用于治疗乙酰胆碱依赖性疾病的ACEFAPC的制作方法

发明领域

本发明涉及用于在预防和治疗与乙酰胆碱缺乏相关联的疾病中使用的acefapc(1-乙酰基-2-脂肪酰基-甘油磷酰胆碱)。本发明还涉及该acefapc分子和包含该acefapc分子的药物组合物，在该acefapc分子中fa表示含有至少14个碳原子的不饱和酰基。

现有技术

acedopc(1-乙酰基,2-二十二碳六烯酰基(docosahexaenoyl)-磷酯酰胆碱)是二十二碳六烯酸(dha)转运体，这是本领域技术人员公知的，其酶促合成描述于申请wo2008/068413中。它尤其已知为paf的血小板激活调节剂(wo2013037862a1)。还已经表明，相较于未酯化的dha或pc-dha，acedopc促进重建的血脑屏障的通路(hashemm.等,mol.neurobiol.2016；bernoud-hubacn.等,ocl,2017)。另一研究显示当在大脑中用作dha转运体的acedopc被注射到缺血性中风后的大鼠中时，其可防止脑部病变的扩散(chauveau等currneurovascres.2011；8:95-102和lagardem.等,ocl2016,23(1)d102)。虽然在大鼠模型中仅对局部缺血的治疗进行了体内研究，但认为使用acedopc作为脑部dha的供应者与与dha缺乏相关联的神经性疾病相关(hachemm.等,molneurobiol.,2016,53(5),3205-15)。已经提到dha与阿尔茨海默氏病的预防之间的联系，特别是阿尔茨海默氏患者存在dha缺乏的事实。因此，可认为dha转运体诸如acedopc有助于预防阿尔茨海默氏病但不能治疗阿尔茨海默氏病。当脂肪酸不是dha时，与dha转运相关的此假设通常不能延伸到acefapc分子。

虽然研究集中于dha转运和供应，但发明人现已证明acedopc和通常acefapc(其中fa是至少14个碳原子的不饱和脂肪酸的酰基)可迅速地将其乙酰基转移至包含醇(特别是伯醇)的底物。

基于此观察，发明人认为acedopc不再作为dha的载体，而是乙酰基的供应者。于是，由于acedopc还包含胆碱基团，所以发明人认为存在在胆碱和/或乙酰基来源贫乏的环境中从acedopc产生乙酰胆碱的可能性。acedopc还可乙酰化辅酶a(hscoa)的巯基以生成乙酰基-coa(其为生理反应乙酰基-coa+胆碱→乙酰胆碱+hscoa中的乙酰胆碱的前体)。

这已经通过多个表明acedopc和(更通常为)acefapc可用于治疗与乙酰胆碱缺乏相关联的疾病(所述治疗与任何dha供应无关)的实验证实。

发明的公开内容

因此，本发明涉及用于在预防和治疗与乙酰胆碱缺乏相关联的疾病中使用的通式(i)的acefapc

其中r表示含有至少14个碳原子的不饱和脂肪酸的酰基。

本发明还涉及式(i’)的acefapc

其中r’表示含有至少14个碳原子的不饱和脂肪酸的酰基(除了dha的酰基)，水合物、药学上可接受的盐或药学上可接受的溶剂合物。

本发明还涉及式(i’)的acefapc和acedopc的混合物，以及包含仅式(i’)的acefapc或式(i’)的acefapc与acedopc的混合物以及用于其施用的适当的赋形剂的药物组合物。

发明详述

因此，本发明涉及通式(i)的acefapc

其中r表示含有至少14个碳原子的不饱和脂肪酸的酰基，水合物、药学上可接受的盐或药学上可接受的溶剂合物。

它涉及用于在预防和治疗(更特别是治疗)与乙酰胆碱缺乏相关联的疾病中使用的式(i)的这些acefapc。

本发明还涉及用于预防和治疗患者中与乙酰胆碱缺乏相关联的疾病的方法，该方法包括向所述患者施用适当剂量的式(i)的acefapc或式(i)的acefapc的混合物。

本发明特别适于预防和治疗(更特别是治疗)人类中的这些疾病。特别地，当患者被确定为患有乙酰胆碱缺乏或可能发展此类缺乏时，将使用治疗。

与乙酰胆碱缺乏相关联的疾病包括

-与脑中乙酰胆碱缺乏相关联的阿尔茨海默氏病，

-神经肌肉传递的疾病，在该疾病中公认乙酰胆碱缺乏，尤其是神经肌肉病，特别是乙酰胆碱缺乏的肌病。

“乙酰胆碱缺乏”意指在个体的器官中测量的乙酰胆碱的量比不存在此缺乏的个体(或健康个体)中预期的正常量低得多。相较于健康个体的此大量降低导致器官的代谢不平衡或功能障碍。

因此，本发明涉及式(i)的acefapc或式(i’)的acefapc，或式(i)的acefapc的混合物，其用于在疗法中使用，更特别是用于治疗先前已经确定存在此类乙酰胆碱缺乏的患者中与乙酰胆碱缺乏相关联的疾病。

本发明还涉及用于治疗患者中与乙酰胆碱缺乏相关联的疾病的方法，该方法包括

a)选择已经确定乙酰胆碱缺乏的患者，且

b)向所述患者施用适当剂量的式(i)的acefapc或式(i’)的acefapc或式(i)的acefapc的混合物。

根据本发明的优选的实施方案，acefapc必须以当其到达必须产生乙酰胆碱以预防或补偿乙酰胆碱缺乏的靶器官时基本上“完整(intact)”的方式施用。基本上“完整”意指足够量的acefapc到达所述器官且未经修饰(特别是乙酰基水解的修饰)。

已经观察到在哺乳动物胃肠道中易于发生乙酰基损失(wo2017/006047)。因此，施用的优选方式将会是适于避开胃肠道的施用方式。这些方式包括通过静脉内、肌肉内、皮下、经皮和吸入途径施用。

对于式(i)的acefapc，其中r表示含有至少14个碳原子的不饱和脂肪酸的酰基，该含有至少14个碳原子的不饱和脂肪酸有利的是多于18个碳原子且多至多于22个碳原子的脂肪酸，特别是16、18、20、22和24个碳原子的脂肪酸。这些不饱和脂肪酸优选是多不饱和的。这些不饱和脂肪酸是本领域技术人员公知的。

它们特别地选自棕榈油酸、油酸、亚油酸(la)、α-或γ-亚麻酸(ala或gla)、花生四烯酸(ara)、二十碳五烯酸(epa)、二高-γ-亚麻酸、二十二碳六烯酸(dpa)、芥酸和神经酸。

优选地，式(i)的acefapc的基团r是选自油酸(ol)、亚油酸(la)、α-或γ-亚麻酸(ala或gla)、花生四烯酸(ara)、二十碳五烯酸(epa)和二十二碳六烯酸(dha)的多不饱和脂肪酸的酰基。优选地，式(i)的acefapc的r是选自花生四烯酸(ara)和二十二碳六烯酸(dha)的多不饱和脂肪酸的酰基。这些优选的产物分别被称为acearpc和acedopc。

对于式i’的acefapc，r’有利地选自除dha之外的上述定义的脂肪酸的酰基。

“水合物”是指以水合形式的化合物。实例包括半-水合物、一水合物和多水合物。

根据本发明的式(i)的或式(i’)的化合物的盐包括与酸或碱形成的盐，这取决于存在的取代基。这些盐包括药学上可接受的盐，诸如钠盐、钾盐和钙盐。

“溶剂合物”意指与一个或多个溶剂分子(特别是在化合物合成或纯化期间使用的溶剂分子，但是在纯化时不溶解)缔合的化合物的形式。所讨论的溶剂将是药理学上可接受的。

根据本发明，“适当剂量”或“适当量”意指增加乙酰胆碱的量且优选地恢复乙酰胆碱的量接近健康个体中预期的正常量的任何量。此适当剂量可服用一次或随着时间重复剂量的情况下服用若干次。就治疗的疾病是慢性病况而言，治疗可在患者的整个生命中进行，并根据疾病的进展调整适当剂量。

对于与乙酰胆碱缺乏相关联的疾病的预防和治疗，本领域技术人员可选择仅使用acefapc或使用acefapc的混合物。他们还可将acefapc或acefapc的混合物与针对与乙酰胆碱缺乏相关联的疾病的标准治疗组合。

本发明还涉及上述定义的式(i)的acefapc的混合物，该混合物包含基团r不同的所有比例的至少两种acefapc。根据本发明的优选的实施方案，混合物中的至少一种acefapc是acedopc，其是r为dha的酰基的式i的分子。因此，根据本发明的优选的混合物是以所有比例包含acedopc和至少一种式(i’)(其中r是选自油酸(ol)、亚油酸(la)、α-或γ-亚麻酸(ala或gla)、花生四烯酸(ara)和二十碳五烯酸(epa)，优选为ara的多不饱和脂肪酸的酰基)的acefapc的混合物。

acefapc的制备是本领域技术人员已知的，特别是根据申请wo2008/068413或wo2017/006047中描述的方法。根据本发明的acefapc的混合物可通过使两种经纯化的acefapc混合来制备，或通过由包含不饱和脂肪酸的混合物(例如预定比例的dha和ara的混合物)的不饱和磷酯酰胆碱的来源制备acefapc来制备。

根据本发明的acefapc混合物可包含多于两种不同的acefapc，尤其是当不饱和磷酯酰胆碱的来源包括多于两种不饱和脂肪酸的混合物时。

根据本发明的可用于制备acefapc(特别是acefapc混合物)的不饱和脂肪酸的来源是本领域技术人员公知的。实例是在sn-2位置包含60％油酰基(18:1)、30％亚油酰基(18:2)、8％花生四烯酰基(20:4)和2％二十二碳六烯酰基(22:6)的蛋黄磷酯酰胆碱(https://kewpie.co.jp)。

有利地，第一acefapc与第二acfapc的重量比的范围为1/99-99/1。尤其是当该第一acefapc是acedopc时，混合物中的acedopc含量的范围为1-10wt％或更多，混合物中acedopc含量可取决于不饱和磷酯酰胆碱的来源和其dha含量，以及混合物的纯化和浓缩的任何步骤。

下列相对比例的脂肪酸酰基将有利地存在于根据本发明的acefapc混合物中

根据本发明的特定的实施方案，此混合物中的相对二十二碳六烯酰基含量的范围可以为1％-10％。

本发明还涉及组合产物，或“试剂盒(kitofparts)”，用于同时或时间延迟的使用，其在一方面包含acedopc且在另一方面包含如上定义的式(i)的至少一种acefapc(其不是acedopc)。

本发明还涉及药物组合物，其包含acedopc的至少一种混合物和式(i’)的至少一种acefapc(式(i)的acefapc，其不是acedopc)以及至少一种药学上可接受的赋形剂。

本领域技术人员熟悉可用于制备药物组合物的药学上可接受的赋形剂，特别是药典标准中描述的那些药学上可接受的赋形剂。他们将优选地选择保护acefapc的结构以便其储存，特别是防止sn-1位置的水解导致乙酰基的损失的赋形剂。

该药物组合物优选地以适于通过静脉内、肌肉内、皮下、经皮或吸入途径施用的形式。

附图描述

图1描述在磷脂酶d的作用下由acefapc合成乙酰胆碱

图2显示通过质谱分析法检测乙酰胆碱和其主要碎片产物。

图3显示基于放射性dha的从血液到脑(大鼠)的穿过的百分比，其为时间的函数。(hashem等mol.neurobiol.2016)

实施例

使用acefapc(dha和油酸)作为乙酰胆碱的可能前体进行了若干实验，且通过放射色谱法或质谱分析法对acefapc进行最终测量。

实施例1：利用大鼠脑匀浆由acefapc合成乙酰胆碱

利用在乙酰基上标记有¹⁴c的acefapc在抗蛋白酶混合物(cocktail)和乙酰胆碱酯酶抑制剂的存在下在tris-hclph8缓冲液中孵育大鼠脑匀浆。在37℃进行孵育1小时。在用乙醇/氯仿混合物进行萃取后，分离并分析有机相和水相。在通过薄层色谱法分离后，用放射性读数器可视化产物。检测到对应于乙酰胆碱的移动的放射性斑点。因此，在由大脑磷脂酶d释放胆碱且使此胆碱与标记的乙酰基在acefapc的sn-1位置化学偶联和/或使由acefapc提供的放射性乙酰基与内源性胆碱偶联后，利用标记的acefapc孵育大鼠脑匀浆允许合成放射性乙酰胆碱。

实施例2：利用磷脂酶d由acefapc合成乙酰胆碱

在37℃在微生物(色褐链霉菌(streptomyceschromofuscus))磷脂酶d的存在下在tris-hclph8(脑ph)缓冲液中进行acefapc的无细胞孵育，持续1小时。孵育后，通过添加乙醇破坏磷脂酶d。离心后，分离含水乙醇混合物，并蒸发至干燥。将残余物溶解在混合物95％乙腈/5％甲酸铵中，然后通过离心过滤。通过质谱分析法在溶液中检测到乙酰胆碱。基于其分子量(146)和其主要碎片产物的分子量(87：对应于基团ch3-coo-ch2-ch2-的主离子)检测乙酰胆碱(图2)。

在这些无细胞实验中，使用两种底物，考虑到sn-2位置中的酰基的最低不饱和度，即油酰基(r2-coo-，图1)：aceoipc，且考虑到具有二十二碳六烯酰基的最高不饱和度：对于aceoipc，大约5％的释放的胆碱被转化为乙酰胆碱。对于此转化达到36％。在实验的此阶段中的此差异的原因是未知的。然而，可假设如果sn-2位置受阻较少，则胆碱与乙酰基的缀合更好，相较于油酰基(具有单个双键)，二十二碳六烯酰基(具有6个双键)就是这种情况，因为具有6个双键的酰基链的折叠远大于单个双键的折叠。对于含有多不饱和酰基的acefapc，诸如二十二碳六烯酰基和花生四烯酰基(尚未测试)(脑中两种最重要的酰基)，此结果特别令人鼓舞。

还在37℃在等分子量的溶解于tris-hclph8缓冲液中的氯化胆碱的存在下进行acefapc的无细胞孵育，持续1小时，同时震荡。在氮气下蒸发至干燥后，将残留物溶解于混合物95％乙腈/5％甲酸铵中。如先前描述的，在离心过滤后，通过质谱分析法测量乙酰胆碱。

这些实验显示在磷脂酶d(其从acefapc中释放胆碱)存在下或在外源性胆碱的存在下孵育acefapc允许合成乙酰胆碱。

乙酰胆碱的两个组成基团(乙酰基和胆碱)对同一个分子的接近度(相隔大约1nm)足以促进它们以相对于同一细胞内的距离(以μm范围计的距离)缀合成终产物，这在此接近度的反应物所涉及的所有生化过程中是接受的。

通过图1中所示的反应总结的此接近度。

结果证实了在大脑磷脂酶d的作用下使acefapc转化为乙酰胆碱的作用机制的假设。

实施例3：大鼠脑中的acedopc转运(hashem等2016)

将在二十二碳六烯酰基残基上标记有¹⁴c的acedopc注射到多只小鼠的血流中。在1h、24h和48h后，对大鼠脑进行分析以定位不同脂质区室中的放射性。对于acedopc，其放射性从1小时后注射总量的80％下降，然后24小时后的30％和48小时后的10％(图3)。这些结果证实当注射到血流中的acedopc到达脑(其在此处经代谢，特别是通过形成乙酰胆碱时其乙酰基残基损失的代谢)时，其是基本“完整的”。

参考文献

-wo2013037862

-wo2008/068413

-bernoud-hubacn.etal.,ocl2017,24(2)d205

-hashemm.etal.,molneurobiol.2016,53(5),3205-15

-lagardem.etal.,ocl2016,23(1)d102