古霉素和/或粘菌素。

另一方面，本发明提供了上述的负载明胶微纳米球的引导组织再生膜的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，制备负载药物的明胶微纳米球溶液；

步骤2，制备丝素蛋白水溶液；

步骤3，将步骤1和步骤2中制备的溶液混合均匀得到混合溶液，并将所述混合溶液通过静电纺丝得到纳米纤维膜。

优选的：所述步骤2中还包括在所述丝素蛋白水溶液中加入水溶性聚合物，形成丝素蛋白-聚合物水溶液。

优选的：所述水溶性聚合物为pva或peo。

优选的：还包括步骤4，将步骤3中的纳米纤维膜水韧处理，后置于去离子水中洗脱水溶性聚合物并冷冻干燥。

优选的：还包括步骤5，将步骤4中制备的产品浸润到药物溶液中再次吸收药物，并冷冻干燥得到最终产品。

优选的：所述步骤1中包括先制备明胶微纳米球悬浮液，再将药物加入到微纳米球悬浮液中充分混合均匀并置于1～8℃的温度中，以使药物与明胶微纳米球充分结合得到负载药物的明胶微纳米球溶液。

优选的：所述步骤3中的静电纺丝的条件为电压15～25kv，推进速度为0.6～3ml/小时，接收距离为15～22cm。

另一方面，本发明提供了上述的负载明胶微纳米球的引导组织再生膜的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，制备明胶微纳米球溶液；

步骤2，制备丝素蛋白水溶液；

步骤3，将步骤1和步骤2中制备的溶液混合均匀得到混合溶液，并将所述混合溶液通过静电纺丝得到纳米纤维膜；

步骤4，将步骤3制备的纳米纤维膜水韧处理，冷冻干燥后浸润到药物溶液中吸收药物，并冷冻干燥。

本发明的一种负载明胶微纳米球的引导组织再生膜及其制备方法，以具有良好生物相容性和生物可降解性的丝素蛋白为原料，以具有较强生物活性和药物缓释功能的明胶微纳米球作为药物载体，制备工艺简单，成本低廉，适合工业化生产，具有良好的应用前景。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显。

图1是本发明的实施例1的一种负载明胶微纳米球的引导组织再生膜的扫描电镜图片；

图2是本发明的实施例2的一种负载明胶微纳米球的引导组织再生膜的透射电镜图片；

图3a-3b是本发明的实施例1的一种负载明胶微纳米球的引导组织再生膜的药物缓释功能示意图，其中图3a为24小时内的药物释放，图3b为从第2天起至第14天的累积药物释放(两天后的累计药物释放量是去除1天的释放量之后，剩余的药物释放量的累积)；

图4是人牙周膜细胞在实施例1中制备得到的一种负载明胶微纳米球的丝素蛋白纳米纤维引导组织再生膜上生长48小时后的扫描电镜图片；

图5是人牙周膜细胞在实施例1中制备得到的一种负载明胶微纳米球的丝素蛋白纳米纤维引导组织再生膜上的增殖，以dna的含量计量。

具体实施方式

现在将参考附图更全面地描述示例实施方式。然而，示例实施方式能够以多种形式实施，且不应被理解为限于在此阐述的实施方式。相反，提供这些实施方式使得本发明将全面和完整，并将示例实施方式的构思全面地传达给本领域的技术人员。在图中相同的附图标记表示相同或类似的结构，因而将省略对它们的重复描述。

在本发明的实施例中，提供了一种负载明胶微纳米球的引导组织再生膜的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，制备负载药物的明胶微纳米球溶液，包括：

步骤1.1，明胶微纳米球水溶液的制备：将明胶在加热条件下溶解于蒸馏水中，形成浓度为0.1～0.4g/ml,优选0.2g/ml的明胶水溶液。接着在其中加入丙酮去除明胶分子中的低分子量成分，丙酮与水的体积比为1:1。

去除丙酮后将明胶重新加热溶解于蒸馏水中，形成浓度为0.1～0.4g/ml,优选0.2g/ml的明胶水溶液，然后在高速搅拌下，将丙酮加入到明胶水溶液中以促进明胶微纳米球的形成，此时丙酮与水的体积比为3:1～4:1，滴加速度为3～4ml/min。

最后加入戊二醛交联形成稳定的微纳米球，戊二醛与明胶的质量比为11.8:100～1.48:100，形成的明胶微纳米球的直径为300～1200nm,平均600nm。离心水洗将明胶微纳米球分散在蒸馏水中得到其悬浮液。

步骤1.2，将药物加入到明胶微纳米球的悬浮液中，本发明实施例的药物包括抗生素或其他促进局部组织细胞的生长、分化以及防止细菌感染的药物，优选为万古霉素和/或粘菌素，更优选为万古霉素。

将药物加入到明胶微纳米球的悬浮液中，药物与明胶微纳米球的质量比为0.5:100～4:100，优选为1:100，作用时间为8～16小时，混合均匀后置于1～8℃中，优选为4℃中，震荡条件下使药物与明胶微纳米球充分结合形成稳定悬浮液。形成的负载药物的明胶微纳米球的直径优选为50～1000nm。

步骤2，制备丝素蛋白水溶液；

步骤2.1，将蚕茧加入到煮沸的浓度为0.01～0.05m(mol/l，即1.06～5.3mg/ml，优选为0.02m，2.12mg/ml)的碳酸钠溶液中脱胶，脱胶时间为20～60分钟。脱胶后使用蒸馏水冲洗并干燥，接着将上述脱胶干燥后的蚕丝加入到浓度为5～9.5m(mol/l，即434.225～825.023mg/ml)的溴化锂水溶液中溶解，溴化锂过量即可，处理时间3～6小时，处理温度50～70℃。

然后透析去除溴化锂并得到丝素蛋白的水溶液。透析所用透析膜截留分子量为30000～45000da，透析介质为蒸馏水，透析时间为40～72小时，形成的丝素蛋白水溶液的浓度为5-8wt％。

步骤2.2，加入水溶性聚合物，优选为pva(聚氧化乙烯)或peo(聚乙烯醇)，更优选为peo，形成丝素蛋白-聚合物水溶液(即模板溶液)。

将水溶性聚合物加入到上述丝素蛋白水溶液中，借助机械搅拌溶解水溶性聚合物，搅拌速度为50～200rpm，搅拌时间1～3小时，制备得到丝素蛋白:聚合物的质量比为1:9～1:2.5的丝素蛋白-聚合物水溶液。

步骤3，将负载药物的明胶微纳米球溶液与丝素蛋白-聚合物水溶液混合均匀得到混合溶液，此处的负载药物的明胶微纳米球溶液和丝素蛋白-聚合物水溶液没有具体的质量比，形成的混合溶液中的明胶微纳米球的质量分数优选为3.7～33wt％，将混合溶液通过静电纺丝得到纳米纤维膜。

优选将浓度为25～80mg/ml的负载药物的明胶微纳米球溶液加入到浓度为25-75mg/ml的丝素蛋白-聚合物水溶液中，搅拌混合均匀得到静电纺丝溶液。然后将静电纺丝溶液装载到注射器中，静电纺丝得到三维纳米纤维膜。静电纺丝的条件为电压15～25kv，推进速度为0.6～3ml/小时，接收距离为15～22cm。

步骤4，将纳米纤维膜水韧处理，后置于去离子水中洗脱水溶性聚合物并冷冻干燥。优选水韧处理的条件为真空条件下水蒸气处理18～24小时，去离子水洗脱时间为4～24小时。

步骤5，将步骤4制备的产品再次沉浸到药物溶液中吸收药物，药物浓度为4-20mg/ml，优选为10mg/ml，药物溶液淹没纳米纤维膜即可，纳米纤维膜作用时间为8～16小时，温度1～8℃，优选为4℃，震荡条件下使药物与纳米纤维膜及明胶微纳米球充分结合。

最后将负载药物的纳米纤维膜冷却干燥。

本发明实施例提供的一种负载明胶微纳米球的丝素蛋白纳米纤维引导组织再生膜的绿色制备方法，以蒸馏水为分散介质，由静电纺丝技术实现。

本发明的实施例先提取丝素蛋白并将其溶解在蒸馏水中，然后加入水溶性聚合物，优选为医用级聚乙烯醇添加剂制备静电纺丝模板溶液，接着将具有较强生物活性、生物相容性、以及药物缓释能力的负载药物(优选为万古霉素)的明胶微纳米球加入到模板溶液中，搅拌得到静电纺丝溶液，通过静电纺丝得到三维纳米纤维膜，再对纳米纤维膜进行简单水韧处理洗脱聚乙烯醇，最后将纳米纤维膜沉浸到药物溶液中吸收药物并冷冻干燥后得到最终产品。

在本发明实施例中，明胶微纳米球的加入不仅赋予丝素蛋白纳米纤维膜对生物活性药物分子在时间和空间上释放的可控性，而且增强了丝素蛋白纳米纤维膜的生物相容性，提高了丝素蛋白纳米纤维膜的生物活性；通过在去离子水中洗脱聚乙烯醇，暴露明胶微纳米球，提供细胞贴附锚点，提高组织细胞的粘附，减少聚乙烯醇引起的组织免疫反应；接着通过将纳米纤维膜沉浸到药物溶液中进行二次载药，提高纳米纤维膜的载药量，实现药物的两阶段释放，第一阶段释放大量药物杀死细菌，第二阶段缓慢释放药物抑制后续可能的细菌生长；制备得到的产品在生物医用材料和再生医学领域，特别是作为组织再生引导膜具有广阔的应用前景。

在本发明的另一实施例中，提供了一种负载明胶微纳米球的引导组织再生膜的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，制备明胶微纳米球溶液，包括：

将明胶在加热条件下溶解于蒸馏水中，形成浓度为0.1～0.4g/ml,优选0.2g/ml的明胶水溶液。接着在其中加入丙酮去除明胶分子中的低分子量成分，丙酮与水的体积比为1:1。

去除丙酮后将明胶重新加热溶解于蒸馏水中，形成浓度为0.1～0.4g/ml,优选0.2g/ml的明胶水溶液，然后在高速搅拌下，将丙酮加入到明胶水溶液中以促进明胶微纳米球的形成，此时丙酮与水的体积比为3:1～4:1，滴加速度为3～4ml/min。

最后加入戊二醛交联形成稳定的微纳米球，戊二醛与明胶的质量比为3:100～0.5:100。离心水洗将明胶微纳米球分散在蒸馏水中得到其悬浮液。

步骤2，制备丝素蛋白水溶液；

步骤2.1，将蚕茧加入到煮沸的浓度为0.01～0.05m(mol/l，即1.06～5.3mg/ml，优选为0.02m，2.12mg/ml)的碳酸钠溶液中脱胶，脱胶时间为20～60分钟。脱胶后使用蒸馏水冲洗并干燥，接着将上述脱胶干燥后的蚕丝加入到浓度为5～9.5m(mol/l，即434.225～825.023mg/ml)的溴化锂水溶液中溶解，溴化锂过量即可，处理时间3～6小时，处理温度50～70℃。

然后透析去除溴化锂并得到丝素蛋白的水溶液。透析所用透析膜截留分子量为30000～45000da，透析介质为蒸馏水，透析时间为40～72小时，形成的丝素蛋白水溶液的浓度为5-8wt％。

步骤2.2，加入水溶性聚合物，优选为pva(聚氧化乙烯)或peo(聚乙烯醇)，更优选为peo，形成丝素蛋白-聚合物水溶液。

将水溶性聚合物加入到上述丝素蛋白水溶液中，借助机械搅拌溶解水溶性聚合物，搅拌速度为50～200rpm，搅拌时间1～3小时，制备得到丝素蛋白:聚合物的质量比为1:9～1:2.5的丝素蛋白-聚合物水溶液。

步骤3，将明胶微纳米球溶液与丝素蛋白-聚合物水溶液混合均匀得到混合溶液，此处的明胶微纳米球溶液和丝素蛋白-聚合物水溶液没有具体的质量比，形成的混合溶液中的明胶微纳米球的质量分数优选为3.7～33wt％，将混合溶液静电纺丝得到纳米纤维膜。

优选将浓度为25～80mg/ml的明胶微纳米球溶液加入到浓度为25-75mg/ml的丝素蛋白-聚合物水溶液中，搅拌混合均匀得到静电纺丝胶体悬浮液。然后将静电纺丝胶体悬浮液装载到注射器中，静电纺丝得到三维纳米纤维膜。静电纺丝的条件为电压15～25kv，推进速度为0.6～3ml/小时，接收距离为15～22cm。

最后，将纳米纤维膜水韧处理，后置于去离子水中洗脱水溶性聚合物并冷冻干燥得到最终产品。优选水韧处理的条件为真空条件下水蒸气处理12～16小时，去离子水洗脱时间为3～18小时。

步骤4，将制成的纳米纤维膜沉浸到药物溶液中吸收药物，本发明实施例的药物包括抗生素或其他促进局部组织细胞的生长、分化以及防止细菌感染的药物，优选为万古霉素和/或粘菌素，更优选为万古霉素。

药物浓度为8-26mg/ml，优选为18mg/ml，药物溶液淹没纳米纤维膜即可，纳米纤维膜作用时间为10～20小时，温度1～8℃，优选为6℃，震荡条件下使药物与纳米纤维膜及明胶微纳米球充分结合。

最后将负载药物的纳米纤维膜冷却干燥即得到最终产品。

本发明的实施例通过对纳米纤维膜一步载药，赋予纳米纤维膜多阶段药物缓释功能，达到对药物释放的精准控制，即在短时间内释放大量的药物杀死细菌，后期在明胶微纳米球辅助作用下的长时间缓慢释放药物抑制可能的细菌生长，从而达到防治细菌感染的目的。

本发明的实施例的有益效果有：

(1)该方法以天然完全可降解材料为原料，制备工艺简单，条件温和，成本低廉，可以实现工业化生产，为蚕丝的高值化利用提供了技术支撑；

(2)本发明的实施例以蒸馏水为分散介质和静电纺丝溶剂，在静电纺丝过程中不使用任何有机溶剂，能真正实现绿色静电纺丝的产业化应用；

(3)本发明的实施例最终对peo/pva的洗脱，有利于暴露明胶微纳米球，为细胞贴附提供锚点，提高组织细胞的粘附性，减少组织免疫反应，促进组织再生；

(4)本发明制备的丝素蛋白纳米纤维膜具有良好的生物相容性和对生物活性分子药物释放的精准可控性，可避免因植入材料引起的细菌感染，能进一步促进组织细胞在材料上的贴附以及材料本身与组织细胞的整合，最终实现组织再生。

下面以附图并结合具体实施例描述本发明：

实施例1

步骤1.1，将5g带负电的明胶在加热条件下溶解于25ml蒸馏水中，形成溶度为0.2g/ml的明胶水溶液，接着加入25ml丙酮去除明胶分子中的低分子量成分。

去除丙酮后将明胶重新加热溶解于25ml蒸馏水中，然后在1200rpm高速搅拌下，将80ml丙酮以4ml/分钟的速度加入到明胶水溶液中促进明胶微纳米球的形成。接着加入74mg戊二醛交联形成稳定的微纳米球，水洗离心后将明胶微纳米球分散在蒸馏水中得到其悬浮液，调节浓度为80mg/ml。

步骤1.2，将1.6mg万古霉素加入到2ml明胶微纳米球的悬浮液(80mg/ml)中，混合均匀后置于4℃中，震荡16小时使药物与明胶微纳米球充分结合，调节浓度为80mg/ml。

步骤2.1，将10g蚕茧加入到1l浓度为4g/l的碳酸钠溶液中，煮沸40min脱去胶质，接着用蒸馏水润洗三次并晾干得到丝素蛋白。称取5g丝素蛋白加入到100ml的烧杯中，然后加入20ml浓度为800mg/ml的溴化锂溶液，接着将烧杯密封并置于60℃的恒温干燥箱中，使丝素蛋白完全溶解。

4小时后，使用30000da的透析膜，以蒸馏水为介质，将丝素蛋白溶液透析72小时，中间换四次蒸馏水。透析后，将丝素蛋白水溶液转移至50ml离心管中离心除去杂质，调节得到5w/v％(5g/100ml)的丝素蛋白水溶液。

步骤2.2，将1g聚乙烯醇(900kda)加入到8ml浓度为5w/v％的丝素蛋白水溶液中，室温搅拌溶解得到静电纺丝模板溶液，并调节浓度至75mg/ml。

步骤3，将2ml载药明胶微纳米球悬浮液加入到5ml模板溶液中，搅拌混合均匀形成静电纺丝溶液。将静电纺丝溶液加载到注射器中，在电压20kv，速度1.5ml/小时，接收距离20cm条件下进行静电纺丝制备得到三维纳米纤维膜。

步骤4，将纳米纤维膜置于真空干燥器中并在干燥器底部放置蒸馏水，抽真空后对三维纳米纤维膜水韧处理20小时，随后去离子水洗脱聚乙烯醇20小时并冷冻干燥。

步骤5，将纳米纤维膜再次沉浸到万古霉素溶液中吸收药物，药物浓度为4mg/ml，药物溶液淹没纳米纤维膜即可，纳米纤维膜作用时间为8小时，温度1℃，震荡条件下使药物与纳米纤维膜及明胶微纳米球充分结合。

最后将负载药物的纳米纤维膜冷却干燥。

样品如附图1中所示的扫描电镜图。

称取实施例1中制备的丝素蛋白纳米纤维膜10mg并置于1.5ml的eppendorf管(德国艾本德股份公司制备的试管中)中，接着加入1mlpbs缓冲液(磷酸缓冲盐溶液)，然后将样品置于37℃恒温箱中并震荡进行药物释放实验，设定5个平行样。

如图3a和图3b中所示，在6小时,1天，2天，3天，5天，7天，10天和14天的各个时间点，从eppendorf管中移取900μl上清液用于测定释放的药物，接着加入900μl的新鲜pbs缓冲液。本发明实施例使用反向高效液相色谱法测定不同时间点释放的万古霉素的量。将25μl的样品通过自动进样器加载到色谱柱中，使用磷酸铵/乙氰作为流动相(90/10，v/v)，在流速1ml/分钟、紫外光240nm条件下，结合浓度标准曲线测定释放的万古霉素的浓度，将各个时间点释放的万古霉素通过累加计算得到万古霉素从载药丝素蛋白纳米纤维膜上随时间释放的曲线。如图3a和图3b中所示，本发明的实施例能够精准控制药物的释放。

如图4中所示，通过检测人牙周膜细胞在实施例1制备得到的丝素蛋白纳米纤维膜上的形貌来评价本产品的生物活性和细胞相容性。

收集对数期生长的人牙周膜细胞，以20000细胞每孔的密度接种到含有丝素蛋白纳米纤维膜的48孔板上，加入500μl培养基，细胞培养板置于co2浓度为5％和温度为37℃的环境中培养。48小时后，使用2％的戊二醛将细胞固定，接着使用乙醇进行梯度干燥，干燥后对样品喷金并使用扫描电镜观察细胞形貌，如图4中所示，本发明的实施例具有良好的生物活性和细胞相容性。

如图5中所示，通过检测dna含量评价人牙周膜细胞在实施例1制备得到的丝素蛋白纳米纤维膜上的增殖。

收集对数期生长的人牙周膜细胞，以20000细胞每孔的密度接种到含有丝素蛋白纳米纤维膜的48孔板上，加入500μl培养基，细胞培养板置于co2浓度为5％和温度为37℃的环境中培养，分别在1天，4天，7天使用picogreendsdna试剂盒(双链dna荧光定量测定试剂盒)测定接种细胞的丝素蛋白纳米纤维膜上的dna含量。将接种细胞的丝素蛋白纳米纤维膜置于1ml蒸馏水中冷冻、融化反复三次裂解细胞释放dna，离心并将100μl上清液转移至96孔板中，加入100μl反应试剂并在暗处孵育10min，使用荧光微孔板检测仪测定荧光强度并计算dna含量。如图5中所示，本发明的实施例有利于细胞增殖。

实施例2

步骤1.1，将5g带正电的明胶在加热条件下溶解于25ml蒸馏水中，形成溶度为0.2g/ml的明胶水溶液，接着加入25ml丙酮去除明胶分子中的低分子量成分。

去除丙酮后将明胶重新加热溶解于25ml蒸馏水中，然后在1000rpm高速搅拌下，将85ml丙酮以3ml/分钟的速度加入到明胶水溶液中促进明胶微纳米球的形成，接着加入590mg戊二醛交联形成稳定的微纳米球，水洗离心后将明胶微纳米球分散在蒸馏水中得到其悬浮液，调节浓度为80mg/ml。

步骤1.2，将1.6mg万古霉素加入到2ml明胶微纳米球的悬浮液(80mg/ml)中，混合均匀后置于4℃，震荡16小时使药物与明胶微纳米球充分结合，调节浓度为80mg/ml。

步骤3，将200μl载药明胶微纳米球悬浮液加入到5ml实施例1中的模板溶液中，搅拌混合均匀形成静电纺丝胶体悬浮液。将胶体悬浮液加载到注射器中，在电压22kv，速度1.2ml/小时，接收距离20cm条件下进行静电纺丝制备得到三维纳米纤维膜。

步骤4，将纳米纤维膜置于真空干燥器中并在干燥器底部放置蒸馏水，抽真空后对三维纳米纤维膜水韧处理20小时，随后去离子水洗脱聚乙烯醇20小时。

步骤5，将纳米纤维膜再次沉浸到万古霉素溶液中吸收药物，药物浓度为20mg/ml，药物溶液淹没纳米纤维膜即可，纳米纤维膜作用时间为16小时，温度8℃，震荡条件下使药物与纳米纤维膜及明胶微纳米球充分结合。

最后将负载药物的纳米纤维膜冷却干燥。

样品如附图2中所示的透射电镜图。

实施例3

步骤1.1，将5g带负电的明胶在加热条件下溶解于50ml蒸馏水中，形成溶度为0.1g/ml的明胶水溶液，接着加入50ml丙酮去除明胶分子中的低分子量成分。

去除丙酮后将明胶重新加热溶解于50ml蒸馏水中，然后在900rpm高速搅拌下，将150ml丙酮以3ml/分钟的速度加入到明胶水溶液中促进明胶微纳米球的形成。接着加入300mg戊二醛(交联形成稳定的微纳米球，水洗离心后将明胶微纳米球分散在蒸馏水中得到其悬浮液，调节浓度为50mg/ml。

步骤1.2，将0.5mg粘菌素加入到2ml明胶微纳米球的悬浮液中，混合均匀后置于1℃中，震荡8小时使药物与明胶微纳米球充分结合，并调节浓度为25mg/ml，调节浓度为50mg/ml。

步骤2.1，将10g蚕茧加入到1l浓度为0.05m的碳酸钠溶液中，煮沸60min脱去胶质，接着用蒸馏水润洗三次并晾干得到丝素蛋白。称取5g丝素蛋白加入到100ml的烧杯中，然后加入20ml浓度为9.5m的溴化锂溶液，接着将烧杯密封并置于70℃的恒温干燥箱中，使丝素蛋白完全溶解。

6小时后，使用45000da的透析膜，以蒸馏水为介质，将丝素蛋白溶液透析72小时，中间换四次蒸馏水。透析后，将丝素蛋白水溶液转移至50ml离心管中离心除去杂质，调节得到8w/v％(8g/100ml)的丝素蛋白水溶液。

步骤2.2，将3.6g聚氧化乙烯(900kda)加入到5ml浓度为8w/v％的丝素蛋白水溶液中，室温搅拌溶解得到静电纺丝模板溶液，并调节浓度至25mg/ml。

步骤3，将2ml载药明胶微纳米球悬浮液加入到2ml模板溶液中，搅拌混合均匀形成静电纺丝溶液。将静电纺丝溶液加载到注射器中，在电压15kv，速度0.6ml/小时，接收距离15cm条件下进行静电纺丝制备得到三维纳米纤维膜。

步骤4，将纳米纤维膜置于真空干燥器中并在干燥器底部放置蒸馏水，抽真空后对三维纳米纤维膜水韧处理18小时，随后去离子水洗脱聚氧化乙烯4小时。

步骤5，将纳米纤维膜沉浸到万古霉素溶液中吸收药物，药物浓度为10mg/ml，药物溶液淹没纳米纤维膜即可，纳米纤维膜作用时间为10小时，温度4℃，震荡条件下使药物与纳米纤维膜及明胶微纳米球充分结合。

最后将负载药物的纳米纤维膜冷却干燥。

实施例4

步骤1.1，将8g带负电的明胶在加热条件下溶解于20ml蒸馏水中，形成溶度为0.4g/ml的明胶水溶液，接着加入20ml丙酮去除明胶分子中的低分子量成分。

去除丙酮后将明胶重新加热溶解于20ml蒸馏水中，然后在1500rpm高速搅拌下，将80ml丙酮以3ml/分钟的速度加入到明胶水溶液中促进明胶微纳米球的形成。接着加入200mg戊二醛交联形成稳定的微纳米球，水洗离心后将明胶微纳米球分散在蒸馏水中得到其悬浮液，调节浓度为50mg/ml。

步骤1.2，将4mg粘菌素加入到2ml明胶微纳米球的悬浮液中，混合均匀后置于8℃中，震荡16小时使药物与明胶微纳米球充分结合，并调节浓度为50mg/ml。

步骤2.1，将8g蚕茧加入到1l浓度为0.01m的碳酸钠溶液中，煮沸20min脱去胶质，接着用蒸馏水润洗三次并晾干得到丝素蛋白。称取5g丝素蛋白加入到100ml的烧杯中，然后加入20ml浓度为5m的溴化锂溶液，接着将烧杯密封并置于50℃的恒温干燥箱中，使丝素蛋白完全溶解。

3小时后，使用30000da的透析膜，以蒸馏水为介质，将丝素蛋白溶液透析40小时，中间换四次蒸馏水。透析后，将丝素蛋白水溶液转移至50ml离心管中离心除去杂质，调节得到8w/v％(8g/100ml)的丝素蛋白水溶液。

步骤2.2，将1.2g聚乙烯醇(900kda)加入到5ml浓度为8w/v％的丝素蛋白水溶液中，室温搅拌溶解得到静电纺丝模板溶液，并调节浓度至75mg/ml。

步骤3，将2ml载药明胶微纳米球悬浮液加入到2ml模板溶液中，搅拌混合均匀形成静电纺丝溶液。将静电纺丝溶液加载到注射器中，在电压25kv，速度3ml/小时，接收距离22cm条件下进行静电纺丝制备得到三维纳米纤维膜。

步骤4，将纳米纤维膜置于真空干燥器中并在干燥器底部放置蒸馏水，抽真空后对三维纳米纤维膜水韧处理24小时，随后去离子水洗脱聚乙烯醇24小时。

步骤5，将纳米纤维膜沉浸到万古霉素溶液中吸收药物，药物浓度为12mg/ml，药物溶液淹没纳米纤维膜即可，纳米纤维膜作用时间为10小时，温度5℃，震荡条件下使药物与纳米纤维膜及明胶微纳米球充分结合。

最后将负载药物的纳米纤维膜冷却干燥。

实施例5

步骤1.1，将20g带负电的明胶在加热条件下溶解于100ml蒸馏水中，形成溶度为0.4g/ml的明胶水溶液，接着加入100ml丙酮去除明胶分子中的低分子量成分。

去除丙酮后将明胶重新加热溶解于100ml蒸馏水中，然后在1500rpm高速搅拌下，将350ml丙酮以3.5ml/分钟的速度加入到明胶水溶液中促进明胶微纳米球的形成。接着加入400mg的戊二醛交联形成稳定的微纳米球，水洗离心后将明胶微纳米球分散在蒸馏水中得到其悬浮液，调节浓度为50mg/ml。

步骤1.2，将7.5mg万古霉素加入到5ml明胶微纳米球的悬浮液中，混合均匀后置于6℃中，震荡10小时使药物与明胶微纳米球充分结合，并调节浓度为60mg/ml。

步骤2.1，将5g蚕茧加入到1l浓度为0.03m的碳酸钠溶液中，煮沸40min脱去胶质，接着用蒸馏水润洗三次并晾干得到丝素蛋白。称取4g丝素蛋白加入到100ml的烧杯中，然后加入20ml浓度为6m的溴化锂溶液，接着将烧杯密封并置于60℃的恒温干燥箱中，使丝素蛋白完全溶解。

3小时后，使用40000da的透析膜，以蒸馏水为介质，将丝素蛋白溶液透析48小时，中间换四次蒸馏水。透析后，将丝素蛋白水溶液转移至50ml离心管中离心除去杂质，调节得到8w/v％(8g/100ml)的丝素蛋白水溶液。

步骤2.2，将1g聚氧化乙烯(900kda)加入到5ml浓度为8w/v％的丝素蛋白水溶液中，室温搅拌溶解得到静电纺丝模板溶液，并调节浓度至60mg/ml。

步骤3，将2ml载药明胶微纳米球悬浮液加入到4ml模板溶液中，搅拌混合均匀形成静电纺丝溶液。将静电纺丝溶液加载到注射器中，在电压20kv，速度2ml/小时，接收距离20cm条件下进行静电纺丝制备得到三维纳米纤维膜。

步骤4，将纳米纤维膜置于真空干燥器中并在干燥器底部放置蒸馏水，抽真空后对三维纳米纤维膜水韧处理20小时，随后去离子水洗脱聚氧化乙烯16小时。

步骤5，将纳米纤维膜沉浸到万古霉素溶液中吸收药物，药物浓度为8mg/ml，药物溶液淹没纳米纤维膜即可，纳米纤维膜作用时间为12小时，温度6℃，震荡条件下使药物与纳米纤维膜及明胶微纳米球充分结合。

最后将负载药物的纳米纤维膜冷却干燥。

实施例6

步骤1，将5g带负电的明胶在加热条件下溶解于50ml蒸馏水中，形成溶度为0.1g/ml的明胶水溶液，接着加入50ml丙酮去除明胶分子中的低分子量成分。

去除丙酮后将明胶重新加热溶解于50ml蒸馏水中，然后在900rpm高速搅拌下，将150ml丙酮以3ml/分钟的速度加入到明胶水溶液中促进明胶微纳米球的形成。接着加入25mg戊二醛(交联形成稳定的微纳米球，水洗离心后将明胶微纳米球分散在蒸馏水中得到其悬浮液，调节浓度为80mg/ml。

步骤2.1，将10g蚕茧加入到1l浓度为0.05m的碳酸钠溶液中，煮沸60min脱去胶质，接着用蒸馏水润洗三次并晾干得到丝素蛋白。称取5g丝素蛋白加入到100ml的烧杯中，然后加入20ml浓度为9.5m的溴化锂溶液，接着将烧杯密封并置于70℃的恒温干燥箱中，使丝素蛋白完全溶解。

6小时后，使用45000da的透析膜，以蒸馏水为介质，将丝素蛋白溶液透析72小时，中间换四次蒸馏水。透析后，将丝素蛋白水溶液转移至50ml离心管中离心除去杂质，调节得到8w/v％(8g/100ml)的丝素蛋白水溶液。

步骤2.2，将100mg聚氧化乙烯(900kda)加入到5ml浓度为8w/v％的丝素蛋白水溶液中，室温搅拌溶解得到静电纺丝模板溶液，并调节浓度至25mg/ml。

步骤3，将5ml明胶微纳米球悬浮液加入到5ml模板溶液中，搅拌混合均匀形成静电纺丝静电纺丝溶液。将静电纺丝溶液加载到注射器中，在电压15kv，速度0.6ml/小时，接收距离15cm条件下进行静电纺丝制备得到三维纳米纤维膜。

将纳米纤维膜置于真空干燥器中并在干燥器底部放置蒸馏水，抽真空后对三维纳米纤维膜水韧处理12小时，随后去离子水洗脱聚氧化乙烯3小时后得到纳米纤维膜。

步骤4，将步骤3制备的纳米纤维膜浸润到26mg/ml粘菌素水溶液中，混合均匀后置于8℃中，震荡20小时使药物与纳米纤维膜及明胶微纳米球充分结合，最后冷却干燥后制得最终产品。

实施例7

步骤1，将8g带负电的明胶在加热条件下溶解于20ml蒸馏水中，形成溶度为0.4g/ml的明胶水溶液，接着加入20ml丙酮去除明胶分子中的低分子量成分。

去除丙酮后将明胶重新加热溶解于50ml蒸馏水中，然后在1500rpm高速搅拌下，将200ml丙酮以3ml/分钟的速度加入到明胶水溶液中促进明胶微纳米球的形成。接着加入240mg戊二醛交联形成稳定的微纳米球，水洗离心后将明胶微纳米球分散在蒸馏水中得到其悬浮液，调节浓度为25mg/ml。

步骤2.1，将8g蚕茧加入到1l浓度为0.01m的碳酸钠溶液中，煮沸20min脱去胶质，接着用蒸馏水润洗三次并晾干得到丝素蛋白。称取5g丝素蛋白加入到100ml的烧杯中，然后加入20ml浓度为5m的溴化锂溶液，接着将烧杯密封并置于50℃的恒温干燥箱中，使丝素蛋白完全溶解。

3小时后，使用30000da的透析膜，以蒸馏水为介质，将丝素蛋白溶液透析40小时，中间换四次蒸馏水。透析后，将丝素蛋白水溶液转移至50ml离心管中离心除去杂质，调节得到8w/v％(8g/100ml)的丝素蛋白水溶液。

步骤2.2，将100mg聚乙烯醇(900kda)加入到5ml浓度为8w/v％的丝素蛋白水溶液中，室温搅拌溶解得到静电纺丝模板溶液，并调节浓度至75mg/ml。

步骤3，将5ml明胶微纳米球悬浮液加入到5ml模板溶液中，搅拌混合均匀形成静电纺丝胶体悬浮液。将胶体悬浮液加载到注射器中，在电压25kv，速度3ml/小时，接收距离22cm条件下进行静电纺丝制备得到三维纳米纤维膜。

将纳米纤维膜置于真空干燥器中并在干燥器底部放置蒸馏水，抽真空后对三维纳米纤维膜水韧处理16小时，随后去离子水洗脱聚乙烯醇18小时。

步骤4，将步骤3制成的纳米纤维膜浸润到8mg/ml粘菌素水溶液中，混合均匀后置于1℃中，震荡10小时使药物与明胶微纳米球及纳米纤维充分结合，最后冷却干燥后制得最终产品。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。