一种含犬间充质干细胞因子的滴眼液及其制备方法与流程

本发明涉及兽药领域，特别涉及一种滴眼液。

背景技术：

间充质干细胞(adiposemesenchymalstemcells,ad-msc)普遍存在于脂肪、骨髓、脐带、胎盘、羊水等多种组织或体液，来源广泛，较易分离，拥有自我更新，修复组织损伤，免疫调节等能力，还具有分化成表皮细胞的能力。

离体培养的间充质干细胞分泌物中含有大量活性成分，如干细胞生长因子(scf)、成纤维细胞生长因子(fgf)、表皮细胞生长因子(egf)、细胞集落刺激因子、胶原蛋白等80多种活性成分，其对促进角膜损伤恢复具有一定效果。

犬角膜损伤在犬眼睛严重损伤中占比至少一半以上，如犬角膜损伤未能及时治疗修复，其形成的瘢痕组织会导致视力大大减弱，而犬角膜损伤修复在目前还未有十分有效的治疗方案。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，提供一种含犬间充质干细胞因子的滴眼液，同时提供该滴眼液的制备方法。

本发明所采取的技术方案是：一种含犬间充质干细胞因子的滴眼液，其按质量百分比计由犬间充质干细胞培养液上清液40～55％、氯霉素0.15～0.28％、玻璃酸钠0.25～0.65％、表面活性剂3～8％、助表面活性剂1.5～5％和生理盐水余量组成。

其中，氯霉素具有抗菌作用，有助于在修复过程中减少继发细菌感染，为角膜修复提供良好修复环境；透明质酸具有抗炎、抗菌、保湿、缓解眼睛疲劳等作用，对干眼症等病症有良好缓解作用，且透明质酸有效提高了滴眼液使用舒适性，润滑性以及延缓药物在眼部停留时间，有助于滴眼液各物质对角膜的修复。

作为上述方案的进一步改进，所述犬间充质干细胞选自犬脂肪间充质干细胞、犬脐带间充质干细胞、犬胎盘间充质干细胞、犬骨髓间充质干细胞、犬羊水间充质干细胞中的其中一种。

作为上述方案的进一步改进，所述表面活性剂选自聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇800中的其中一种。

作为上述方案的进一步改进，所述助表面活性剂为1,2-丙二醇。

作为上述方案的进一步改进，所述犬间充质干细胞培养液上清液是犬间充质干细胞经细胞培养收集上清液，再经4000r/min离心20min，0.22μm滤膜过滤后所得。

本发明所采取的另一个技术方案是：一种如上所述的含犬间充质干细胞因子的滴眼液的制备方法，其包括如下操作步骤：

1)在25℃条件下，按质量百分比计将表面活性剂、助表面活性剂混合均匀，加入氯霉素，溶解后，加入生理盐水，混匀，0.22μm滤膜过滤，得混合液；

2)在25℃条件下，按质量百分比计将玻璃酸钠溶解于犬间充质干细胞培养上清液，再与步骤1)所得混合液充分混匀，得成品。

本发明的有益效果是：

本发明的犬间充质干细胞培养上清液含有多种活性细胞因子，具有促进角膜损伤修复、加快瘢痕组织的愈合速度、有效减少损伤后眼睛分泌物的生成等效果，且该复合配方使得滴眼液具有修复功能以外还具有优异的抗菌能力，有效减少了二次感染的风险，解决了目前犬眼睛角膜严重损伤而导致泪目、眼分泌物增多、羞光、瘢痕组织修复困难等修复不完全问题。

本发明不存在免疫排斥问题，具有强大修复能力，且使用干细胞的来源和用途更为广泛，治疗适用病症更广阔，有利于大规模工业化生产。

附图说明

图1是本发明实施例4对照组造模后荧光素钠试纸条染色钴蓝灯图；

图2是本发明实施例4实验组造模后荧光素钠试纸条染色钴蓝灯图；

图3是本发明实施例4空白组造模后荧光素钠试纸条染色钴蓝灯图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行具体描述，以便于所属技术领域的人员对本发明的理解。有必要在此特别指出的是，实施例只是用于对本发明做进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术熟练人员，根据上述发明内容对本发明作出的非本质性的改进和调整，应仍属于本发明的保护范围。同时下述所提及的原料未详细说明的，均为市售产品；未详细提及的工艺步骤或制备方法为均为本领域技术人员所知晓的工艺步骤或制备方法。

实施例1

一种含犬间充质干细胞因子的滴眼液，其按质量百分比计由犬脂肪间充质干细胞培养液上清液48％、氯霉素0.2％、玻璃酸钠0.45％、聚乙二醇4005％、1,2-丙二醇3.5％和生理盐水余量组成。

制备方法：

1)取犬腹部脂肪块3ml左右，使用含有10％双抗的pbs清洗后，使用灭菌眼科剪剪碎脂肪块至1mm大小，在37℃培养箱中使用ⅰ型胶原酶酶解40min，灭菌单细胞滤膜过筛，1200r/min离心5min去掉上清液，使用完全培养基重悬细胞，置于培养皿中添加适量完全培养基并置于5％二氧化碳培养箱中37℃培养，待细胞长至密度为80％左右传代，传至3～6代鉴定，取其培养上清液以4000r/min离心20min，0.22μm滤膜过滤后得犬脂肪间充质干细胞培养上清液，备用；

2)在25℃条件下，按质量百分比计将表面活性剂、助表面活性剂混合均匀，加入氯霉素，溶解后，加入生理盐水，混匀，0.22μm滤膜过滤，得混合液；

3)在25℃条件下，按质量百分比计将玻璃酸钠溶解于步骤1)所得的犬脂肪间充质干细胞培养上清液，再与步骤2)所得混合液充分混匀，4℃保存，得实施例1成品。

实施例2

一种含犬间充质干细胞因子的滴眼液，其按质量百分比计由犬胎盘间充质干细胞培养液上清液40％、氯霉素0.28％、玻璃酸钠0.25％、聚乙二醇6008％、1,2-丙二醇1.5％和生理盐水余量组成。

作为上述方案的进一步改进，所述犬间充质干细胞培养液上清液是犬间充质干细胞经细胞培养收集上清液，再经4000r/min离心20min，0.22μm滤膜过滤后所得。

制备方法：

1)取犬胎盘块3ml左右，使用含有10％双抗的pbs清洗后，使用灭菌眼科剪剪碎胎盘块至1mm大小，在37℃培养箱中使用ⅰ型胶原酶酶解40min，灭菌单细胞滤膜过筛，1200r/min离心5min去掉上清液，使用完全培养基重悬细胞，置于培养皿中添加适量完全培养基并置于5％二氧化碳培养箱中37℃培养，待细胞长至密度为80％左右传代，传至3～6代鉴定，取其培养上清液以4000r/min离心20min，0.22μm滤膜过滤后得犬脂肪间充质干细胞培养上清液，备用；

2)在25℃条件下，按质量百分比计将表面活性剂、助表面活性剂混合均匀，加入氯霉素，溶解后，加入生理盐水，混匀，0.22μm滤膜过滤，得混合液；

3)在25℃条件下，按质量百分比计将玻璃酸钠溶解于步骤1)所得的犬胎盘间充质干细胞培养上清液，再与步骤2)所得混合液充分混匀，4℃保存，得实施例2成品。

实施例3

一种含犬间充质干细胞因子的滴眼液，其按质量百分比计由犬羊水间充质干细胞培养液上清液55％、氯霉素0.15％、玻璃酸钠0.65％、聚乙二醇8003％、1,2-丙二醇5％和生理盐水余量组成。

作为上述方案的进一步改进，所述犬间充质干细胞培养液上清液是犬间充质干细胞经细胞培养收集上清液，再经4000r/min离心20min，0.22μm滤膜过滤后所得。

制备方法：

1)取犬羊水3ml左右，在37℃培养箱中使用ⅰ型胶原酶酶解40min，灭菌单细胞滤膜过筛，1200r/min离心5min去掉上清液，使用完全培养基重悬细胞，置于培养皿中添加适量完全培养基并置于5％二氧化碳培养箱中37℃培养，待细胞长至密度为80％左右传代，传至3～6代鉴定，取其培养上清液以4000r/min离心20min，0.22μm滤膜过滤后得犬脂肪间充质干细胞培养上清液，备用；

2)在25℃条件下，按质量百分比计将表面活性剂、助表面活性剂混合均匀，加入氯霉素，溶解后，加入生理盐水，混匀，0.22μm滤膜过滤，得混合液；

3)在25℃条件下，按质量百分比计将玻璃酸钠溶解于步骤1)所得的犬脂肪间充质干细胞培养上清液，再与步骤2)所得混合液充分混匀，4℃保存，得实施例3成品。

实施例4

选取4月龄幼犬3只，体重约为3.5kg左右，分为对照组、实验组和空白组。双眼皆为实验眼，采取强碱破坏角膜的方式造模并在相同条件下饲养治疗。

具体造模方式：按体重注射麻醉药，眼科麻醉药麻醉眼球(盐酸丙美卡因浸润麻醉)，使用眼睑撑开器，生理盐水清洗眼球，去除污物。烧碱滤纸贴眼10s，镊子取出马上生理盐水冲洗眼球1分钟。荧光素钠试纸条染色确定造模情况，钴蓝灯照射确定损伤情况。

其中实验组与对照组进行造模，空白组麻醉但角膜不作处理。实验组使用本发明实施例1成品进行治疗，对照组及空白组使用生理盐水滴眼。实验组氯霉素msc上清滴眼液点眼，每日2次，每次20μl。对照组及空白组生理盐水滴眼液点眼，每日2次，每次20μl。每日第一次点眼前记录评分，每日最后一次点眼记录评分情况，染色情况。造模后0h、第1天、第2天、第3天、第5天、第7天、第10天、第14天等进行角膜染色记录。对照组造模后0h、第1天、第5天、第7天、第14天荧光素钠试纸条染色钴蓝灯图如附图1(a1、b1、c1、d1、e1)所示；实验组造模后0h、第1天、第5天、第7天、第14天荧光素钠试纸条染色钴蓝灯图如附图2(a2、b2、c2、d2、e2)所示；空白组造模后0h、第1天、第5天、第7天、第14天荧光素钠试纸条染色钴蓝灯图如附图3(a3、b3、c3、d3、e3)所示。眼损伤标准评分表如下表1所示，眼睛损伤程度评价表如下表2所示；各组眼部损伤总评分表如下表3所示。

表1眼损伤标准评分表

表2眼睛损伤程度评价表

表3各组眼部损伤总评分表

根据表3可知，实验组损伤修复程度明显比对照组要更迅速。根据图1～3的b1、b2、b3可见，实验组角膜上皮细胞愈合速度明显比对照组迅速；根据图1～3的e1、e2、e3可见，实验组瘢痕组织明显比对照组面积要小。

上述实施例为本发明的优选实施例，凡与本发明类似的工艺及所作的等效变化，均应属于本发明的保护范畴。