干眼症治疗用滴眼剂的制作方法

本发明涉及干眼症治疗用滴眼剂。

背景技术：

干眼症是由各种因素引起的泪液和角结膜上皮的慢性疾病，且是伴随有眼睛的不适感、视功能异常的疾病。干眼症是在欧美和日本10～20％的成年人罹患的主要眼疾病，随着显示器屏幕的使用时间增加、由空调设备造成的空气干燥、隐形眼镜的使用等，患者数量有增加倾向。

干眼症是由如下情况引起的：泪腺中的泪液的分泌量减少；因泪液中的脂质、黏蛋白的异常而促进水分量的蒸发，导致泪液的量减少。由于泪液的减少，会产生角膜表面和结膜表面的慢性刺激、炎症，从而导致患者的生活品质下降。一直以来，为了抑制炎症并治疗干眼症而使用甾体试剂，但对于安全性来说不能说是充分的，也存在产生副作用的倾向。作为代替甾体试剂来抑制炎症的药剂，已知有双氯芬酸、溴芬酸等非甾体类抗炎症药(nsaid)。专利文献1公开了包含双氯芬酸作为有效成分的抗炎症滴眼剂。

作为干眼症的治疗方法，已知有基于炎症抑制作用的治疗方法，但作为干眼症的病因，除了炎症以外，还怀疑与年龄增加、激素的变化、环境因素、自身免疫等相关，需要基于除了抗炎症以外的作用机理的干眼症治疗方法。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开昭58-174310号公报

技术实现要素：

发明要解决的问题

本发明的课题在于，提供一种用于抑制由泪液的高渗透压导致的细胞凋亡的干眼症治疗用滴眼剂。

用于解决问题的方案

本发明涉及一种干眼症治疗用滴眼剂，其包含双氯芬酸或其药学上可接受的盐，且用于抑制由泪液的高渗透压导致的细胞凋亡。

优选的是，以0.01～0.7重量/容量％的浓度包含双氯芬酸或其药学上可接受的盐。

优选的是，双氯芬酸的药学上可接受的盐为双氯芬酸钠。

优选的是，还包含聚山梨酯80、硼砂或聚乙烯吡咯烷酮。

发明的效果

本发明的干眼症治疗用滴眼剂通过包含双氯芬酸或其药学上可接受的盐，可以抑制由泪液的高渗透压导致的细胞凋亡，从而有效地治疗干眼症。

附图说明

图1a为示出实施例1和比较例1的结果的图。

图1b为示出实施例1和比较例1的结果的图。

图2a为示出实施例2和比较例2的结果的图。

图2b为示出实施例2和比较例2的结果的图。

图3a为示出实施例3和比较例3的结果的图。

图3b为示出实施例3和比较例3的结果的图。

图3c为示出实施例3和比较例3的结果的图。

图4a为示出实施例4和比较例4的结果的图。

图4b为示出实施例4和比较例4的结果的图。

图4c为示出实施例4和比较例4的结果的图。

图5a为示出实施例5和比较例5的结果的图。

图5b为示出实施例5和比较例5的结果的图。

图5c为示出实施例5和比较例5的结果的图。

图5d为示出实施例5和比较例5的结果的图。

图5e为示出实施例5和比较例5的结果的图。

图6为示出实施例6和比较例6的结果的图。

图7为示出实施例7和比较例7的结果的图。

图8为示出实施例8和比较例8的结果的图。

图9为示出实施例9和比较例9的结果的图。

图10为示出实施例10和比较例10的结果的图。

具体实施方式

本发明涉及一种干眼症治疗用滴眼剂，其包含双氯芬酸或其药学上可接受的盐，且用于抑制由泪液的高渗透压导致的细胞凋亡。

双氯芬酸或其药学上可接受的盐在滴眼剂中的浓度优选为0.01～0.7重量/容量％、更优选为0.05～0.5重量/容量％。在低于0.01重量/容量％时，存在治疗效果变差的倾向。在超过0.7重量/容量％时，存在难以制备组合物的倾向。

作为双氯芬酸的药学上可接受的盐，可举出：双氯芬酸钠、双氯芬酸钾。

滴眼剂的ph优选为6.0～8.5、更优选为7.0～8.0。在ph低于6.0时，存在眼刺激无法得到缓解的倾向，在ph超过8.5时，会变得偏离生理的ph。

滴眼剂的渗透压比优选为0.9～1.4。需要说明的是，此处的渗透压比是指与生理盐水相比较时的渗透压比。

本发明的滴眼剂除了双氯芬酸或其药学上可接受的盐，还可以含有缓冲剂、等渗剂、防腐剂、增稠剂、增溶剂、清洗剂。

作为缓冲剂，可举出：磷酸与磷酸盐的组合、硼酸与硼砂的组合、有机酸与有机酸盐的组合等。其中，优选硼酸与硼砂的组合。滴眼剂中的缓冲剂的含量优选为0.01～10重量/容量％、更优选为0.1～3重量/容量％。在低于0.01重量/容量％时，存在难以充分取得本发明的效果的倾向。在超过10重量/容量％时，存在产生眼刺激的倾向。

作为等渗剂，可举出：葡萄糖等糖类、丙二醇、甘油、氯化钠、氯化钾、甘露醇、山梨糖醇、木糖醇等糖醇等。其中，优选氯化钠、氯化钾。滴眼剂中的等渗剂含量优选为0.01～10重量/容量％、更优选为0.1～3重量/容量％。

作为防腐剂，可举出：苯扎氯铵、苄索氯铵和葡萄糖酸氯己定(chlorhexidinegluconate)等转化皂(invertsoap)类；对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯等对羟基苯甲酸酯类；氯丁醇、苯乙醇和苄醇等醇类。其中，优选氯丁醇。滴眼剂中的防腐剂含量优选为0.001～0.5重量/容量％。

作为增稠剂，可举出：聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、羟丙基纤维素等。其中，优选聚乙烯吡咯烷酮。

作为增溶剂，可举出：聚山梨酯80(聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯、商品名tween80)、聚氧乙烯羟基硬脂酸三甘油酯(polyoxyethyleneoxystearicacidtriglyceride)、聚乙二醇、α或β-环糊精等。其中，优选聚山梨酯80。

为了缓解眼刺激可以含有钙盐或镁盐。作为这种盐，例如可举出：泛酸钙、氯化钙、丙酸钙、乙酸钙、乳酸钙、葡萄糖酸钙等钙盐、或相应的镁盐。其中，优选泛酸钙、氯化钙、氯化镁。

对于本发明的滴眼剂，为了增强抑制由高渗透压导致的细胞凋亡的效果，在前述组合使用成分中，优选包含聚山梨酯80、硼砂或聚乙烯吡咯烷酮。

为了增强抑制由高渗透压导致的细胞凋亡的效果，滴眼剂中的聚山梨酯80的浓度优选为0.1～5.0重量/容量％、更优选为0.3～3.0重量/容量％。

为了增强抑制由高渗透压导致的细胞凋亡的效果，滴眼剂中的硼砂的浓度优选为0.1～20.0重量/容量％、更优选为0.3～15.0重量/容量％。

为了增强抑制由高渗透压导致的细胞凋亡的效果，滴眼剂中的聚乙烯吡咯烷酮的浓度优选为1.0～15.0重量/容量％、更优选为2.0～10.0重量/容量％。

本发明的滴眼剂涉及在滴眼剂当中用于抑制由泪液的高渗透压导致的细胞凋亡的干眼症治疗用滴眼剂。通常，对于干眼症来说，泪液减少，泪液的渗透压上升。随着该渗透压上升，水分从细胞内排出，从而暴露于细胞缩小这样的渗透压应力。与此相对，将外部的钠离子等摄取到细胞内，细胞内的离子强度上升，细胞会产生细胞凋亡。作为产生细胞凋亡的眼组织，可举出：角膜、结膜、泪腺。更具体而言，作为产生细胞凋亡的细胞，可举出：角膜上皮细胞、结膜上皮细胞、泪腺细胞。

本发明的滴眼液中使用的双氯芬酸通过促进nfat5(nuclearfactorofactivatedt-cells5；活化t细胞核因子5)基因的表达和核内移动，即使在泪液的高渗透压条件下也能够抑制细胞凋亡。nfat5基因产物能够将bgt-1(betaine/gabatransporter-1；甜菜碱/gaba转运蛋白-1)基因等活化。其结果如下：对于渗透压应力，细胞能够通过不会影响离子强度的有机性渗透压调节物质向细胞内的摄取来对应。由于能够避免细胞内的离子强度上升，因此可认为：即使在泪液的高渗透压条件下也能够抑制细胞凋亡。本发明的滴眼剂起到抑制由泪液的高渗透压导致的角膜、结膜、泪腺中的细胞凋亡的效果。更具体而言，起到抑制角膜上皮细胞、结膜上皮细胞、泪腺细胞的细胞凋亡的效果。

使用本发明的滴眼剂时，每次对单眼的滴眼量优选为1～3滴、更优选为1～2滴。此外，以容量表示每次对单眼的滴眼量时，优选为10～300μl、更优选为20～200μl、进一步优选为30～100μl。本发明的滴眼剂的给药间隔优选为1天1～6次、更优选为1天1～3次。

实施例

实施例中，对本发明进行具体说明，但本发明并不仅限制于这些。

(实施例1)高渗透压条件下的细胞障碍的抑制效果

将hce细胞(人角膜上皮细胞)在含有双氯芬酸的高渗透压培养基中进行培养。对于培养基，通过150mm的nacl、280mm的葡萄糖或280mm的山梨糖醇而形成高渗透压条件。利用mtt法测定活细胞的数量，算出相对于对照(等渗压条件)的吸光度的相对值。将结果示于图1a和图1b。数值为平均±s.d.(n＝3)、*p<0.05；**p<0.01。

(比较例1)

使用其他的非甾体性抗炎症药(nsaid)代替双氯芬酸，除此之外，进行与实施例1相同的操作。将结果示于图1a。

确认到：非甾体性抗炎症药(nsaid)当中，特别是双氯芬酸在高渗透压条件下的细胞障碍的抑制效果高。

(实施例2)高渗透压条件下的细胞凋亡抑制和细胞增殖效果

将hce细胞在含有双氯芬酸和150mm的nacl的高渗透压培养基中进行培养。使用荧光肽基质测定6小时培养后的半胱天冬酶3样活性活性，将结果示于图2a。此外，在12小时培养后，通过brdu掺入试验研究细胞增殖，将其结果以相对于对照(等渗压条件)的吸光度的相对值的形式记载。将结果示于图2b。数值为平均±s.d.(n＝3)、*p<0.05；**p<0.01。

(比较例2)

使用溴芬酸代替双氯芬酸，除此之外，进行与实施例2相同的操作。将结果示于图2a～图2b。

确认到：双氯芬酸抑制高渗透压条件下的细胞凋亡，还起到细胞增殖效果。

(实施例3)对cox-阻碍的非依赖性

将hce细胞在含有双氯芬酸、150mm的nacl和/或pge2的高渗透压培养基中进行24小时培养。利用mtt法测定活细胞的数量，以相对于对照(等渗压条件)的吸光度的相对值的形式记载。将结果示于图3a和图3c。

此外，将hce细胞在含有双氯芬酸的培养基中进行30分钟前培养，进而在含有10μm的花生四烯酸和双氯芬酸的培养基中进行30分钟培养。需要说明的是，花生四烯酸是用于诱导pge2而添加的物质。通过eia测定培养液中所含的pge2的量。将结果示于图3b。数值为平均±s.d.(n＝3)、*p<0.05；**p<0.01。

(比较例3)

使用溴芬酸代替双氯芬酸，除此之外，进行与实施例3相同的操作。将结果示于图3a～图3c。

图3a中，即使添加pge2，活细胞数量也未发生变化。图3b和图3c中，为了减少pge2而需要的双氯芬酸的浓度为0.1nm，而图3c中，为了减少由高渗透压引起的细胞障碍而需要的浓度为100nm。一般来说，已知炎症是通过环氧合酶(cox)增强前列腺素e2(pge2)的生产而产生的，因此，由图3a～图c的结果确认到：双氯芬酸的效果是基于与阻碍cox而减少pge2的表达量的作用分别独立的作用而实现的。

(实施例4)nfat5的表达提高和核内移行促进效果

将hce细胞在含有双氯芬酸和150mm的nacl的高渗透压培养基中进行6小时(图4a和图4c)或1小时(图4b)培养。使用相对于nfat5、肌动蛋白或核纤层蛋白b的抗体，通过免疫印迹法对全细胞粉碎液(图4a和图4b)或核抽提液(图4b)进行分析。测定nfat5的带的强度，以对于对照(不含有双氯芬酸的等渗压条件)的相对值的形式记载(图4a和图4b)。通过实时rt-pcr测定bgt1mrna的相对表达量，并将通过肌动蛋白的表达量进行标准化而得到的数值以相对于对照(不含双氯芬酸的等渗压条件)的相对值的形式记载(图4c)。数值为平均±s.d.(n＝3)、*p<0.05；**p<0.01。

(比较例4)

使用溴芬酸代替双氯芬酸，除此之外，进行与实施例4相同的操作。将结果示于图4a～图4c。

确认到：双氯芬酸通过nfat5的表达提高和核内移行促进的作用，在高渗透压条件下抑制了细胞凋亡。

(实施例5)大鼠的角膜表面障碍治疗效果

去除大鼠的泪腺，制作干眼症模型。在去除泪腺的1～5周后，1天3次给予含有双氯芬酸(0.1％、3.1mm)的眼药(5μl)。通过棉线试验测定泪液量，将结果示于图5a。将用荧光素染色而成的角膜的图像示于图5b。算出荧光素的得分，并示于图5c。在去除泪腺的5周后制作眼组织的切片，进行tunel试验和dapi染色，将结果示于图5d(比例尺为50μm)。将tunel阳性细胞数量示于图5e。数值为平均±s.e.m.、*p<0.01，n.s.是指不显著(notsignificant)。

(比较例5)

使用溴芬酸代替双氯芬酸，除此之外，进行与实施例5相同的操作。将结果示于图5a～图5e。

确认到：双氯芬酸起到治疗干眼症模型的角膜表面障碍的效果。

(实施例6)双氯芬酸与聚山梨酯80的组合使用

将hce细胞在含有0μg/ml、1μg/ml或10μg/ml的聚山梨酯80的培养基中进行24小时前培养。进而，在含有1μm的双氯芬酸、150mm的nacl和与前培养相同浓度的聚山梨酯80的高渗透压培养基中进行24小时培养。利用mtt法测定活细胞的数量，并将结果示于图6。

(比较例6)

未使用双氯芬酸，除此之外，进行与实施例6相同的操作，将结果示于图6。

确认到：通过组合使用聚山梨酯80能够提高双氯芬酸的效果。

(实施例7)双氯芬酸与硼砂的组合使用

将hce细胞在含有0μg/ml、4μg/ml或40μg/ml的硼砂的培养基中进行24小时前培养。进而，在含有1μm的双氯芬酸、150mm的nacl和与前培养相同浓度的硼砂的高渗透压培养基中进行24小时培养。利用mtt法测定活细胞的数量，将结果示于图7。

(比较例7)

未使用双氯芬酸，除此之外，进行与实施例7相同的操作，将结果示于图7。

确认到：通过组合使用硼砂能够提高双氯芬酸的效果。

(实施例8)双氯芬酸与聚乙烯吡咯烷酮的组合使用

将hce细胞在含有0μg/ml、10μg/ml或100μg/ml的聚乙烯吡咯烷酮的培养基中进行24小时前培养。进而，在含有1μm的双氯芬酸、150mm的nacl和与前培养相同浓度的聚乙烯吡咯烷酮的高渗透压培养基中进行24小时培养。利用mtt法测定活细胞的数量，将结果示于图8。

(比较例8)

未使用双氯芬酸，除此之外，进行与实施例8相同的操作，将结果示于图8。

确认到：通过组合使用聚乙烯吡咯烷酮能够提高双氯芬酸的效果。

(实施例9)由组合使用硼砂、硼酸、氯丁醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚山梨酯80而得到的滴眼药(以下，称为组合使用滴眼液)产生的效果

将hce细胞在含有1μg/ml的组合使用滴眼药的培养基中进行24小时前培养。进而，在含有3μm的组合使用滴眼药、150mm的nacl的高渗透压培养基中进行24小时培养。利用mtt法测定活细胞的数量。此外，使用双氯芬酸代替组合使用滴眼药进行相同操作。将结果示于图9。需要说明的是，组合使用滴眼液为配方例3的组成的滴眼药。

(比较例9)

未使用双氯芬酸或组合使用滴眼药(ctrl)、或使用了缓冲液(溶剂对照(vehicle))，除此之外，进行与实施例9相同的操作，将结果示于图9。

确认到：通过组合使用硼砂、硼酸、氯丁醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚山梨酯80能够提高双氯芬酸的效果。

(实施例10)

去除大鼠的泪腺，制作干眼症模型。在去除泪腺的1周后，以1天3次给予含有双氯芬酸(0.05％、1.55mm或0.1％、3.1mm)的眼药(5μl)。给药4周后用荧光素将泪液染色并算出其得分。将结果示于图10。

(比较例10)

使用缓冲液(溶剂对照)代替双氯芬酸，除此之外，进行与实施例10相同的操作，将结果示于图10。

确认到：通过0.05％的双氯芬酸能够治疗干眼症模型的角膜表面障碍。

(配方例1)

将100mg的双氯芬酸钠、573mg的硼砂、868mg的硼酸、290mg的氯化钠、和100mg的β-环糊精溶解于约80ml的蒸馏水中，向其中添加150mg的乳酸钙并使其溶解，用蒸馏水稀释定量为100ml，进行除菌过滤而得到滴眼剂。

(配方例2)

将100mg的双氯芬酸钠、200mg的nah2po4(无水)、710mg的na2hpo4(无水)、300mg的氯化钠和1000mg的β-环糊精溶解于约80ml的蒸馏水中，向其中添加150mg的泛酸钙并使其溶解，用蒸馏水稀释定量为100ml，进行除菌过滤而得到滴眼剂。

(配方例3)

将100mg的双氯芬酸钠、450mg的硼砂、1500mg的硼酸、500mg的氯丁醇、3000mg的聚乙烯吡咯烷酮k25和500mg的聚山梨酯80(tween80)在灭菌纯化水中溶解并将总量设为100ml，从而得到滴眼剂。