罗丹宁衍生物在治疗代谢性疾病中的应用的制作方法

本发明涉及罗丹宁衍生物在治疗代谢性疾病中的应用。

背景技术：

肥胖症是一种由多种因素引起的慢性代谢性疾病，以体内脂肪细胞的体积和细胞数增加致体脂占体重的百分比异常增高并在某些局部过多沉积脂肪为特点。目前的抗肥胖药物主要是通过减少脂肪的吸收或抑制食欲来限制能量摄入，然而临床的效果还不是很明显，而且有副作用。临床上还没有通过增加能量的利用来治疗肥胖的药物，通过增加褐色脂肪组织bat的产热功能将身体的能量以热能的形式消耗，可以作为治疗肥胖及相关代谢型疾病的靶点。

技术实现要素：

本发明提供罗丹宁衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防代谢性疾病中的应用。

本发明的罗丹宁衍生物可具有下式i所示的结构：

式中，

r¹选自苯基或苯基-c1-c4烷基，其中所述苯基任选被1或2个选自-cooh、c1-c4烷基、c1-c4烷基羧基、羟基、-so3h和-c1-c4烷基-h2po3的取代基取代；

r²选自c1-c4烷基、c3-c8环烷基和任选被1或2个选自羟基、c1-c4烷基、c1-c4烷氧基、硝基和卤素取代的苯基。

在某些实施方案中，式i中，r¹选自：

在某些实施方案中，式i中，r²选自：

在某些实施方案中，式i中，r¹选自：

r²选自：

在某些实施方案中，式i中，r¹选自：

r²为苯基。

在某些实施方案中，所述罗丹宁衍生物为bml-260：

在某些实施方案中，本发明提供式i所示的罗丹宁衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防肥胖及肥胖相关的疾病的药物中的应用。

在某些实施方案中，本发明提供式i所示的罗丹宁衍生物或其药学上可接受的盐在制备抑制对象体重增加、降低体脂含量和/或改善对象代谢的产品中的应用。

本发明还提供一种药物组合物，该药物组合物含有第一活性成分、第二活性成分以及药学上可接受的载体，其中，所述第一活性成分为本发明式i化合物或其药学上可接受的盐；所述第二活性成分为不同于第一活性成分用于治疗肥胖及肥胖相关的疾病的药物。

本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物含有第一活性成分、第二活性成分和药学上可接受的载体，其中，所述第一活性成分为下式化合物或其药学上可接受的盐：

第二活性成分为不同于第一活性成分用于治疗肥胖及肥胖相关的疾病的药物。

本发明还提供本文所述式i化合物或式ii化合物或bml-260作为先导化合物在制备用于治疗代谢性疾病如肥胖及肥胖相关疾病的药物中的应用。

附图说明

图1：bml-260处理1天、2天、3天的成熟褐色脂肪细胞gfp荧光强度的代表性图片(左图)和对ucp1的蛋白免疫印迹检测(右图)。比例尺：200μm。

图2：bml-260处理1天、2天、3天的成熟褐色脂肪细胞ucp1的mrna表达水平，相比于阴性对照组有显著性上调，并随着处理时间的增加而增加。bml-260处理3天的实验组ucp1的mrna表达水平与阳性对照iso处理组近似。

图3：从分化第1天加bml-260处理，直到第10天收样的实验组，以及对照组的gfp荧光强度的代表性图片(上图)；ucp1及其密切关联的转录因子的实时荧光定量pcr结果(下图)。比例尺：200μm。

图4：仅诱导分化阶段用bml-260处理的情况下，各组gfp荧光强度的代表性图片。比例尺：200μm。

图5：依据gfp荧光强度进行流式分选后，获得的由dmso或bml-260处理3天后的gfp⁺细胞线粒体活性(apc强度)分析(左图)。dmso及bml-260处理3天的成熟褐色脂肪细胞的电镜图片(右图，ld代表脂滴，m代表线粒体)。比例尺：上图2μm，下图0.5μm。

图6：dmso和bml-260处理3天的褐色脂肪细胞的mitodna/nudna结果(左图)，而atp的产生有显著性下降(右图)。

图7：dmso或bml-260处理5天的成熟白色脂肪细胞的实时荧光定量pcr结果(左图)和蛋白免疫印迹结果(右图)。

图8：jsp-1蛋白表达分析(左图)和不同处理的白色脂肪细胞的ucp1蛋白表达分析(右图)。

图9：rna测序分析结果。

图10：褐色脂肪细胞的免疫印迹检测结果。

图11：connectivemap分析的图解和结果。

图12：不同处理组gfp荧光强度的代表性图片(左图)和ucp1蛋白表达水平检测(右图)。比例尺：250μm。

图13：原位注射后小鼠皮下白色脂肪组织ucp1蛋白表达。

图14：bml-260注射组小鼠在冷刺激中有着较高的直肠温度(左图)。体重有下降趋势(中间的图)，而皮下白色脂肪组织(iwat)的重量有明显下降(右图)。

图15：从苏木精伊红染色(上排)可以看出，bml-260注射组的iwat有明显的褐化表型，具有更小的脂滴；并且有显著性增强的ucp1表达(下排)。

图16：bml-260注射组的p-stat3和p-creb蛋白信号，与对照组相比，有显著性提高。说明bml-260能直接或间接激活stat3和creb信号通路，是下游激活ucp1的部分原因。

图17：rna测序分析结果。go富集分析中(左图)，bml-260注射组的皮下白色脂肪组织中显著性上调的基因富集在肌细胞分化，肌结构发育，肌系统过程调控等生理过程中，这与白色脂肪组织中ucp1⁺的细胞有平滑肌类特征一致。并且，热图显示(右图)bml-260注射组也有许多产热基因显著性上调。

具体实施方式

应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。

本发明从褐色脂肪细胞和白色脂肪细胞这两个层面的体外实验，以及小鼠原位注射的体内实验探究，首次揭示罗丹宁衍生物可以激活stat3、creb和ppars信号通路，显著性提高ucp1的表达，增强线粒体氧化磷酸化基因表达，有效提高产热，可用于治疗代谢性疾病，尤其是受益于机体非颤抖性产热的代谢性疾病。可基于本发明的发现对罗丹宁的化学结构进行修饰或改造，制备出治疗或预防代谢性疾病，尤其是受益于机体非颤抖性产热的代谢性疾病的药物。本发明公开的式i和式ii化合物，包括bml-260化合物可作为先导化合物(leadcompound)，经由改造和修饰而获得治疗或预防代谢性疾病的药物。

本发明的罗丹宁衍生物通常可具有下式i所示的结构：

式中，r¹选自苯基或苯基-c1-c4烷基，其中所述苯基任选被1或2个选自-cooh、c1-c4烷基、c1-c4烷基羧基、羟基、-so3h和-c1-c4烷基-h2po3的取代基取代；r²选自c1-c4烷基、c3-c8环烷基和任选被1或2个选自羟基、c1-c4烷基、c1-c4烷氧基、硝基和卤素取代的苯基。

优选的r¹为被羧基和任选的羟基取代的苯基。优选地，r¹是间位或对位被羧基取代的苯基。

优选的r²为c3-c8环烷基和任选被硝基、卤素或c1-c4烷基取代的苯基；优选地，取代发生在对位。

在某些实施方案中，适用于本发明的罗丹宁衍生物具有下式ii所示的结构：

式中，ra为羧基，rb为h、硝基、卤素或c1-c4烷基。优选地，ra在对位或间位；优选地，rb在对位或间位。

更优选的，该罗丹宁衍生物是bml-260，其结构式如下所示：

可采用常规的方法合成罗丹宁衍生物。例如，可参照neils.cutshall等(bioorganic&medicinalchemistryletters15(2005)3374－3379)公开的方法合成罗丹宁衍生物。也可从市售途径购买获得罗丹宁衍生物。

本发明提供罗丹宁衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防代谢性疾病，尤其是肥胖及肥胖相关的疾病的药物中的应用。在某些实施方案中，本发明所述的代谢性疾病是受益于机体非颤抖性产热的代谢性疾病，包括肥胖及肥胖相关疾病。

本文中，肥胖是一种慢性代谢性疾病，以体内脂肪细胞的体积和细胞数增加致体脂占体重的百分比异常增高并在某些局部过多沉积脂肪为特点。通常，可以体质指数(bmi)来评价对象是否属于肥胖：bmi＝体重(千克)/身高(米)的平方。如果bmi大于30，则认为对象肥胖。或者，也可采用腰围(wc)或腰臀比(whr)来判断对象是否肥胖。肥胖除脂肪在体内贮存量多外，还有一种肥胖是体脂分布在内脏和腹壁，表现为大腹便便，被称之为向心性肥胖或腹部肥胖。腰围男性超过94cm，女性超过80cm，可作为肥胖的标准；腰臀比男性超过0.9，女性超过0.8可视为中心性肥胖。

本文中，肥胖相关的疾病包括但不限于2型糖尿病、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、低高密度脂蛋白胆固醇血症、高尿酸血症(通风)、冠心病、高血压、胆石症、脂肪肝、肥胖性低通气综合征、肺心综合征、骨关节炎、骨质疏松和内分泌失调等。在某些实施方案中，肥胖相关的疾病为肥胖导致的代谢性疾病，如2型糖尿病、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、低高密度脂蛋白胆固醇血症、高尿酸血症、脂肪肝等。

本文中，卤素包括f、cl、br和i，烷基包括直链和支链烷基。

本文中，药学上可接受的盐指保留了母体化合物的生物效力和性质的那些盐。这些盐包括：通过母体化合物的游离碱与无机酸或有机酸反应得到的酸加成盐，无机酸的实例包括盐酸、氢溴酸、硝酸、磷酸、硫酸和高氯酸等，有机酸的实例包括乙酸、草酸、(d)或(l)苹果酸、马来酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸等。优选盐酸或(l)-苹果酸；或当母体化合物中存在的酸质子被金属离子(例如碱金属离子，碱土离子或铝离子)置换形成的盐，或与有机碱(如乙醇胺，二乙醇胺、三乙醇胺、三羟甲基氨基甲烷、n-甲基葡糖胺等)形成的配位化合物。

本文中，“药物组合物”是含有本文所述的罗丹宁衍生物或其药学上可接受的盐以及生理上/药学上可接受的载体和赋形剂的一种组合物。“生理上/药学上可接受的载体”是指对有机体无明显刺激作用，而且不会损害所服用罗丹宁衍生物或其药学上可接受的盐的生物活性及性能的那些载体和稀释剂。“生理上/药学上可接受的赋形剂”是指加到药物组合物中进一步有利于罗丹宁衍生物或其药学上可接受的盐的服用的惰性物质。赋形剂的非限制性实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各类淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。

药物组合物中罗丹宁衍生物或其药学上可接受的盐以治疗有效量或预防有效量存在。有效量是足以改善或以某些方式减轻与疾病有关的症状的给药量。给药量是有效地改善或消除一个或多个病症的药量，可根据对象的年龄、性别、身体状态等由本领域普通技术人员加以确定。给药量也许可治愈疾病，但是给药通常是为了改善疾病的症状。一般需要反复给药来实现所需的症状改善。通常，单位口服剂量可以包括约0.01到50毫克，最好是约0.1到10毫克的罗丹宁衍生物或其药学上可接受的盐。单位剂量可给予一次或多次，例如，每天为一片或多片，每片含有约0.01到50毫克的罗丹宁衍生物或其药学上可接受的盐。

本发明的药物组合物可被配制成任何合适的剂型，用于口服、静脉注射、局部或外用给药。

在某些实施方案中，本发明的药物组合物中用于治疗或预防代谢性疾病如肥胖或肥胖相关疾病的活性成分除本发明所述的罗丹宁衍生物或其药学上可接受的盐外，还含有其它的治疗肥胖或肥胖相关疾病的药物，如现有已知的其它减肥药物或治疗2型糖尿病、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、低高密度脂蛋白胆固醇血症、高尿酸血症(通风)、冠心病、高血压、胆石症、脂肪肝、肥胖性低通气综合征、肺心综合征、骨关节炎、骨质疏松和/或内分泌失调的药物(指活性成分)。

本文中，产品指除药物以外的其他产品，例如食品或保健品。例如，对于高脂饮食对象，可在其饮食中加入适量的罗丹宁衍生物或其药学上可接受的盐，由此可起到预防肥胖或肥胖相关疾病的作用。当然，食品或保健品中罗丹宁衍生物或其药学上可接受的盐的量应当予以控制，这可由本领域技术人员采取常规手段加以确定。

在某些实施方案中，本发明还提供肥胖或肥胖相关疾病的治疗或预防方法，所述方法包括给予需要的对象治疗或预防有效量的罗丹宁衍生物或其药学上可接受的盐或其药物组合物的步骤。优选的是，所述罗丹宁衍生物或其药学上可接受的盐如本文式i或ii所示，或者为bml-260。

本文中，对象为哺乳动物，尤其指人。

还包括的是用于治疗或预防代谢性疾病，尤其是肥胖或肥胖相关疾病的罗丹宁衍生物或其药学上可接受的盐，尤其是本文所述的式i化合物或其药学上可接受的盐，或式ii化合物或其药学上可接受的盐，或bml-260或其药学上可接受的盐。

本发明还提供本文所述式i化合物或式ii化合物或bml-260作为先导化合物在制备用于治疗代谢性疾病如肥胖及肥胖相关疾病的药物中的应用。应理解的是，此类应用中，所述化合物为被改造的对象，可以是最终成药中的活性成分的制备起始物，也可以是最终成药中的活性成分制备过程中的中间产物。所制备得到的活性成分也应是罗丹宁的衍生物。

下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非意图限制本发明的范围。实施例中所用到的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。

实施例1、体外验证

1)bml-260可以促进成熟的褐色脂肪细胞ucp1的表达

实验步骤：利用已经构建成功的ucp1-2a-gfp原代褐色脂肪细胞(在细胞原位ucp1终止密码子后插入2a-gfp序列，使得gfp的表达能一定程度地反应内源ucp1蛋白的表达水平，插入的2a-gfp序列为：atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagatt，seqidno:1)，在分化的不同阶段加入bml-260处理不同时间。共设计了三种化合物处理方式：在第1天加入bml-260(10μm)处理10天(更换培养基时重新加入10μm的bml-260)；在分化的第7天(成熟的褐色脂肪细胞阶段)加入bml-260(10μm)分别处理1天、2天、3天；仅在分化的第1至3天(诱导分化阶段)进行bml-260(10μm)处理，到第10天收样。这3种不同的处理情况下，以dmso作为阴性对照，iso(sigma)作为阳性对照(仅在收样前1天加入)，通过肉眼观察绿色荧光蛋白gfp的荧光强度来判断ucp1的表达情况，同时通过蛋白免疫印迹法(westernblot)来检测ucp1蛋白的表达情况，即先用ripa裂解液(millipore)提取细胞蛋白质，跑sds-page胶分离蛋白，封闭，依次孵育一抗、二抗，最后经底物化学发光而得到蛋白表达情况。并且，还通过rt-qpcr来检测ucp1及其密切关联的转录因子的基因表达情况，具体做法是：trizol(thermofisher)提取细胞rna，试剂盒(takara)反转录rna，用sybrgreen(abi)在7900仪器(abi)上实现扩增和荧光实时定量检测。

实验结果如图1-4所示。如图1所示，随着bml-260处理时间的加长，gfp的荧光强度也越来越强，ucp1的蛋白表达逐渐增加。bml-260处理3天的实验组的gfp荧光强度和蛋白表达接近阳性对照iso处理组。如图2所示，bml-260分别处理1天、2天、3天的成熟褐色脂肪细胞ucp1的mrna表达水平相比于阴性对照组有显著性上调，并随着处理时间的增加而增加。bml-260处理3天的实验组ucp1的mrna表达水平与阳性对照iso处理组近似。如图3所示，从分化第1天加bml-260处理到第10天收样的实验组gfp荧光强度显著增加，并有显著性上调的ucp1表达，均与阳性对照iso组一致。bml-260处理组ucp1表达相关的标志基因pparα，pgc1α和cidea也有显著性上调。图4显示，仅诱导分化阶段用bml-260处理时不能诱导褐色脂肪细胞的ucp1表达，结合图1-3，说明bml-260主要对成熟褐色脂肪细胞发挥作用。

2)bml-260能增加褐色脂肪细胞的线粒体活性

实验步骤：ucp1-2a-gfp原代褐色脂肪细胞分化至第7天，再加入bml-260或dmso处理3天后，进行以下线粒体功能相关的实验：

1、活细胞进行远红外的线粒体探针染色，通过gfp荧光信号流式分选，选出的gfp+褐色脂肪细胞进一步开展apc强度分析，从而实现线粒体活性检测。

2、收取细胞样品，戊二醛固定，再制作成满足电镜观察的片子，电镜观察拍摄。

3、收取细胞样品，提取基因组dna，pcr扩增线粒体dna(mitodna)和核dna(nudna)，同时借助荧光染料侦测每次pcr循环后产物总量，实现mitodna/nudna比例的计算，从而获得线粒体dna的相对拷贝数，明确线粒体的相对数量。

4、运用试剂盒(abcam)检测细胞内atp的积累。

实验结果如图5和6所示。如图5所示，bml-260处理组具有更多gfp荧光强度较强的细胞(左图)，并且这些细胞相较于dmso组有更强的apc信号，即更多的活性线粒体(中间的图)；此外bml-260处理组有更小的脂滴，同时线粒体数目更多、形态更大(右图)。如图6所示，bml-260处理组的mitodna/nudna结果有显著性上调，说明细胞内线粒体数目更多(左图)；而atp的产生有显著性下降(右图)，说明ucp1上调带来的能量解偶联，减少了atp产生。

3)bml-260能诱导白色脂肪细胞的褐化

实验步骤：利用已经构建成功的ucp1-2a-gfp原代白色脂肪细胞，在分化的第7天(成熟的白色脂肪细胞阶段)开始用dmso或bml-260(10μm)处理5天，5天后收取细胞，提取rna，反转录成cdna，进行rt-qpcr来检测ucp1及白色脂肪褐化相关的标记基因，如pparα，pgc1α。同时，提取细胞的蛋白质，再次通过蛋白免疫印迹法(westernblot)检测ucp1蛋白的表达情况。

实验结果如图7所示。结果显示，相较于dmso处理，bml-260能从mrna和蛋白水平显著性提高ucp1的表达，同时白色脂肪褐化的标记基因pparα，pgc1α也有明显上调。

4)bml-260的作用不依赖jsp-1

实验步骤：作为罗丹宁的衍生物，bml-260最初被设计为jsp-1的抑制剂，而jsp-1蛋白由基因dusp22编码。所以，设计靶向小鼠dusp22的grna(5’–atcctgccgggcctgtacat-3’，seqidno:2)，插入lenti-crisprv2(addgene)质粒中，包装成慢病毒，感染原代褐色脂肪细胞，而实现jsp-1的敲除。分化敲除了jsp-1的原代褐色脂肪细胞，直到第10天收样。同时，在分化的第7天加dmso或bml-260，或第9天加iso，也直到第10天收样，提取蛋白，做蛋白免疫印迹。

实验结果如图8所示。左图显示，crispr-dusp22的sgrna敲除效率很高。不同处理的白色脂肪细胞的ucp1蛋白表达分析结果显示(右图)，dusp22的敲除没有提高ucp1的表达，并且也不影响bml-260和iso对ucp1的诱导作用，说明bml-260对脂肪细胞ucp1激活的作用不依赖jsp-1蛋白。

5)bml-260上调褐色脂肪细胞中产热相关的基因

实验步骤：ucp1-2a-gfp原代褐色脂肪细胞分化至第7天，再加入bml-260或dmso或阳性对照iso处理1天后，收取细胞提rna，进行rna测序(中科院计算生物学研究所量化平台)与分析。

实验结果如图9所示。从go富集分析上可以看出(上图)，与线粒体活性增加的表型一致，bml-260的处理能显著性上调氧化磷酸化、脂肪酸氧化和线粒体功能相关的基因。与iso处理的细胞相比，虽然两者都能促进ucp1的显著上调，但是从聚类分析上来看(左下图)，bml-260处理组还是有着明显不同的基因表达。韦恩图(右下图)可以看到，有1214个基因仅在bml-260处理组显著性上调，尤其富集在编码电子传递链中线粒体复合体的基因。

6)bml-260的作用是部分地通过激活creb，stat3和ppar信号通路来实现的实验步骤：ucp1-2a-gfp原代褐色脂肪细胞分化至第7天，再加入bml-260或dmso处理1天或3天后，收取细胞提取蛋白，做蛋白免疫印迹，检测一些蛋白的磷酸化水平。选取之前rna测序结果中显著性上调和下调的各200个基因，转换成人的同源基因，在connectivemap网站进行分析，得到可能与bml-260处理有相似基因特征的化合物或基因。另外，在褐色脂肪细胞分化至第7天时，同时加ppars抑制剂(gsk3787，gw9662和t0070907)和bml-260处理3天，3天后，拍摄gfp荧光图片，并收细胞提蛋白，进行蛋白免疫印迹(westernblot)，检测ucp1的表达水平有无变化。

实验结果如图10-12所示。图10显示，bml-260不影响jnk、p38、erk和atf2的磷酸化水平(即不会激活它们)，但能显著性提高creb和stat3的磷酸化水平，说明bml-260能激活stat3和creb信号通路，而ucp1的上调至少一定程度上与这两个信号通路相关。图11显示，5-delta-前列腺素-j2(这个是ppar受体激动剂和fxr激动剂)处理细胞得到的基因特征与bml-260有着高度相似性，得分97.63。图12显示，ppars的抑制剂减弱了bml-260对褐色脂肪细胞ucp1的上调作用，说明bml-260对ucp1的上调作用一定程度上通过ppar信号通路。

实施例2、体内验证

1)bml-260激活小鼠皮下白色脂肪ucp1表达，增加产热

实验步骤：八周龄c57bl/6j雄鼠(斯莱克)皮下脂肪原位注射bml-260，溶剂为阴性对照，cl-316243(cl)为阳性对照。注射3天后，称取小鼠体重，取小鼠皮下脂肪并称重，提取蛋白做蛋白免疫印迹实验检测ucp1的表达。并且将小鼠皮下脂肪石蜡包埋，做苏木精-伊红染色(he-staining)或ucp1蛋白的免疫组织化学，观察脂肪组织形态和ucp1原位表达情况。原位注射后，还要做冷刺激实验，检测小鼠对持续性低温的耐受能力。

实验结果如图13-15所示。图13显示，与cl处理类似，bml-260原位注射能显著性增加皮下白色脂肪中ucp1的表达。然而，由于蛋白免疫印迹所取组织块有随机性，而bml-260水溶性极差，故原位注射导致药物浓度分布不均，所以有明显的个体差异。图14显示，bml-260注射组小鼠在冷刺激中有着较高的直肠温度(左图)，同时皮下白色脂肪组织(iwat)的重量有明显下降(右图)。图15显示，从苏木精伊红染色(上排)可以看出，bml-260注射组的iwat有明显的褐化表型，具有更小的脂滴；并且有显著性增强的ucp1表达(下排)。

2)bml-260对皮下白色脂肪组织的褐化作用，一定程度上是通过激活creb、stat3来实现的

实验步骤：八周龄c57bl/6j雄鼠(斯莱克)皮下脂肪原位注射bml-260，溶剂为阴性对照，cl-316243(cl)为阳性对照。注射3天后，取小鼠皮下脂肪组织，提取蛋白，做蛋白免疫印迹，检测stat3和creb磷酸化水平。

实验结果如图16所示。图16显示，bml-260注射组的p-stat3和p-creb蛋白信号与对照组相比有显著性提高，说明bml-260能直接或间接激活stat3和creb信号通路，是下游激活ucp1的部分原因。

3)bml-260上调产热和肌肉编码基因的表达

实验步骤：八周龄c57bl/6j雄鼠(斯莱克)皮下脂肪原位注射bml-260，溶剂为阴性对照。注射3天后，取皮下脂肪组织提取rna，进行rna测序(美吉生物医药科技有限责任公司)与分析。

实验结果如图17所示。图17显示，go富集分析中(左图)，bml-260注射组的皮下白色脂肪组织中显著性上调的基因富集在肌细胞分化，肌结构发育，肌系统过程调控等生理过程中，这与白色脂肪组织中ucp1+的细胞有平滑肌类特征一致。并且，热图显示(右图)bml-260注射组也有许多产热基因显著性上调。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>罗丹宁衍生物在治疗代谢性疾病中的应用

<130>18a389

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>720

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggac60

ggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctac120

ggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccacc180

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ttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctg360

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gaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccac600

tacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtc660

ctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagatt720

<210>2

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